全 文 ：2009年
第 29卷
　8月
第 8期　　　　　　　　　　　
河　　南　　中　　医
HENANTRADITIONALCHINESEMEDICINE　　　　　　　　　　　
August　2009
Vol.29　No.8
红藤对小鼠的免疫抑制效应
王红梅 ,马素好
(郑州澍青医学高等专科学校 ,河南 郑州　450064)
摘要:目的:探讨红藤对小鼠免疫功能的影响。方法:以红藤水煎剂(25mg/100ml)给小鼠(18 ～ 22g)连续灌胃 7d后 ,做碳廓清实验 、抗体生
成细胞的检测 、淋巴细胞 a-醋酸萘脂酶的检测 、脾淋巴细胞转化实验以及迟发型变态反应(DTH)。结果:与对照组相比 , 红藤水煎剂能明显
抑制小鼠单核 -巨噬细胞的吞噬活性 ,降低小鼠机体抗体生成细胞分泌抗体 IgM量 ,抑制小鼠外周血中的T淋巴细胞数目 ,降低脾淋巴细胞的
转化率 ,减少 DNCB致敏的小鼠两耳的重量差。经统计学处理 ,各实验组与对照组相比 ,各项指标均有极显著差异 , P﹤ 0.01。结论:红藤对小
鼠细胞免疫功能及体液免疫功能均有明显抑郁作用 ,为今后中药免疫抑制剂的开发提供了科学的依据。
关键词:红藤;免疫抑制;单核 -巨噬细胞;淋巴细胞;IgM;小鼠
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1003-5028(2009)08-0756-03
　　红藤(Sargentodoxacuneate)是大血藤科植物 ,被称为 “大
血藤” ,有的地方称为 “红藤”或 “鸡血藤 ”。古代医书对其性
状做了以下描述:“红藤苦平 , 清肺解毒 , 肠痈乳痈 , 疗效迅
速 [ 1] ”。从传统中医药对于红藤的药性描述 , 结合现代免疫
学知识 , 认为红藤是作为免疫调节药起作用的。它被机体吸
收后作用于免疫系统 , 进而抑制机体病理性的免疫反应 , 如
免疫亢进 , 免疫排斥等 , 缓解消除炎症部位的病理变化 [ 2] 。
但是 , 红藤对于机体免疫系统的具体作用尚不十分清楚。因
此 , 本文通过免疫学实验来探讨红藤对小鼠免疫功能的影
响 , 为中药免疫抑制剂的开发应用提供一定的参考依据。
1　实验材料
1.1　实验药物及试剂　红藤水煎剂 、副品红 、亚硝酸钠 、α-
醋酸萘酯 、甲基绿 、豚鼠血清(由北京鼎国生物技术有限公司
提供)、SRBC(由新乡医学院提供)、印度墨汁 、苏木精 、伊
红 、ConA(Sigma公司提供)、Lps(宝信生物科技有限公司
提供)、DNCB(2, 4-二硝基氯苯)。
1.2　实验动物　昆明种 SPF级小鼠(由河南师范大学实验
动物中心提供), 8周龄 ,体重 18 ～ 22 g, 共 150只 , 雌雄对半 ,
随机均分为五大组 , 每大组又分为两小组 , 一小组小鼠每只
每天灌蒸馏水 0.5ml作为对照组 ,另一小组小鼠每只每天灌
收稿日期:2009-02-15
基金项目:河南省科技攻关项目(编号:0524420040)
作者简介:王红梅(1980-),女 ,河南洛阳人 ,硕士学位,助教。
红藤水煎剂 0.5 ml作为实验组 , 共灌胃 1周 , 且所有小鼠均
自由饮水取食 。
1.3　实验器材　200目不锈钢筛网 、752型分光光度计 、血
球计数板 、计数器 、一次性采血管 、96孔细胞培养板 、打孔器。
2　实验方法
2.1　小白鼠碳廓清实验 [ 3] 　第一组小鼠于末次灌胃 1 h
后 , 称小鼠体重 ,然后由小鼠尾静脉注射墨汁 ,并分别于注射
后 2 min, 10min,从眼眶后静脉丛取血 20 μl, 加入事先盛有
2 ml0.1%碳酸钠溶液的试管中 , 摇匀 , 待测。用 752型分光
光度计在 600 nm处测光密度值﹙ OD值﹚ , 用 2 ml0.1%的
碳酸钠做对照 。脱颈椎法处死小鼠 ,取肝脏和脾脏 , 用滤纸
吸干其表面血液后称重。按以下公式计未校正的吞噬指数 k
和校正过的吞噬指数 α。
k=log(OD
1
/OD
2
)/(t
1
-t
2
)
α=体重∕(肝重 +脾重)×k1/3
2.2　定量溶血分光光度测定 [ 3]　第二组小鼠在灌胃开始后
的第 2天给每只小鼠腹腔注射 0.2ml20%的 SRBC悬液。在
开始灌胃后第 7天 , 即免疫后第 5天 , 将小鼠摘眼球放血 ,脱
颈椎处死 , 消毒腹壁 ,摘取脾脏置已盛有 3 ml冷 PBS的小平
皿中 , 去除表面脂肪 ,冲洗干净 , 并用注射针头在脾脏上扎些
小孔 , 然后用盖玻片轻轻顺刮脾脏数次 , 用吸管吹打均匀。
把刮取的脾细胞悬液用 200目冷 PBS打湿的不锈钢筛网过
滤到离心管中 。取滤液 , 2 000 rpm离心 5 min, 弃上清 , 沉淀
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DOI :10.16367/j.issn.1003-5028.2009.08.054
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用 1 ml冷的 PBS悬浮 , 显微计数。将脾细胞用 PBS调整到
1×106 /ml。取脾细胞悬液 1 ml于离心管中(对照用冷的
PBS代替), 依次加入 1 ml0.4%的 SRBC悬液 , 1 ml已稀释
的补体 , 混匀后置 37℃水浴中温育 1 h。取出后以 3 000 rpm
离心 5 min, 用分光光度计取 413 nm波长以对照管做空白调
零 , 测定各管上清液中红细胞裂解释放的血红蛋白量(以 OD
值表示)。比较实验组和对照组的结果。
2.3　淋巴细胞 a-醋酸萘脂酶的检测 [ 4]　第三组剪尾取小
鼠的新鲜血液 1滴至洁净载玻片一端 , 推成厚薄适当的血
片 , 冷风迅速吹干 ,然后将血涂片置福尔马林 -丙酮固定液
中 , 4℃固定 1 min。取出血涂片用自来水冲洗 3 min, 再用双
蒸水将载玻片上剩余的自来水冲掉 , 用冷风迅速吹干。用非
灌药组小鼠的血涂片做对照。将经过固定冲洗并干燥后的
血涂片放入孵育液中 , 37℃孵育 1.5 h。取出血涂片立即在
自来水中冲洗 3 min, 再用双蒸水冲洗 , 以除去血片上的沉淀
物。然后用甲基绿染色液将血涂片复染 40 min,再用自来水
和双蒸水先后冲洗晾干 ,油镜观察 , 计数 100个淋巴细胞 ,求
出 ANAE(a-醋酸萘脂酶)阳性细胞百分数。比较对照组和
实验组是否有差别。
ANAE阳性细胞百分数 =ANAE阳性细胞数 /淋巴细胞
总数 ×100%
2.4　脾淋巴细胞转化 [ 4]　第四组灌胃后的小鼠脱颈椎处死 ,
无菌取脾脏制成脾细胞悬液 , 200目滤网过滤 , 1 500r/min离
心 10 min弃上清液 , 加红细胞裂解液 , 37℃水浴 10 min,
1 500 r/min离心 10 min弃上清 ,加适量 PBS混匀 , 每管均分
为 A、B、C类 , 1 500 r/min离心 10 min弃上清液 , 在 A类中加
RPMI-1640的培养基 、在 B类中加含 ConA的 RPMI-1640
的培养基 , 在 C类中加含 Lps的 RPMI-1640的培养基 , 调细
胞浓度 为 1 ×106 个 /ml。 将样 加在 96 孔培 养板上 ,
0.1 ml/孔 ,一式三复孔 , 5%CO
2
, 37℃培养箱培养 2 d。培养
结束前 4 h每孔加入 MTT10 μl, 培养结束后 , 3 000 r/min离
心 20min弃上清液 , 每孔加入 10%的 DMSO 100 μl震荡
15 min。用酶标仪在 490 nm处测 OD值 , 计算增殖率。
增殖率 =(实验组吸光值 -对照组吸光值)/对照组吸光
值 ×100%
2.5　迟发型变态反应 [ 6]　第五组小鼠于第 1天灌胃后涂以
1%的 DNCB丙酮混合液 80 μl于右耳 , 末次灌胃后再次涂抹
右耳 40μl1%的 DNCB丙酮混合液 , 5 h后处死 ,用打孔器打
下左右耳朵相同大小的两片称重量 ,记下同一小鼠左右耳重
量之差。然后比较实验组和对照组小鼠的左右耳重量差。
2.6　统计学方法　实验所得原始数据用 Excel软件处理 ,处
理所得数据均采用单因素方差分析法进行统计学分析 , 两组
间比较采用 t检验法。
3　实验结果
见表 1。
表 1　红藤水煎剂对小鼠体液 、细胞免疫功能的影响( x±s)
组别 n 碳廓清实验 定量溶血分光光度测定 淋巴细胞 a-醋酸萘脂酶的检测 T淋巴细胞转化率 B淋巴细胞转化率 双耳重量差
对照组 15 5.100±0.5599　 0.305±0.0102　 0.405±0.0373　 0.3930±0.0127 0.2131 ±0.0109 0.0501 ±0.0084
实验组 15 4.268± 0.1671＊ 0.277±0.0066＊ 0.363±0.0591＊ 0.3008±0.0090 0.1540 ±0.0099 0.0127 ±0.0083
　　注:与对照组比较 , ＊P﹤ 0.01。
3.1　对小鼠单核 -巨噬细胞吞噬功能的影响　从表 1可以
看出 , 实验组小鼠的单核 -巨噬细胞吞噬碳粒的功能明显低
于对照组 , 两者相比较 ,其差异达到极显著水平 , P﹤ 0.01。
3.2　对抗体生成细胞分泌抗体 IgM含量的影响　从表 1可
以看出 , 实验组小鼠抗体生成细胞分泌的抗体 IgM量明显低
于对照组 , 两者相比较 ,其差异达到极显著水平 , P﹤ 0.01。
3.3　对小鼠外周血中 T淋巴细胞数目的影响　从表 1可以
看出实验组小鼠外周血中 T淋巴细胞数目明显少于对照组 ,
两者相比较 , 其差异达到极显著水平 , P﹤ 0.01。
3.4　对脾淋巴细胞转化的影响　从表 1可以看出 , 实验组
小鼠由 ConA刺激引起的 T淋巴细胞转化率明显低于对照
组 , 且二者相比较 ,其差异达到极显著水平 , P﹤ 0.01;实验
组小鼠由 Lps刺激引起的 T淋巴细胞转化率也明显低于对
照组 , 且二者相比较 ,其差异也达到极显著水平 , P﹤ 0.01。
3.5　对小鼠双耳重量差的影响　从表 1可以看出 , 实验组
小鼠双耳的重量差明显小于对照组 , 两者相比较 , 其差异达
到极显著水平 , P﹤ 0.01。
4　讨论
机体的免疫功能通常是由 T淋巴细胞介导的细胞免疫 ,
由 B淋巴细胞介导的体液免疫以及由单核—巨噬细胞参与
的非特异性免疫组成。本文用碳廓清实验 、定量溶血分光光
度测定 IgM含量实验 、淋巴细胞 a-醋酸萘脂酶的检测实验 、
脾淋巴细胞的转化以及耳朵肿胀实验等来测定红藤对小鼠
免疫功能的影响。
在碳廓清实验中的实验结果发现 , 实验组小鼠血液的
OD值比对照组相高 , 这说明血中所含墨汁量较多。 在小鼠
的免疫系统中 ,异物墨汁是其单核 -巨噬细胞吞噬的对象 ,
因此小鼠血液中墨汁量的多少完全能够反映出小鼠体内单
核 -吞噬细胞的活性。实验组小鼠其单核 -吞噬细胞活性
是降低的。该实验中所得的单核吞噬细胞吞噬指数也显示
出实验组小鼠的单核吞噬细胞活性下降。说明红藤确实对
小鼠的免疫功能产生了抑制作用。
淋巴细胞 a-醋酸萘脂酶的检测发现 , 实验组小鼠的 T
细胞在总淋巴细胞数目所占比例明显降低 , 说明红藤对小鼠
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的 T细胞生成有明显的抑制作用 ,而且实验结果对比得出二
者之间有显著差异(P<0.01)。同时在脾淋巴细胞转化实验
中 , 显示红藤水煎剂可显著抑制小鼠由 ConA和 LPS刺激所
导致的淋巴细胞的母细胞化 , 使其无法转化为效应细胞 , 分
泌细胞因子 , 发挥其效应。这些实验从一定程度上也说明红
藤对小鼠的细胞核体液免疫功能均有一定的抑制作用。
Ⅳ型超敏反应是抗原诱导的一种细胞性免疫应答。临
床常见的主要有感染性迟发型超敏反应和接触性迟发型超
敏反应 , 而 DNCB诱导的迟发型超敏反应属于接触性迟发型
超敏反应 , 通常是由于机体接触小分子半抗原如 DNCB等药
物引起 , 小分子的半抗原与皮肤中的胶原蛋白结合成完全抗
原 , 经郎格罕氏细胞摄取提呈给 T细胞 ,并刺激 T细胞活化 ,
增殖分化为效应性 T细胞。机体再次接触相应抗原可发生
接触性皮炎 , 导致局部皮肤出现红肿 、皮疹 、水疱 , 严重者可
出现剥落性皮炎。 本实验结果显示红藤水煎剂可显著减轻
DNCB致敏的小鼠的耳朵的炎症 ,正是因为它抑制了 T细胞
转化成效应性 T细胞所造成的。
前人研究发现 , 红藤对于单纯性阑尾炎和阑尾脓肿 , 类
风湿性关节炎 、急性盆腔炎均有很好的疗效 [ 7] 。肾小球肾
炎 、过敏性肾炎 、支气管哮喘 、类风湿性关节炎以及系统性红
斑狼疮 , 其机理主要是 IgM, IgG, IgA分泌量增加 , 激活补体 ,
吸引中性粒细胞并释放溶酶体酶 , 引起炎症反应 , 血小板凝
集 , 微血栓形成 , 导致局部缺血 , 淤血和出血。本实验中红藤
水煎剂能显著减少抗体 IgM的分泌量 , 促进炎症恢复。另
外 , 有报道红藤可抑制血小板凝集 , 并有促进血小板解聚的
作用 , 这些都与红藤能很好的治疗炎症的结果是一致的。过
敏性肾炎 , 同种异体排斥反应 , 某些自身性免疫病等。可由
T细胞引起 ,致敏的 T细胞再次与抗原物质相遇直接杀伤靶
细胞或产生各种淋巴因子 ,引起炎症反应。而通过本试验也
可看出 , 红藤水煎剂能显著减少 T细胞数量 , 抑制 T细胞转
化成效应性 T细胞以及减轻有 DNCB致敏的超敏反应 , 这些
也可能是红藤能减轻炎症反应的另一个主要原因。
综上所述 ,红藤不仅对小鼠的细胞免疫功能有明显的抑
制作用 , 而且对小鼠的体液免疫功能也有明显的抑制作用 ,
还显著降低了小鼠单核 -巨噬细胞的活性。从而为红藤作
为一种新的中药免疫抑制剂提供了科学的依据 ,同时也为它
在治疗类风湿性关节 , 过敏性肾炎 , 同种异体排斥反应和超
敏反应等疾病获得较好的治疗效果提供理论依据 , 红藤有效
成分的研究有待今后进一步探讨。
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(编辑:魏　群)
ImmunosuppressiveEfectofCaulisSargentodoxaeonMice
WangHongmei, MaSuhao
(ZhengzhouShuqingMedicalCollege, Zhengzhou, Henan, 450064)
Abstract:Objective:Toprobetheimmunosuppressiveefectofcaulissargentodoxaeonmice.Methods:Consistentgastricperfu-
sionofcaulissargentodoxae25 mg/100 mlweregiverntomice(18 ～ 22 g)for7daystodetectthecarbonclearance, antibody
producingcells, lymphocytea-naphtylacetateesterase, transformationofspleenlymphocyte, delayed-typehypersensitivity.
Results:Comparedwithcontrolgroup, caulissargentodoxaedecoctioninhibitedtheactivityofmononuclear-macrophage, and
decreasedtheantibody-secretedIgMcontentofantibodyproducingcells, inhibitedthenumberofperipheralbloodTlympho-
cyte, decreasedthetrasformationrateofspleenlymphocyte, decreasedtheweightdifferenceofDNCB-sensitizedmiceears.
Comparedwiththoseofcontrolgroup, allindexesofexperimentgroupshadsignificantlystatisticdifference(P<0.01).Conclu-
sion:Caulissargentodoxaehassignificantinhibitingefectsontheimmunofunctionofcelsandbodyfluids, whichprovidesasci-
entificbasisforthedevelopmentofChinesemedicinalimmunosuppressant.
KeyWords:caulissargentodoxae;immunosuppression;mononuclear-macrophage;lymphocyte;IgM;mice
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