全 文 ： 研究论文
Research Article
日本蛇根草查尔酮异构酶基因的克隆及其生物信息学分析
孙威 1 刘杰 1 陈婷 1 汤晓辛 1 鞠志刚 2 乙引 1*
1 贵州师范大学, 生命科学学院, 植物生理与发育调控重点实验室, 贵阳, 550025; 2 贵阳中医学院, 药学院, 贵阳, 550025
*通讯作者, yiyin@gznu.edu.cn
摘 要 查尔酮异构酶(CHI)是类黄酮生物合成过程中的关键酶之一，其在类黄酮的合成过程中发挥着非
常重要的作用。本研究以日本蛇根草为研究材料，根据其转录组测序结果设计全长引物，通过 RT-PCR 方
法成功克隆得到日本蛇根草查尔酮异构酶基因完整的 cDNA 序列，并对其进行生物信息学分析。结果表明，
该基因序列全长为 702 bp，编码 233 个氨基酸，预测其蛋白分子量为 25.018KD，等电点为 4.95，是亲水
性蛋白质，不含有信号肽，很可能定位在叶绿体基质中。同时，二级结构分析显示，日本蛇根草 CHI 的二
级结构分别由 96 个 α螺旋、51 个延伸链、86 个无规则卷曲组成，这与三维结构预测结果相一致。日本蛇
根草 CHI 基因的克隆对于研究植物类黄酮的生物合成及其分子机制具有重要意义，同时也丰富了双子叶植
物 CHI 基因家族的相关研究。
关键词 日本蛇根草, CHI, 基因克隆, 生物信息学分析
Cloning and Bioinformatics Analysis of CHI Genes in Ophiorrhiza
japonica
Sun Wei 1 Liu Jie 1 Chen Ting 1 Tang Xiaoxin 1 Ju Zhigang 2 Yi Yin 1*
1 Key Laboratory of Plant Physiology and Development Regulation, College of Life Science, Guizhou Normal University, Guiyang,
550025; 2 Medicine College, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang, 550025
*Corresponding author, yiyin@gznu.edu.cn
Abstract Chalcone Isomerase (CHI) is one of the first enzymes in the flavoniod biosynthetic pathway, and it
plays an important role during flavoniod biosynthesis. In this study, we used Ophiorrhiza japonica as materials,
and designed the primers according to the result of its transcriptome sequencing. The integrated cDNA of CHI
was cloned successfully by RT-PCR method, and then was applied to bioinformatics analyses. These results
showed that the full-length CDS of CHI was 702 bp, and encoded the protein which consisted of 233 amino acids.
The putative protein molecular weight was 25.018KD and its isoelectric points were 4.95. CHI of Ophiorrhiza
japonica was a hydrophilic protein, had no signal peptide, and was likely to locate in the chloroplast stroma.
Meanwhile, analysis of secondary structure indicated that CHI of Ophiorrhiza japonica contained 96 alpha helixs,
网络出版时间：2016-09-20 17:23:40
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20160920.1723.010.html
 51 extended strands, 86 random coils, and this result was consistent with the prediction of its three dimensional
structure. Cloning of CHI from Ophiorrhiza japonica has an important significance for the research of flavoniod
biosynthesis and its molecular mechanism in plants, but also enriches the correlation of CHI gene family members
in dicotyledones plants.
Keywords Ophiorrhiza japonica, CHI, Gene cloning, Bioinformatics analysis
类黄酮是由苯丙烷类化合物衍生出来的次生代谢产物，它普遍存在与植物体内，到目前为止，已发现
的类黄酮化合物约有 6 000 种，它们在植物的生长与发育过程中发挥着非常重要的作用(Mol et al., 1998;
Winkel-Shirley, 2002)。类黄酮除了给植物的花、果实、叶等组织赋予颜色外，还有很多其它重要的功能(Buer
et al., 2010; Ferreyra et al., 2012)。例如，类黄酮对于植物适应环境具有重要意义，因为它可以保护植物免受
紫外线的伤害，吸引昆虫传粉，调节植物激素的运输及对盐胁迫与干旱胁迫的抵抗能力。除此之外，类黄
酮还参与植物细胞形态发生、液泡起源等生理过程(Koes et al., 2005)。近些年，大量研究显示类黄酮与人
体健康之间具有很重要的关系，它具有抗氧化、抗衰老、抗细胞增殖等功能，因此已经大量出现在人们饮
食当中，同时被用于治疗动脉硬化、癌症和冠心病等疾病(Lila, 2004; Teixeira et al., 2005; de Pascual-Teresa,
2014)。
査尔酮异构酶是植物类黄酮生物合成途径中的第二个关键酶，是植物类黄酮生物合成过程中必需的关
键酶。它催化柚皮素查尔酮形成柚皮素，而柚皮素在其它关键酶的作用下最终形成类黄酮化合物。1987 年，
第一个 CHI 基因从法国豌豆中分离得到，随后，该基因陆续从玉米、草莓、苜蓿、矮牵牛等植物中被成功
克隆(Guo et al., 2015)。对查尔酮异构酶的研究显示，CHI 超家族包括四种类型蛋白，Ⅰ型是普遍存在于维
管植物中，主要负责类黄酮的生物合成；Ⅱ型是存在豆科植物中，参与异黄酮的生物合成；Ⅲ型是普遍存
在于陆生植物中的脂肪酸结合蛋白；Ⅳ型为功能未知的蛋白(Ralston et al., 2005; Morita et al., 2014)。目前关
于 CHI 的研究主要集中在Ⅰ型和Ⅱ型 CHI 上，Ⅲ型和Ⅳ型蛋白的研究较少。当苜蓿 CHI 的三维晶体结构
确定后，研究者们对Ⅰ型 CHI 有了更深入的认识。Ⅰ型 CHI 通常含有 5 个保守的活性位点氨基酸，在苜
蓿中这 5 个活性位点分别是 Arg 36、Thr48、Tyr106、Asn113、Thr190。CHI 基因以多基因家族形式存在，
并且研究表明该基因在不同植物中的同源性相对较低。李琳玲等(2008)的研究显示，同一物种中不同类型
的 CHI 基因也有较大差异，它们的 cDNA 序列的同源性一般为 42%~65%。不同植物 CHI 基因的同源性一
般为 49%~82%，而不用植物中同一种 CHI 的同源有时可高达 70%以上。在植物中査尔酮异构酶的酶学性
质和表达调控等的差异，都能引起类黄酮种类和含量发生变化(Kang et al., 2014)，因此该基因也常被用于
改良其它经济植物的类黄酮的种类与含量。
日本蛇根草是茜草目茜草科蛇根草属，多年生草本植物，叶纸质卵形或披针形，全草可用药，有活血
散瘀，祛痰，调经，止血的功效。目前对于日本蛇根草的研究主要集中在其药用价值，关于日本蛇根草类
 黄酮代谢的研究仍是空白。本研究以日本蛇根草为研究材料，利用分子生物学方法成功克隆得到其类黄酮
生物合成的关键酶基因-CHI 基因，并对其完成了生物信息学分析。该项工作将为研究茜草目植物 CHI 基
因的功能、及类黄酮代谢的分子机制研究奠定基础，同时对改良茜草目及其它经济植物类黄酮含量的研究
具有重要的指导意义。
1 结果与分析
1.1 CHI 基因的克隆及其编码蛋白质理化性质分析
以日本蛇根草的 cDNA 为模板，利用全长引物 CHIF1，CHIR1 进行 PCR 扩增。扩增得到的片段包含
完整的 CDS 序列，长 702 bp，编码 233 个氨基酸(图 1)。随后，利用 ExPasy 软件对日本蛇根草查尔酮异构
酶的氨基酸序列进行理化性质分析。结果表明，CHI 理论等电点为 4.95，分子量为 25.018KD，CHI 基因的
蛋白质分子式为 C1138H1782N280O344S4，蛋白质的半衰期为 30 h，不稳定指数是 38.72，为稳定蛋白。CHI 有
29 个负电荷氨基酸残疾(Asp + Glu)，22 个正电荷氨基酸残疾(Arg + Lys)。该蛋白的平均疏水性为 0.078，
脂肪系数为 92.06，表明日本蛇根草 CHI 是一个亲水蛋白质。

图 1 日本蛇根草 CHI 基因的 cDNA 序列
Figure 1 Nucleotide acid sequence of Ophiorrhiza japonica CHI gene
1.2 日本蛇根草 CHI 蛋白信号肽及跨膜域分析
信号肽是指导新和成的蛋白质进行跨膜转移，保证其能够进行准确定位的一段短肽链，它对蛋白质的
跨膜运输具有非常重要的作用。本研究通过Signal P 4.1 Server在线软件对日本蛇根草CHI所编码的蛋白质
进行信号肽预测分析，分析结果表明，原始剪切位点的得分值为0.127；综合剪切位点的得分值为0.112；
信号肽的得分值为0.120；平均信号肽最大得得分值为0.100 (表1)。分析数值中，当相应氨基酸残基的平均
信号肽得分值大于0.5时，则被认为存在信号肽；小于0.5时，为不存在信号肽。所以日本蛇根草CHI所编码
 的蛋白质不含有信号肽序列(图2)说明该蛋白很可能不是分泌蛋白，无法进行蛋白质转运，并且不定位在与
细胞外相通的细胞器上。
表 1 日本蛇根草 CHI 蛋白信号肽预测
Table 1 Signal P-NN prediction for Ophiorrhiza japonica CHI protein
指标
Index
位点
Site
分值
Scores
max.C 41 0.127
max.Y 41 0.112
max.S 13 0.120
meanS 1-40 0.100
注: C-score: 原始剪切位点的分值; S-score: 信号肽的分值; Y-score: 综合剪切位点的分值
Note: C-score: Scores of Putative cleavage site; S-score: Scores of signal peptide; Y-score: Scores of Synthesis cleavage site

图 2 日本蛇根草 CHI 蛋白信号肽预测
Figure 2 signal P-NN prediction for Ophiorrhiza japonica CHI
跨膜域主要由疏水性氨基酸组成，是指蛋白质序列中行驶跨膜功能的区域，是细胞膜内蛋白质与膜脂
结合的关键部位。本研究通过 TMHHM Server v2.0 在线软件对日本蛇根草 CHI 基因所编码的蛋白质进行
跨膜区域预测，预测结果显示该蛋白不具有跨膜区域。
1.3 日本蛇根草 CHI 的亚细胞定位分析
蛋白质在细胞中要处于特定的位置才能发挥其功能，并且蛋白质在细胞中的定位在一定程度上也反应
SignalP-4.1 prediction (信号肽-4.1 预测)
C-score(C 值)
S-score(S 值)
Y-score(Y 值)
Position (位点)
0 10 20 30 40 50 60 70
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
S
core（
分
值
）
 了编码该蛋白的基因的功能。根据 SubLoc v1.0 软件在线预测发现日本蛇根草的 CHI 蛋白极可能定位在细
胞质中。随后又通过 PSORT 在线软件对该蛋白进行亚细胞定位分析，该蛋白分布在叶绿体基质的可能性
最大，因为其定位在叶绿体基质中的概率为 85.7%，而在其它部位定位的概率均低于叶绿体基质，分别是
微体中 49.1%，叶绿体类囊体膜 48.7%，叶绿体类囊体基质 42.9% (表 2)。因此，日本蛇根草的 CHI 蛋白定
位在细胞质的叶绿体基质中的可能性最大。
表 2 日本蛇根草 CHI 的亚细胞定位
Table 2 Subcellular location of Ophiorrhiza japonica CHI protein
定位
Location
概率
Rates
叶绿体基质
Chloroplast stroma
85.7 %
微体
Microbody
49.1 %
叶绿体类囊体膜
Chloroplast thylakoid membrane
48.7%
叶绿体类囊体基质
Chloroplast thylakoid space
42.9%
1.4 日本蛇根草 CHI 疏水性及编码蛋白二级结构预测
利用 ExPasy 软件在线，对日本蛇根草 CHI 的氨基酸序列进行疏水曲线的预测，该蛋白在第 100 个氨
基酸处，具有最高值为 1.978，疏水性最强；在第 228 个氨基酸处，最低值为-2.20，亲水性最强(图 3)。同
时，从日本蛇根草 CHI 的氨基酸预测值来看，其中大部分为负值，没有明显的疏水区域。因此，日本蛇根
草的 CHI 蛋白是一种亲水性蛋白。
采用在线(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_phd.pl)软件对日本蛇根草的 CHI 蛋白的二级结构进
行预测分析，日本蛇根草 CHI 蛋白二级结构由 α 螺旋、延伸链、无规则卷曲组成，不含有 β 转角(表 3)。
其中 α螺旋占 41.2%，延伸链占 21.8%、无规则卷曲占 36.9%。其中 α螺旋所占比例最高无规则卷曲次之，
这可能与 α螺旋对蛋白质骨架的稳定发挥重要作用有关，而无规则卷曲的结构主要决定蛋白质本身的功能
(肖政等, 2016)。
1.5 日本蛇根草 CHI 功能结构域分析及其三级结构预测
将编码日本蛇根草 CHI 的基因序列输入到 NCBI CDD (Conserved Domain Search)中进行相关蛋白功能
保守域分析。分析结果表明，该蛋白属于 Chalcone 3 超家族成员，具有查尔酮异构酶所共有的两个保守域：
PLN02559 (chalcone--flavonone isomerase 查尔酮黄烷酮异构酶 ) 和 pfam02431 (chalcone--flavonone
isomerase 查尔酮黄烷酮异构酶)。这两个包结构分别分布在第 7~217 位及 14~215 位氨基酸之间。由此推
测，日本蛇根草 CHI 属于查尔酮异构酶家族(图 4)。
 
图 3 日本蛇根草 CHI 的氨基酸疏水性/亲水性的预测
Figure 3 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of the Ophiorrhiza japonica CHI protein
表 3 日本蛇根草 CHI 蛋白二级结构预测与分析
Table 3 The prediction and analysis of secondary structure of Ophiorrhiza japonica CHI protein
二级结构类型
Secondary structure type
氨基酸残基数/个
Number of amino acid residues
比例/%
Ratio
α螺旋(alpha Helix) 96 41.2%
延伸链(Extended strand) 51 21.8%
无规则卷曲(Radom coil) 86 36.9%


图 4 日本蛇根草 CHI 蛋白保守结构域
Figure 4 The conserved domain of Ophiorrhiza japonica CHI protein
为了更清楚的了解日本蛇根草 CHI 蛋白的高级结构，利用 SWISS-MODEL 在线工具，对该蛋白的三
维结构进行预测。预测的日本蛇根草 CHI 蛋白的三维结构主要以 α螺旋为主，所占比重最大，其次是无规
Position (位点)
200 150 100 50
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
Score（
分
值
）

RF +1
Non-specific
hits
Superfamilies Chacone_3 superfamily
Chalcone
PLN02559
100 200 300 400 500 600 700 1
 则卷曲，而延伸链占的比重最小，这与该蛋白二级结构的预测结果相一致(图 5)。

图 5 日本蛇根草 CHI 蛋白空间构象模拟
Figure 5 The conformation simulation of Ophiorrhiza japonica CHI protein
1.6 日本蛇根草 CHI 基因编码蛋白质的同源比对及系统进化分析
研究显示，CHI 基因的同源性在不同物种与不同类型 CHI 之间差异较大。一般不同植物中 CHI 的同
源性为 49%~82%，而不同植物中同种类型的 CHI，同源性高达 70%以上(李琳玲等, 2008)。本研究将克隆
得到的日本蛇根草 CHI 与其它植物 CHI 的氨基酸序列进行同源比对后发现它们之间的同源性差异较大。
与番茄的同源性仅仅为 15%，而与其它植物的同源性介于 20%~73%之间。日本蛇根草 CHI 与它们的相似
性分别为：豌豆：46.61%、百脉根：52%、菜豆：57.43%、水稻：56.77%、烟草：66.67%、龙眼：69.3%、
橄榄：72.27%、金花茶：70.74%、拟南芥：26.54%、香雪兰：23.81%、蝴蝶兰：28.02%。利用 DNAMAN
软件将日本蛇根草的 CHI 与苜蓿的已知晶体结构的 CHI 进行比对分析，结果表明日本蛇根草的 CHI 具有
查尔酮异构酶普遍存在的活性位点(图 6)。随后，利用 Clustal Omega 将不同植物来源的 CHI 的氨基酸序列
进行多序列比对，然后利用 MEGA5 软件，采用相连接法构建系统进化树，迭代值为 1 000。结果显示，
日本蛇根草的 CHI 与Ⅰ型査尔酮异构酶归为一类，这与氨基酸比对结果中日本蛇根草的 CHI 具有 5 个酶
活性位点是一致的(图 7)。

 图 6 日本蛇根草 CHI 与苜蓿 CHI 氨基酸序列比对
Figure 6 The amino acid alignment between CHIs from Ophiorrhiza japonica and Medicago

图 7 不同植物 CHI 蛋白氨基酸的系统进化树分析
注: 红色框中的为日本蛇根草 CHI
Figure 7 Phylogenetic tree analysis of CHI amino acid sequences in different plants
Note: CHI from Ophiorrhiza japonica was in the red box
2 讨论
本研究成功克隆得到日本蛇根草的 CHI 基因，并利用生物信息学软件对其性质和功能进行分析。结果
表明，该基因的开放阅读框为 702 bp，编码 233 个氨基酸，蛋白分子量为 25.018KD，等电点为 4.95，是
一种稳定蛋白，很可能定位在叶绿体基质中。功能保守域分析显示，日本蛇根草的 CHI 具有查尔酮异构酶
 所共享的两个结构保守域，这也进一步证明了本研究所克隆得到的基因为 CHI 基因。与苜蓿的氨基酸序列
比对分析表明，日本蛇根草的 CHI 具有查尔酮异构酶存在的 5 个保守的酶的活性位点。这 5 个活性位点在
苜蓿的 CHI 中分别为 Arg36 (精氨酸-R)、Thr48 (苏氨酸-T)、Tyr106 (酪氨酸-Y)、Asn113 (天冬酰胺-N) 和
Thr190 (Jez et al., 2000; Jez et al., 2002; Hong et al., 2012)。而在日本蛇根草的 CHI 中第 5 个活性位点是丝氨
酸而不是苏氨酸，有研究显示查尔酮异构酶第五个活性位点的苏氨基酸有时候可以被丝氨酸取代，因此本
研究所克隆得到的 CHI 具有查尔酮异构酶典型的活性位点，初步推测它具有查尔酮异构酶催化活性。
文献研究显示，CHI 超家族包含四种类型蛋白。Ⅰ型普遍存在于维管植物中，负责类黄酮的合成；Ⅱ
型是在豆科中参与异黄酮合成；Ⅲ型是广泛存在于陆生植物中的脂肪酸结合蛋白；Ⅳ型蛋白功能未知
(Ralston et al., 2005; Morita et al., 2014)。Ralston 等人用多种植物中不同类型的 CHI 进行系统进化树构建时，
发现 CHI 超家族的成员确实明显的分为四类。本研究系统进化分析显示，日本蛇根草的 CHI 与Ⅰ型 CHI
归为一类，主要负责维管植物类黄酮的合成，这与以上得出的研究结果相一致。
日本蛇根草是茜草目茜草科草本植物，全草可药用，有清热解毒降压之功效，但是现阶段关于日本生
草类黄酮代谢的研究却是空白。目前在 NCBI 数据库中真核生物中共得到 36 330 条 CHI 核酸序列，其中绿
色植物为 2 141 条，双子叶植物 1 494 条，单子叶植物 364 条。与类黄酮代谢过程中其它关键酶基因相比
CHI 的基因数目非常少，并且茜草目植物中 CHI 核酸序列的数目确是零。本研究首次从茜草目植物日本蛇
根草中成功克隆得到 CHI 基因，并对其进行了相关功能的预测分析，以上结果将为茜草目不同植物 CHI
基因的研究奠定基础，同时为后续茜草目植物类黄酮代谢研究提供科学的参考依据。
3 材料与方法
3.1 植物材料
本研究所使用的日本蛇根草取至贵州施秉地，取材后用锡箔纸包装标记后迅速冻于液氮中，然后保存
在-80°冰箱中备用。
3.2 总 RNA 的提取与 cDNA 合成
利用 RNApure Plant Kit(康为世纪)试剂盒提取日本蛇根草的总 RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量
仪对提取的 RNA 进行质量检测。检测合格后，取 1 μg 总 RNA，使用 EasyScript One-Step gDNA Removal and
cDNA Synthesis SuperMix 试剂(全式金)盒进行逆转录合成 cDNA.。
3.3 引物设计及基因克隆
根据日本蛇根草转录组测序结果设计基因全长引物，以 CHIF1 (5 AATGTCTGGATCATCAAT 3)和
CHIR1 (5 TCTTCAGGCATTTCTTTA 3)作为引物，日本蛇根草 cDNA 的第一链为模板，进行 CHS 基因编
码区的扩增。PCR 反应程序为 94℃预变性 8 min，(94℃ 30 s, 48℃ 30 s, 72℃ 90 s) 35 个循环，72℃后延
伸 8 min，程序结束后将 PCR 产物进行跑胶验证。随后将符合预期大小的 PCR 产物进行胶回收，回收产物
 连接到 pGEM-T easy 载体上，转化 JM109 感受态，挑克隆进行菌液 PCR 和酶切验证，将验证为阳性的克
隆送公司进行测序。
3.4 CHS 基因的生物信息学分析
通过NCBI (National Center for Biotechnology Information)的ORF和CDD在线软件对日本蛇根草的CHI
基因进行开放阅读框及功能保守域的查找；利用 ExPASy-ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)
在线完成了 CHI 氨基酸序列的理化性质分析；采用 DNAMAN 及 Clustal Omega 数据库完成了氨基酸的多
序列比对；并利用 MEGA 5 构建系统进化树；信号肽预测、跨膜域与亚细胞定位分析分别采用 Signal P 4.1、
TMHHM Server v 2.0、SubLoc v1.0 和 PSORT 软件。使用 ExPASy (https://web.expasy.org/protscale)在线预测
日本蛇根草 CHI 氨基酸亲疏水性；蛋白质二级、三级结构的预测分析分别利用在线软件 PHD
(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_phd.pl)和 SWISS-MODEL 工具完成。
作者贡献
孙威、陈婷是本研究实验设计和实验研究的执行人；孙威、汤晓辛、刘杰完成数据分析及论文初稿写
作；乙引、孙威、鞠志刚是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作
者都阅读并同意最终文本。
致谢
本研究由贵州师范大学资助博士科研项目(0516006)、贵州省联合基金项目(黔科合LH字[2015]7777号)
和贵州省重点实验室建设项目(黔科合计 Z 字[2011]4005)共同资助。
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