全 文 ：王　伟 ,曾光明 ,黄国和 ,等.鼠李糖脂对铜绿假单胞菌在堆肥颗粒介质中吸附与传输影响的初步研究 [ J] .环境科学学报 , 2005 , 25(7):965-970
WANG Wei , ZENG Guangming , HUANG Guohe , et al.An elementary study on effect s of biosurfactant rhamnolipid on bacterial sorption and transport in compost
granule medium [ J] .Acta Scientiae Circumstantiae , 2005, 25(7):965-970
鼠李糖脂对铜绿假单胞菌在堆肥颗粒介质中吸附与
传输影响的初步研究
王　伟 ,曾光明＊ ,黄国和 ,钟　华 ,傅海燕
湖南大学环境科学与工程系 , 长沙　410082
收稿日期:2004-09-06　　　修回日期:2005-03-10　　　录用日期:2005-03-20
摘要:以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)AB93066及其发酵生产的鼠李糖脂(rhamnolipid)为研究对象 ,通过柱淋洗实验考察了不同浓度鼠
李糖脂对堆肥颗粒中单一菌属铜绿假单胞菌吸附传输情况的影响.实验结果显示 ,一定浓度(100～ 400mg·L -1)的鼠李糖脂能够有效地减弱细
菌在堆肥颗粒介质中的吸附作用 ,增强细菌在介质中的传输和分散 ,使细菌得以传输到样品柱的更深层.这将有利于深层堆肥有机物的生物降
解.原因可能是鼠李糖脂的存在改变了菌体和堆肥颗粒的表面性质 ,并且使菌体和颗粒之间产生位阻效应 ,减弱了它们之间的亲合性.
关键词:鼠李糖脂;堆肥颗粒介质;菌体传输;柱淋洗实验
文章编号:0253-2468(2005)07-0965-06　　中图分类号:X705　　文献标识码:A
An elementary study on effects of biosurfactant rhamnolipid on bacterial sorption
and transport in compost granule medium
WANG Wei , ZENG Guangming＊ , HUANG Guohe , ZHONG Hua , FU Haiyan
Department of Environmental Science and Engineering , Hunan University , Changsha 410082
Received 6 September 2004;　 received in revised form 10 March 2005;　accepted 20 March 2005
Abstract:A column experiment was preformed to study the effect of rhamnolipid excreted by a Pseudomonas aeruginosa strain on the bacterial transport of
Pseudomonas aeruginosa in compost granule medium.Experimental results indicated that rhamnolipid with certain concentrations(100～ 400 mg·L-1)could impede
bacterial sorption to compost granules and enhance the bacterial transport in compost medium.In this condition , bacteria could be transported to the deeper layers of
sample columns , which was propitious to the biodegradation of organic matter in deep layers.It was suggested that the reasons might be that the function of
rhamnolipid changed the surface characteristics of the bacteria and compost granules , and produced steric effect , which reduced the affinity between the bacteria and
compost granules.
Keywords:rhamnolipid;compost granule medium;bacterial transport;column experiment
基金项目:国家高技术资助项目(No.2004AA649370);国家杰出青年科学基金(No.50225926 , 50425927);高等学校博士学科点专项科研基金(No.
20020532017)资助项目;2000年教育部高等学校优秀青年教师教学科研奖励计划资助项目
作者简介:王　伟(1980—),男 ,硕士研究生;＊通讯作者(责任作者), E-mail:zgming@hnu.cn
Foundation item:The National High_Tech Research and Development Program of China(863)(No.2004AA649370);The NaturalS cience Foundation of China for
Distinguished Young Scholars(No.50225926, No.50425927);The Doctoral Foundation of Ministry of Education of China(No.20020532017);The Teaching and
Research Award Program for Outstanding Youth Teachers in Higher Education Institutions of MOE , P.R.C.(TRAPOYT)in 2000
Biography:WANG Wei(1980—), male , master candidate;＊Corresponding author , E-mail:zgming@hnu.cn
　　大多数生物表面活性剂是微生物的次级代谢产
物.它本身具有既亲水又亲油的两亲性分子结构 ,因
而具有分散 、增溶 、润湿 、渗透等特性.与合成表面活
性剂相比 ,生物表面活性剂具有更好的生物可降解
性 、生物可适应性以及环境友好性等特性.基于这些
特性和优点 ,生物表面活性剂已经在越来越多的领
域得到广泛的研究和应用[ 1 , 2] .
堆肥过程是利用微生物促进可生物降解有机物
向稳定的腐殖质生化转化的过程 ,微生物在堆肥过
程中起着至关重要的作用[ 3 ～ 5] .在堆肥过程中 ,为了
提高堆肥效率往往要添加菌种 ,但添加菌种容易被
浅层堆肥介质吸附而不能传输到介质的深层 ,阻碍
第 25 卷第 7期
2005 年7 月
环　境　科　学　学　报
Acta Scientiae Circumstantiae
Vol.25 , No.7
Jul., 2005
DOI :10.13671/j.hjkxxb.2005.07.019
了深层中有机物的生物降解.因此 ,微生物在堆肥介
质中的吸附 、传输和分散对整个堆肥过程尤为重要 ,
找到一种促进微生物向堆肥介质深层传输的有效方
法是很有意义的.鼠李糖脂作为一种高效的生物表
面活性剂 ,它的性质和功用已经得到了较深入的研
究[ 6 ～ 9] .特别是在土壤修复中 ,研究者们考察了鼠李
糖脂对土壤中有机污染物的增溶 、解吸附作
用[ 10 ～ 13] .有文献报道 ,一定浓度的阴离子生物表面
活性剂鼠李糖脂能够改变土壤表面的电荷负荷度 ,
减弱微生物在土壤颗粒上的吸附 ,增强微生物在土
壤介质中的传输[ 14] .鼠李糖脂对堆肥中微生物的相
关效应在国内外都未见报道.铜绿假单胞菌对有机
物具有很好的降解性能而且能够产生生物表面活性
剂鼠李糖脂[ 15] ,将其作为外源菌种添加于堆肥过程
中颇有意义.因此 ,本实验选择鼠李糖脂为研究对
象 ,考察了它对单一菌种铜绿假单胞菌在堆肥颗粒
介质中的吸附和传输性能的影响.
1　材料与方法
1.1　堆肥样品
　　堆肥样品取自湖南省长沙市岳麓区垃圾站.将
取回的城市生活垃圾破碎磨细 ,堆置 15 d使其均质
化 ,再将样品干燥过筛 ,选择粒径为 0.097 ～ 0.125
mm的样品备用.样品的基本物理性质[ 16] 见表 1.
表 1　堆肥颗粒样品的物理性质参数
Table 1　The physical parameters of compost granules
堆密度
(g·mL-1)
真密度
(g·mL-1) 孔隙率
挥发性有
机质含量
浸出液
pH
0.999 2.356 57.6% 14.6% 6.43
1.2　表面活性剂溶液及菌液
　　实验所用的鼠李糖脂由中国典型培养物保藏中
心提供的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
AB93066发酵生产 ,1 L液体培养基的无机盐溶液的
主要成分为:2.0 g NaNO3 , 1.5 g KH2PO4 , 1.5 g
Na2HPO4 ·12H2O , 0.1 g MgSO4 · 7H2O , 0.01 g
FeSO4·7H2O ,碳源为 20 g·L-1的葡萄糖 , pH =6.8.
通过摇瓶发酵制取鼠李糖脂发酵液 ,然后用酸沉降
法提取鼠李糖脂[ 10] .
由于制取鼠李糖脂的纯物质较困难 ,本文用鼠
李糖当量(rhamnose equivalents)浓度代表鼠李糖脂提
纯物的浓度[ 17] .用苯酚硫酸法绘制鼠李糖脂和鼠李
糖浓度相对于吸光度的标准曲线 ,得到鼠李糖脂浓
度(ρRL)和鼠李糖浓度(ρR)的倍比关系为 ρRL =
2.5ρR ,根据此倍比关系配制相对于鼠李糖的不同浓
度的鼠李糖脂溶液(0 、25 、50 、100 、400 、800 mg·L-1).
本实验还选用了两种典型的化学表面活性剂阴离子
表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)和非离子表面活
性剂曲拉通(TritonX-100),二者的浓度分别为 2 330
mg·L-1和 800 mg·L-1 ,实验考察了它们与生物表面
活性剂作用效果的异同.铜绿假单胞菌液用稀释平
板法结合标准曲线法制得.
1.3　菌体吸附实验
　　准确称量 0.5 g 堆肥样品 8份分别装于 8根干
净的试管中 ,将样品于 121℃下灭菌 20min ,冷却后
在每根试管中加入含有不同浓度表面活性剂的铜绿
假单胞菌溶液(菌体浓度为 4×106 个·mL-1).将试
管振荡 30min后静置 2 h ,用稀释平板法测定上清液
中的菌体浓度 ,再由式(1)算出堆肥颗粒介质对不同
浓度表面活性剂菌液中菌体的吸附系数 α(sticking
coefficient).另外 ,每个样品都进行平行实验.吸附系
数 α定义为发生成功吸附的碰撞次数占总碰撞次
数的分数[ 18] ,这里用菌体浓度表示为:
α=1-CE C I (1)
式中 , CE 为浸出液中菌体浓度;CI 为起始加入菌体
浓度 。
1.4　柱淋洗实验
　　实验装置由支架 、淋洗柱 、布液装置 、硅胶管 、多
通 、抽滤瓶和真空泵组合而成.装置图见图 1.实验
所用柱子是容积为 2.5mL 的标准医用注射器 ,并在
注射器底部垫 1mm厚的滤纸作为过滤层.准确称取
2.5 g堆肥样品 8份装入 8支注射器中 ,用活塞将样
品压实至 2.5 mL 刻度处.样品柱于 121℃下灭菌 20
min.实验所用铜绿假单胞菌液浓度为 4 ×106
个·mL-1.淋洗时先后用 3倍孔隙体积(4.32 mL)的
不含菌的各表面活性剂溶液 、3倍孔隙体积含菌的
各表面活性剂溶液淋洗和 3倍孔隙体积不含菌的各
表面活性剂溶液淋洗.淋洗速度控制在 10-3
m·s-1[ 19] .
淋洗完毕后用活塞将柱子中堆肥样品柱推出 ,
切成 0.5 cm3的小段.将各小段样品分别置于大试管
中 ,加入 10 mL 无菌水剧烈振荡 15 min ,再静置 30
min.用稀释平板法测定悬液中的菌体数.用乙酸乙
酯萃取样品中鼠李糖脂 ,待萃取相中乙酸乙酯挥发
后用苯酚硫酸法测定其中鼠李糖脂的量 ,得到各段
样品中鼠李糖脂的吸附量.每个样品均进行平行
实验.
966 环　　境　　科　　学　　学　　报 25卷
图 1　实验装置图
(1.支架;2.医用注射器;3.布液装置;4.多通;
5.抽滤瓶;6.真空泵)
Fig.1　A schematic diagram of the experimental system
2　结果
2.1　菌体在堆肥颗粒介质中的吸附性能
　　在堆肥过程中 ,普通条件下添加的菌种容易吸
附到堆肥表层颗粒上 ,难以传输到堆肥深层 ,从而影
响到深层有机物的降解.本实验在堆肥颗粒介质中
添加了表面活性剂 ,考察了在不同浓度 、不同种类的
表面活性剂存在的条件下 ,铜绿假单胞菌在堆肥颗
粒介质中吸附性能的变化.不同浓度的鼠李糖脂溶
液以及 SDS 、TritonX_100 溶液作用下菌体在堆肥颗
粒表面的吸附系数变化情况如图 2 所示(图中 RL
代表鼠李糖脂).由图 2可以看出 ,在鼠李糖脂作用
下菌体的吸附系数 α有所下降 ,并且鼠李糖脂浓度
越高 ,吸附系数下降的幅度越大.当鼠李糖脂浓度增
至800mg·L-1时 ,吸附系数下降到了 0.417 ,相对于
空白样中菌体的吸附系数 0.754降低了 45%.化学
表面活性剂 SDS 、TritonX-100 对吸附系数的影响不
　　
图 2　添加不同浓度鼠李糖脂和 SDS、TritonX-100的菌液中菌体
在堆肥颗粒中的吸附系数(α)
(图中 RL0 ～ RL800 分别代表鼠李糖脂浓度为 0 ～ 800
mg·L -1)
Fig.2　Sticking coefficients of bacteria in compost granules(α)
大 ,表明它们的微生物效应不明显.
2.2　鼠李糖脂在介质颗粒中的吸附性能
　　在淋洗过程中 ,堆肥颗粒介质对表面活性剂有
吸附作用 ,吸附作用的强弱将直接影响到表面活性
剂的作用效果.因此 ,考察鼠李糖脂在样品柱中的吸
附情况很有必要.图 3显示的是用不同浓度的鼠李
糖脂淋洗液淋洗后样品柱各段中吸附的鼠李糖脂的
量随堆体深度变化的趋势.横坐标是样品段的深度
值;纵坐标表示将不同深度段的样品混合于 10 mL
无菌水中所得上清液中鼠李糖脂的浓度值 ,间接反
映了各堆肥样品段中鼠李糖脂的吸附量.从图 3中
可以看出 ,随着堆体深度的增加 ,鼠李糖脂吸附量降
低 ,即存在吸附滞留现象 ,且淋洗液中鼠李糖脂浓度
越高 ,其滞留效应越明显.
图 3　不同鼠李糖脂浓度淋洗液淋洗后各深度段堆肥颗粒介质中鼠李糖脂浓度的变化趋势
Fig.3　Changes of the rhamnolipid concentrations in the compost medium of different layers after rinsed by rhamnolipid solutions with
diff erent concentrations
9677 期 王　伟等:鼠李糖脂对铜绿假单胞菌在堆肥颗粒介质中吸附与传输影响的初步研究
2.3　表面活性剂对菌体传输的影响
　　图4反映的是在不同浓度的表面活性剂淋洗液
淋洗过程中 ,铜绿假单胞菌在堆肥样品柱中的传输
分布情况.从图中可以看出 ,随着淋洗液向深层传
输 ,样品柱各段中吸附的菌体量呈降低趋势.空白样
中菌体量的下降幅度较大 ,在样品柱的 2.0 cm 深处
基本无菌体存在.随着淋洗液中鼠李糖脂浓度的增
大 ,菌体的传输性能得到明显的加强.当鼠李糖脂浓
度达到 100 ～ 400 mg·L-1时 ,菌体的传输效果最好 ,
能够传输到 3.2 cm 以下的深度段.当鼠李糖脂浓度
增大到 800mg·L-1时 ,鼠李糖脂对菌体传输的增强
作用又有所减弱.对于添加了 SDS和 TritonX-100的
菌体淋洗液 ,菌体不能传输到样品柱的深层 ,可见 ,
这两种化学表面活性剂对菌体传输影响不大.
图 4　用不同表面活性剂浓度的淋洗液淋洗后各深度段堆肥颗粒
介质中菌体数的变化趋势
Fig.4　Changes of bacterial amounts in the compost medium of different
layers after rinsed by different surfactant solutions
3　讨论
　　堆肥系统比较复杂 ,堆肥介质中菌体的吸附 、传
输和分散往往受诸多因素的影响 ,其中堆肥颗粒和
菌体与生物表面活性剂溶液间的界面张力 、菌体和
堆肥颗粒的表面性质等都是主要的影响因素.
菌体吸附性能实验结果显示 ,鼠李糖脂的存在
能够减小铜绿假单胞菌在堆肥颗粒中的吸附系数 ,
而且吸附系数随着淋洗液中鼠李糖脂浓度的增大逐
渐减小.这说明鼠李糖脂的存在能够改变菌体和堆
肥颗粒的表面性质 ,从而影响菌体的吸附性能[ 19] .
SDS 和TritonX-100两种化学表面活性剂的加入未能
减小菌体的吸附系数 ,反而使其有所增大 ,其原因可
能是实验所用堆肥样品成分过于复杂 ,某种成分的
存在影响了这两种表面活性剂的作用效果.
从淋洗实验结果可以看出 ,在一定浓度(100 ～
400 mg·L-1)鼠李糖脂存在的条件下 ,铜绿假单胞菌
在堆肥颗粒介质中传输和分散有所增强 ,菌体能够
传输到介质柱的更深的深度段.分析其原因 ,可以认
为 ,鼠李糖脂对菌体传输的增强作用的机理有以下
几方面:
1)菌体和介质表面性质的变化　表面活性剂 、
菌体 、介质颗粒的空间排列不同导致菌体和介质表
面性质的变化[ 19] .鼠李糖脂具有亲水性基团和疏水
性基团同时存在的两亲性结构 ,两种基团的指向性
决定了菌体表面的亲水亲油特性.在本实验中 ,可能
是鼠李糖脂的非极性端(疏水基团)锚定到铜绿假单
胞菌的表面 ,而其极性端(亲水基团)暴露在颗粒介
质环境中 ,这样就大大增强了菌体表面的亲水特性 ,
同时也就减弱了菌体在颗粒介质表面上的吸附.
Manne 等人[ 20] 建立了一个离子表面活性剂在石墨 —
水两相界面上的吸附模型.在该模型中 ,当表面活性
剂浓度接近临界胶束浓度时 ,表面活性剂分子垂直
伸展于基质面上 ,其亲水基指向水相界面.这个模型
可以解释鼠李糖脂对菌体表面疏水性的影响.另外 ,
鼠李糖脂具有脂肪酸型和甲酯型两种存在形式 ,而
且两种形式往往同时存在.脂肪酸型鼠李糖脂的疏
水基含有羰基基团 ,它携带一个负电荷 ,因此 ,鼠李
糖脂表现出来的电性为负.当鼠李糖脂吸附到菌体
和堆肥介质表面时 ,使细菌和堆肥介质表面电性均
为负 ,这样两表面之间必定产生静电斥力[ 14] .静电
斥力的存在会阻碍细菌与介质表面的接触 ,减弱细
菌在颗粒介质上的吸附作用 ,使细菌在介质间隙中
更好地分散和传输.
2)微环境热力学变化　根据 Derjaguin-Landau-
Verwey-Overbeek(DLVO)理论[ 21] ,当颗粒接近一种带
相同电荷的颗粒表面时 ,颗粒之间相互作用的势能
受范德华力和静电斥力综合作用的影响.当粒子之
间的距离很小时 ,总作用能趋向于负的无穷大.在这
个距离里 ,粒子将不能分散 ,此时微生物会吸附到介
质颗粒表面.当粒子之间的距离较大时 ,总作用能为
正值 ,静电排斥力占优势 ,在这个区间里粒子更容易
分散 ,颗粒对微生物吸附性减弱[ 14] .由式(2)[ 22] 可以
算出 ,鼠李糖脂分子末端的长度为 1.2 nm ,这个长度
足以使吸附在颗粒表面的鼠李糖脂分子产生位阻效
应[ 14] ,即鼠李糖脂吸附到颗粒表面形成了一层涂
层 ,类似于在墙面上涂上一层油漆 ,隔离了铜绿假单
胞菌与堆肥颗粒表面的近距离接触 ,使菌体与颗粒
间的静电斥力占优势 , 有利于菌体在介质间隙的传
968 环　　境　　科　　学　　学　　报 25卷
输分散.
L =0.15+0.126 n (2)
式中 ,L 表示分子末端长度 , n 表示碳原子数.
实验结果显示 , 当鼠李糖脂浓度较高(800
mg·L-1)时 ,铜绿假单胞菌在堆肥介质中的传输性
能有所增强但不明显.根据图 3 ,高浓度的鼠李糖脂
在堆肥颗粒中吸附性很强 ,大部分鼠李糖脂在浅层
段就被吸附滞留.随着高浓度鼠李糖脂菌液的继续
淋洗 ,被吸附的鼠李糖脂可能在颗粒表面形成双分
子层吸附胶团[ 23] ,改变了单层结构时形成的亲水取
向性 ,因此 ,菌体反而不能传输到介质深层.由图 2
可以看出 ,两种化学表面活性剂 SDS 和 TritonX-100
对菌体的吸附性并没有减弱作用.因此 ,二者对菌体
的传输分散没有增强作用.
　　本实验通过添加鼠李糖脂考察了其对堆肥颗粒
中单一菌属铜绿假单胞菌吸附与传输的影响 ,得到
了较好的趋势性结果 ,这对指导堆肥工艺很有意义 ,
同时也为深入地研究堆肥系统中多因素条件下鼠李
糖脂对细菌传输的影响作了铺垫.
4　结论
　　1)鼠李糖脂的存在能够减弱铜绿假单胞菌在堆
肥颗粒介质中的吸附作用 , 随着浓度(0 ～ 800
mg·L-1)的增大 , 堆肥颗粒对菌体的吸附系数从
0.754降到了 0.417 ,降幅达到 45%.而两种化学表
面活性剂 SDS 和 Triton X-100的存在对铜绿假单胞
菌的吸附性能的影响不明显.
2)一定浓度的鼠李糖脂(100 ～ 400 mg·L-1)能
够促进铜绿假单胞菌在堆肥颗粒介质中的传输 ,能
够使菌体传输到堆肥颗粒介质的更深层 ,这样的结
果有利于堆肥深层中有机物的生物降解 ,从而提高
堆肥效率 ,这对整个堆肥过程是很有意义的;低浓度
(小于 50mg·L-1)和高浓度(大于 800 mg·L-1)的鼠
李糖脂对铜绿假单胞菌在堆肥介质中的传输性能的
作用效果不明显.化学表面活性剂 SDS 和 TritonX-
100对堆肥颗粒介质中菌体的传输影响不大.
通讯作者简介:曾光明(1962—), 男 , 博士 , 教授 , 博士生导
师.国家教育部长江学者奖励计划特聘教授 、国家杰出青年
科学基金获得者.主要研究方向:环境系统分析 、环境生物及
控制 、固体废物处理与资源化等.
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1.本刊自 25 卷 8期起采用“著者-出版年”制标注引文及著录参考文献表.根据 GB 7714-87(《文后参考文献著录规则》)的
规定 ,参考文献表中引文必须是已公开发表的文献.未公开发表的文献不能引用 , 只能用文内页下注的形式注明出处.已被录
用但尚未出版的论文亦不能引用.
2.在正文中 , 引文用括号内标注著者 、出版年份的形式标注 ,且不排引文序号 ,不能与“顺序编码制”混用(即以上角标的
形式 ,在方括号内标注引文序号).对于多个作者 , 仅列第一作者后加“等”即可.如有多于 1 条的引文 ,则各引文项之间用分号
分隔.
3.参考文献表中各著录条目应内容规范 、齐全.具体要求为:
a)著者项中 3 人以内必须全部列出 , 3 人以上亦必须全部列出前 3 位著者后再加“等” 、“ et al” , 不能仅列 1 人后即加
“等” 、“ et al”.作者姓名之间用逗号分隔.作者姓名无论中文和外文 ,其书写格式一律为“姓前名后”.对于外文 , 名可
缩写 , 但须以空格代替缩写点.除翻译以外 ,一般不著录文献责任者的具体责任 ,如“主编” 、“编”等.
b)题名项中题名前用句点引导 , 题名后加方括号标注文献类型 ,如[ J] 、[ M] 等.
c)期刊刊名用句点引导 ,不必用斜体 , 字体亦不必加粗 , 缩写点用空格代替.期刊出版年份 、卷号用逗号引导;期号接
卷号用圆括号括起;页码用冒号引导 , 页码范围用半字线表示 ,不同页码段间用分号分隔;对于期刊无卷号时可在
年份标示后紧接着标示期号 ,如“1999(8)”表示 1999年第 8 期 ,而“1999 , 8”则表示 1998年第 8 卷(无期号);引文条目
最后不加任何标点.
d)如引用了同一作者在同一年度的多篇文献 , 则可在出版年后加字母 a、b 、c、d等区别.
4.为便于国际交流 , 本刊要求分别著录英文参考文献表和中文参考文献表.其中 , 中文参考文献表仅著录原始文种为中
文的文献;英文参考文献表除著录原始文种为英文的文献外 ,还应将原始文种为中文的文献条目译成英文(对于期刊或文集 ,
英译以原文献的英文摘要为准).
5.各文献条目按著者姓名的字母顺序(对于英文)或著者汉语拼音的字母顺序(对于中文)排列 ,著录的具体格式为:
期刊:作者.出版年.题名[ J] .刊名 ,卷号(期号):起止页码
专著:作者.出版年.题名[M] .书名 ,出版地:出版者.起止页码
文集:作者.出版年.题名[ A] 编者.文集名[ C] , 出版地:出版者.页码
报告:作者.出版年.题名[ R] .报告编号.所在地:机构名称.起止页码
专利:专利申请者.出版年.专利题名[ P] .专利国别 , 专利文献种类 ,专利号.出版日期(用标准日期书写格式)
标准:起草责任者.出版年.标准代号 标准名称[ S] .出版地:出版者
会议论文:作者.出版年.文题[ C] .会议名称 ,会址:起止页码
学位论文:作者.出版年.论文题目[ D] .保存地:保存单位.起止页码
磁盘文献:作者.出版年.题名:其它题名信息[ DK](引用日期).出版地:出版者(更新日期)
光盘文献:作者.出版年.题名:其它题名信息[ CD] (引用日期).出版地:出版者(更新日期)
联机文档:作者.出版年.题名 [ OL] .出版地(如果有的话):出版者(如果有的话), 用标准格式书写的引用日期 , 网页
地址(以 http: www 开头)
尚未定义类型的文献:主要责任者.出版年.题名[ Z] .出版地:出版者.起止页码
以上提到的 “引用日期”不是指参考文献表著录者的引文日期 , 而是指相关文献(通常是二次文献)转引原始文献(即
一次文献)时的日期.该日期一般在二次文献中指明.
970 环　　境　　科　　学　　学　　报 25卷