全 文 ： 研究论文
Research Article
日本蛇根草查尔酮合酶基因的克隆及其生物信息学分析
孙威 1 刘杰 1 陈婷 1 汤晓辛 1 鞠志刚 2 乙引 1*
1 贵州师范大学, 生命科学学院, 植物生理与发育调控重点实验室, 贵阳, 550025; 2 贵阳中医学院, 药学院, 贵阳, 550025
*通讯作者, yiyin@gznu.edu.cn
摘 要 查尔酮合酶(CHS)是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶，其在类黄酮的合成过程中发挥着非
常重要的作用。本研究以日本蛇根草为研究材料，根据其转录组测序结果设计全长引物，通过 RT-PCR 方
法成功克隆得到日本蛇根草查尔酮合酶基因完整的 cDNA序列，并利用相关生物信息学软件对其进行分析。
结果表明，该基因序列全长为 1 170 bp，编码 389 个氨基酸，预测其蛋白分子量为 42.783KD，等电点为
6.05，是亲水性蛋白质，不含有信号肽，很可能定位在细胞质中。同时，二级结构分析显示，日本蛇根草
CHS 的二级结构分别由 180 个 α螺旋、84 个延伸链、125 个无规则卷曲组成，这与三维结构预测结果相一
致。日本蛇根草 CHS 基因的克隆对于研究植物类黄酮的生物合成及其分子机制具有重要意义，同时也丰富
了双子叶植物 PKS 基因家族的相关研究。
关键词 日本蛇根草, CHS, 基因克隆, 生物信息学分析
Cloning and Bioinformatics Analysis of CHS Genes in Ophiorrhiza
japonica
Sun Wei 1 Liu Jie 1 Chen Ting 1 Tang Xiaoxin 1 Ju Zhigang 2 Yi Yin 1*
1 Key Laboratory of Plant Physiology and Development Regulation, College of Life Science, Guizhou Normal University, Guiyang,
550025; 2 Medicine College, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang, 550025
*Corresponding author, yiyin@gznu.edu.cn
Abstract Chalcone synthase (CHS) is the first key enzyme in the flavoniod biosynthetic pathway, and it plays
an important role during flavoniod biosynthesis. In this study, we used Ophiorrhiza japonica as materials, and
designed the primers according to the result of its transcriptome sequencing. The integrated cDNA of CHS was
cloned successfully by RT-PCR method, and then was applied to bioinformatics analyses. These results showed
that the full-length CDS of CHS was 1 170 bp, and encoded the protein which consisted of 389 amino acids. The
putative protein molecular weight was 42.783KD and its isoelectric points were 6.05. CHS of Ophiorrhiza
japonica was a hydrophilic protein, had no signal peptide, and was likely to locate in the cytoplasm. Meanwhile,
analysis of secondary structure indicated that CHS of Ophiorrhiza japonica contained 180 alpha helixs, 84
网络出版时间：2016-09-20 17:20:34
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20160920.1720.008.html
 extended strands, 125 random coils, and this result was consistent with the prediction of its three dimensional
structure. Cloning of CHS from Ophiorrhiza japonica has an important significance for the research of flavoniod
biosynthesis and its molecular mechanism in plants, but also enriches the correlation of PKS gene family members
in dicotyledones plants.
Keywords Ophiorrhiza japonica, CHS, Gene cloning, Bioinformatics analysis
类黄酮化合物是一种非常重要的植物次生代谢产物，它除了可以赋予花、果实、叶片等组织颜色外，
还有很多重要的功能。它可以保护植物细胞免受紫外线的伤害，抵抗病原体与食草动物，作为信号分子促
进植物与微生物之间的相互作用，影响花粉的生长与发育、根瘤的产生，植物体内激素的转运等(Mol et al.,
1998; Winkel-Shirley, 2002; Buer et al., 2010; Ferreyra et al., 2012)。同时大量实验已经证明类黄酮与人体健康
之间也有密切的关系，它具有抗氧化、抗病毒、抗细胞增殖等生物活性，已经被用于治疗动脉硬化及心脑
血管等疾病(Lila, 2004; Teixeira et al., 2005; de Pascual-Teresa, 2014)。
查尔酮合酶(CHS)是类黄酮生物合成途径中的第一个关键酶，它催化 3 分子的丙二酰辅酶 A 与 1 分子
的香豆酰辅酶 A 形成柚皮素查尔酮，柚皮素查尔酮在后续酶的催化下最终形成类黄酮化合物(Deng et al.,
2014)。Reimold 等(1983)首次从欧洲芹的悬浮细胞中成功克隆得到第一个 CHS 基因，随后 CHS 基因越来
越多的从不同种植物中被成功克隆并进行了功能分析，如拟南芥、玉米、高粱、矮牵牛等(Koes et al., 1989;
Saslowsky and Winkel-Shirley, 2001)。研究显示，查尔酮合酶表达量的高低直接决定植物体内类黄酮化合物
的含量。同时研究者们也发现当植物中缺失 CHS 后，植物的表型和代谢都会发生改变。例如，1936 年，
人们首次得到了金鱼草 CHS 的突变体，该突变体由于缺失 CHS 活性使其花朵变为白色。随后对牵牛 CHS
突变体的研究显示，CHS 不仅可以影响它花色的呈现同时也影响牵牛花粉的发育(Kuckuck, 1936; Napoli et
al., 1999)。CHS 基因家族成员之间在氨基酸序列、结构和催化性质上都具有很高的保守性，因此该基因也
常被用于系统进化研究(Abe and Morita, 2010)。
日本蛇根草是茜草目茜草科蛇根草属，多年生草本植物，高 20~40 cm 或过之，全草可用药，有活血
散瘀，清肺祛痰的功效。目前关于日本蛇根草的研究主要集中在对其药用成分的分离和鉴定上，关于日本
蛇根草类黄酮代谢的研究仍处于空白阶段。本研究以日本蛇根草为材料，利用分子生物学方法克隆得到其
类黄酮合成的关键酶基因—CHS 基因，并对其进行了生物信息学分析。该项工作将为未来研究茜草目植物
CHS 基因功能、及类黄酮代谢的分子机制研究奠定基础，同时对改良茜草目植物的类黄酮代谢研究具有重
要指导意义。
1 结果与分析
1.1 CHS 基因的克隆及其编码蛋白质理化性质分析
 以日本蛇根草的 cDNA 为模板，利用全长引物 CHSF1，CHSR1 进行 PCR 扩增。扩增得到的片段包含
完整的 CDS 序列，长 1 170 bp，编码 389 个氨基酸(图 1)。随后，利用 ExPasy 软件对日本蛇根草查尔酮合
酶的氨基酸序列进行理化性质预测。结果显示，CHS 理论等电点为 6.05，分子量为 42.783 KD，CHS 基因
的蛋白质分子式为 C1909H3058N512O564S18，蛋白质的半衰期为 30 h，不稳定指数是 40.68，为不稳定蛋白。
CHS 有 49 个负电荷氨基酸残疾(Asp + Glu)，44 个正电荷氨基酸残疾(Arg + Lys)。其脂肪系数为 93.24，平
均疏水性为-0.094，表明该蛋白是一个亲水蛋白质。

图 1 日本蛇根草 CHS 基因的 cDNA 序列
Figure 1 Nucleotide acid sequence of Ophiorrhiza japonica CHS gene
1.2 日本蛇根草 CHS 基因编码蛋白质的同源比对及系统进化分析
将克隆得到的日本蛇根草的 CHS 与其它植物的 CHS 氨基酸序列进行同源比对后发现它们之间具有较
高的一致性。日本蛇根草 CHS 与它们的相似性分别为：茶花：92.03%、烟草：91.26%、荷花：90.49%、
矮牵牛：90.49%、葡萄：88.43%、德国鸢尾：87.4%、拟南芥：84.8%、水稻：83.29%、小麦：83.29%、
玉米：82.52%、荷兰鸢尾：79.95%、黄秋葵：68.89%。随后，利用 Clustal Omega 将不同植物来源的 CHS
氨基酸序列进行了多序列比对，然后采用 MEGA5 软件通过相连接法构建系统进化树，迭代值为 1 000。
 结果显示，日本蛇根草的 CHS 与茄科的矮牵牛和烟草聚为一类，亲缘关系最近，与莲科的荷花、杜鹃花
科的杜鹃、山茶科的茶花亲缘关系次之(图 2)。

图 2 不同植物 CHS 蛋白氨基酸的系统进化树分析
Figure 2 Phylogenetic tree analysis of CHS amino acid sequence in different plants
1.3 日本蛇根草 CHS 蛋白信号肽及跨膜域分析
信号肽是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，长度为5~30个氨基酸不等。它指导蛋白质
的跨膜转移，保证新合成的蛋白质能够准确进行定位运输。通过SignalP 4.1 Server在线软件对日本蛇根草
CHS所编码的蛋白质进行信号肽预测(表1)。当相应氨基酸残基的平均信号肽得分值大于0.5时，被认定存在
信号肽；小于0.5时则不存在信号肽。而日本蛇根草查尔酮合成酶基因所编码蛋白质的氨基酸残基平均信号
肽最大得分值为0.101，因此该蛋白不存在信号肽(图3)。
跨膜域是指蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，主要由疏水性氨基酸组成，是细胞膜内蛋白质与膜脂结
合的关键部位。本研究通过 TMHHM Server v2.0 在线软件对日本蛇根草 CHS 所编码的蛋白质进行跨膜区
域预测，结果显示该蛋白由内向外、由外向内均含有 3 个跨膜区域。



 表 1 日本蛇根草 CHS 蛋白信号肽预测
Table 1 Signal P-NN prediction for Ophiorrhiza japonica CHS protein
指标
Index
位点
Site
分值
Scores
max.C 30 0.110
max.Y 12 0.122
max.S 1 0.159
meanS 1-46 0.101
注: C-score: 原始剪切位点的分值; S-score: 信号肽的分值; Y-score: 综合剪切位点的分值
Note: C-score: Scores of Putative cleavage site; S-score: Scores of signal peptide; Y-score: Scores of Synthesis cleavage site

图 3 日本蛇根草 CHS 蛋白信号肽预测
Figure 3 Signal P-NN prediction for Ophiorrhiza japonica CHS
1.4 日本蛇根草 CHS 的亚细胞定位
利用 PSORT 在线软件对日本蛇根草的查尔酮合酶蛋白进行亚细胞定位分析，该蛋白分布在细胞质的
可能性最大，因为该蛋白定位在细胞质中的概率为 60.9%，同时在其氨基酸序列上发现一个细胞质定位信
号，而在其它部位定位的概率均低于细胞质，分别是细胞核中 21.7%，线粒体上 13%，液泡中 4.3% (表 2)。
因此，日本蛇根草的 CHS 蛋白定位在细胞质中的可能性最大。
1.5 日本蛇根草 CHS 疏水性及编码蛋白二级结构预测
根据日本蛇根草 CHS 的氨基酸序列，利用 ExPasy 软件在线预测其疏水曲线，该蛋白的最高值为 2.42，
在第 342 个氨基酸处，疏水性最强；最低值为-2.489，在第 119 个氨基酸处，亲水性最强(图 4)。同时，从
SignalP-4.1 prediction (信号肽-4.1 预测)
C-score（C 值）
S-score（S 值）
Y-score（Y 值）
Position (位点)
Score(分
值
) 
 整条肽链的氨基酸预测值来看，其中大部分为负值，没有明显的疏水区域。由此可以推断，日本蛇根草的
CHS 蛋白是一种亲水性蛋白。
表 2 日本蛇根草 CHS 的亚细胞定位
Table 2 Subcellular location of Ophiorrhiza japonica CHS protein
定位
Location
概率
Rates
细胞质
Cytoplasmic
60.9 %
细胞核
Nucleus
21.7 %
线粒体
Mitochondrial
13.0%
液泡
Vacuolar
4.30%

图 4 日本蛇根草 CHS 的氨基酸疏水性/亲水性预测
Figure 4 Predicted hydrophobicity of the Ophiorrhiza japonica CHS protein
利用在线(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_phd.pl)软件预测日本蛇根草的 CHS 蛋白的二级结构，
结果表明，日本蛇根草 CHS 蛋白二级结构由 α 螺旋、延伸链、无规则卷曲组成，不含有 β 转角。其中 α
螺旋占 46.27%，延伸链占 21.59%、无规则卷曲占 32.13% (图 5)。蛋白质的空间结构是决定其功能的一个
很重要的因素，其中 α螺旋主要是稳定蛋白质的骨架，而无规则卷曲的结构决定了蛋白质本身的功能(肖政
Position(位点)
50 100 150 200 250 300 350
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Score(分
值
)
 等, 2016)。

图 5 日本蛇根草 CHS 蛋白二级结构预测
注: 蓝色为 α螺旋; 红色为延伸链; 橘色为无规则卷曲
Figure 5 Secondary structure prediction of Ophiorrhiza japonica CHS protein
Note: The blue is alpha helix; The red is strand; The orange is random coil
1.6 日本蛇根草 CHS 功能结构域分析及其三级结构预测
将编码日本蛇根草 CHS 的基因序列输入到 NCBI Conserved Domain Search 进行相关蛋白功能域的分
析。结果显示，该蛋白具有 CHS 所共享的两个结构保守域：cd00831 (CHS-like, chalcone and stilbene synthases,
plant-specific polyketide synthases 聚酮合成酶)和 PLN03173(chalcone synthase 查尔酮合酶) (图 6)。同时具有
丙二酰辅酶 A 结合位点。进一步的分析显示，日本蛇根草 CHS 含有查尔酮合酶发挥作用所必需的多个活
性位点。

图 6 日本蛇根草 CHS 蛋白保守结构域
Figure 6 The conserved domain of Ophiorrhiza japonica CHS protein
为了更清楚的了解日本蛇根草 CHS 蛋白的高级结构，利用 SWISS-MODEL 工具，将该蛋白的氨基酸
序列进行三维结构的预测。预测的日本蛇根草 CHS 蛋白的三维结构主要以 α 螺旋为主，并占最大比重，
其次是无规则卷曲，延伸链占的比重最小，这与二级结构预测结果相一致(图 7)。
10 20 30 40 50 60 70
RF +1
Specific hits
Superfamilies
Multi-domains
active site
malony1-CoA binding site
dimer interface
product binding site
CHS_like
Cond_enzymes superfamily
PLNO317
 
图 7 日本蛇根草 CHS 蛋白空间构象模拟
Figure 7 The conformation simulation of Ophiorrhiza japonica CHS protein
2 讨论
本研究成功克隆得到日本蛇根草的 CHS 基因，并利用相关软件对其性质和功能进行了分析。结果显
示，该基因的开放阅读框为 1 170 bp，编码 389 个氨基酸，蛋白分子量为 42.783KD，等电点为 6.05，是一
种不稳定的很可能定位在细胞质中的亲水蛋白质。多序列比对分析表明，日本蛇根草的 CHS 无论在核酸
还是在蛋白水平与其它植物的 CHS 都具有很高的相似性。同时功能保守域分析显示，日本蛇根草的 CHS
具有查尔酮合酶所共享的两个结构保守域，这也进一步确认了本研究所克隆得到的基因为 CHS 基因。由同
源性比对结果可知，日本蛇根草的 CHS 与牵牛花和烟草的同源性达到了 90%以上，而与葡萄、鸢尾、拟
南芥的同源性也达到 80%以上，这与前人的研究结果相一致，即查尔酮合酶基因在进化上具有高度的保守
性。
日本蛇根草是茜草目茜草科草本植物，全草可药用，有清热解毒降压之功效，但是现阶段关于日本生
草类黄酮代谢的研究却是空白。目前在 NCBI 数据库中真核生物中共得到 15 858 条 CHS 核酸序列，其中
陆地植物为 10 114 条，双子叶植物 7 808 条，单子叶植物 1 522 条。虽然陆生植物中已经有 10 114 条 CHS
核酸序列，可是茜草目植物中 CHS 核酸序列的数目却是零。本研究首次从茜草目植物日本蛇根草中成功
克隆得到 CHS 基因，并对其进行了相关功能的预测，以上结果将为茜草目不同植物 CHS 基因的研究奠定
基础，同时为后续茜草目植物的类黄酮代谢研究提供科学的参考依据。
3 材料与方法
3.1 植物材料
本研究所使用的日本蛇根草取至贵州施秉地，取材后用锡箔纸包装标记后迅速冻于液氮中，然后保存
 在-80°冰箱中备用。
3.2 总 RNA 的提取与 cDNA 合成
利用 RNApure Plant Kit (康为世纪)试剂盒提取日本蛇根草的总 RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量
仪对提取的 RNA 进行质量检测。检测合格后，取 1 μg 总 RNA，使用 EasyScript One-Step gDNA Removal and
cDNA Synthesis SuperMix 试剂(全式金)盒进行逆转录合成 cDNA.。
3.3 引物设计及基因克隆
根据日本蛇根草转录组测序结果设计基因全长引物，以 CHSF1 (5TTT TCCGGCAGCTATGGT 3)和
CHSR1 (5GTGAGATTTATTCAAGCCTTGTTTA3)作为引物，日本蛇根草 cDNA 的第一链为模板，进行 CHS
基因编码区的扩增。PCR 反应程序为 94℃预变性 8 min，(94℃ 30 s, 52℃ 30 s, 72℃ 90s ) 35 个循环，72℃
后延伸 8 min，程序结束后将 PCR 产物进行跑胶验证。随后将符合预期大小的 PCR 产物进行胶回收，回收
产物连接到 pGEM-T easy 载体上，转化 JM109 感受态，挑克隆进行菌液 PCR 和酶切验证，将验证为阳性
的克隆送公司进行测序。
3.4 CHS 基因的生物信息学分析
通过 NCBI(National Center for Biotechnology Information)的 ORF 在线软件对日本蛇根草的 CHS 基因进
行开放阅读框的查找；利用 ExPASy-ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)在线预测 CHS 氨基酸
序列的理化性质；采用 Clustal Omega 数据库在线进行氨基酸的多序列比对；并利用 MEGA 5 构建系统进
化树；信号肽、跨膜域与亚细胞定位预测分别采用 Signal P 4.1、TMHHM Server v 2. 0 和 PSORT；
ExPASy(https://web.expasy.org/protscale)预测日本蛇根草 CHS 氨基酸亲疏水性；利用 NCBI 数据库对完成蛋
白 质 保 守 功 能 域 的 分 析 ； 蛋 白 质 二 级 、 三 级 结 构 的 预 测 分 别 利 用 在 线 软 件
(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_phd.pl)和 SWISS-MODEL 在线工具完成。
作者贡献
孙威、刘杰是本研究实验设计和实验研究的执行人；孙威、汤晓辛、陈婷完成数据分析及论文初稿写
作；乙引、孙威、鞠志刚是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作
者都阅读并同意最终文本。
致谢
本研究由贵州师范大学资助博士科研项目(0516006)，贵州省联合基金项目(黔科合LH字[2015]7777号)
和贵州省重点实验室建设项目(黔科合计 Z 字[2011]4005)共同资助。
参考文献
Abe I., and Morita H., 2010, Structure and function of the chalcone synthase superfamily of plant type III polyketide synthases,
Natural Product Reports, 27(6): 809-838
 Buer C.S., Imin N., and Djordjevic M.A., 2010, Flavonoids: new roles for old molecules, J. Intergr. Plant Biol., 52(1): 98-111
de Pascual-Teresa S., 2014, Molecular mechanisms involved in the cardiovascular and neuroprotective effects of anthocyanins,
Archives of Biochemistry and Biophysics, 559: 68-74
Deng X.B., Bashandy H., Ainasoja M., Kontturi J., Pietiäinen M., Laitinen R.A.E., Albert V.A., Valkonen J.P.T., Elomaa P., and Teeri
T.H., 2014, Functional diversification of duplicated chalcone synthase genes in anthocyanin biosynthesis of Gerbera hybrida,
New Phytologist, 201(4): 1469-1483
Ferreyra M.L.F., Rius S.P., and Casati P., 2012, Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications,
Front Plant Sci., 3: 1-15
Koes R.E., Spelt C.E., van den Elzen P.J.M., and Mol J.N.M., 1989, Cloning and molecular characterization of the chalcone synthase
multigene family of Petunia hybrida, Gene, 81(2): 245-257
Kuckuck H., 1936, Über vier neue serien multipler allele bei Antirrhinum majus, Mol. Gen. Genet., 71(1): 429-440
Lila M.A., 2004, Anthocyanins and human health: an in vitro investigative approach, Journal of Biomedicine and Biotechnology, (5):
306-313
Mol J., Grotewold E., and Koes R., 1998, How genes paint flowers and seeds, Trends in Plant Science, 3(6): 212-217
Napoli C.A., Fahy D., Wang H.-Y., and Taylor L.P., 1999, White anther: a petunia mutant that abolishes pollen flavonol accumulation,
induces male sterility, and is complemented by a chalcone synthase transgene, Plant Physiology, 120(2): 615-622
Reimold U., Kröger M., Kreuzaler F., and Hahlbrock K., 1983, Coding and 3 non-coding nucleotide sequence of chalcone synthase
mRNA and assignment of amino acid sequence of the enzyme, EMBO Journal, 2(10): 1801-1805
Saslowsky D., and Winkel-Shirley B., 2001, Localization of favonoid enzymes in Arabidopsis roots, The Plant Journal, 27(1): 37-48
Teixeira S., Siquet C., Alves C., Boal I., Marques M.P., Borges F., Lima J.L.F.C., and Reis S., 2005, Structure-property studies on the
antioxidant activity of flavonoids present in diet, Free Radical Bio. Med., 39(8): 1099-1108
Winkel-Shirley B., 2002, Biosynthesis of flavonoids and effects of stress, Curr. Opin. Plant Biol., 5(3): 218-223
Xiao Z., Li J.Y., Fan Z.Q., Li X.L., and Yin H.F., 2016, Cloning and expression analysis of GA2oxl Gene from Camellia lipoensis,
Linye Kexue Yanjiu (Forest Research), 29(1): 41-47 (肖政, 李纪元, 范正琪, 李辛雷, 殷恒福, 2016, 荔波连蕊茶 GA2oxl 基
因的克隆及表达分析, 林业科学研究, 29(1): 41-47)