全 文 ：作者简介:李军，男，研究方向:药品检验，E － mail:bzlijun80@ 163. com
ＲP － HPLC法测定接骨木中盐酸小檗碱的含量研究
李 军，孟祥松，刘文苹，施志顺，袁永健
( 亳州市食品药品检验所，安徽 亳州 236800)
摘要:目的 采用反相高效液相色谱法建立接骨木中盐酸小檗碱含量的测定方法。方法 采用反相高效液相
色谱法，色谱柱: Hypersil ODS C18 ( 4. 6 mm × 250 mm，5 μ m) ;流动相:甲醇 －水 －磷酸 ( 25∶75∶0. 2) ;柱温: 30 ℃ ;检
测波长: 340 nm。结果 盐酸小檗碱在 4. 90 ～ 49. 0 μg·mL －1范围内线性关系良好( r = 0. 999 8) ，精密度试验的
ＲSD = 0. 36%，样品稳定性试验的 ＲSD = 1. 08%，样品重复性试验的 ＲSD = 0. 92%，平均回收率为 98. 68% ( ＲSD =
0. 55% ) 。结论 反相高效液相色谱法测定接骨木中盐酸小檗碱含量的方法简单、准确度高、重现性好，为制定接
骨木的质量控制标准提供参考依据。
关键词:高效液相色谱法;接骨木;盐酸小檗碱
中图分类号:Ｒ927． 2 文献标识码:A 文章编号:2095 －5375(2013)12 －0691 －003
Determination of berberine hydrochloride in Sambucus williamsii Hance by ＲP －HPLC
LI Jun，MENG Xiang-song，LIU Wen-ping，SHI Zhi-shun，YUAN Yong-jian
(Bozhou Institute for Food and Drug Control，Bozhou 236800，China)
Abstract:Objective To establish a method for the determination of berberine hydrochloride in Sambucus williamsii
Hance by ＲP － HPLC. Methods Using the method of ＲP － HPLC，the chromatographic column:Hypersil ODS C18(4. 6
mm × 250 mm，5 μ m);Mobile phase:methanol － water － phosphoric acid (25∶75∶0. 2);Column temperature:30 ℃;The
detection wavelength:340 nm. Ｒesults The linear range of berberine hydrochloride was 4. 90 ～ 49. 0 μ g·mL －1(r =
0. 999 8)，the ＲSD of precision test = 0. 36%，the ＲSD of sample stability test = 1. 08%，the ＲSD of repeatability test =
0. 92%，the average recovery was 98. 77% (ＲSD = 0. 77%). Conclusion The method for determination of berberine
hydrochloride in Sambucus williamsii Hance was simple，accurate，reproducible，provided reference for the quality control
standard of Sambucus williamsii Hance.
Key words:HPLC;Sambucus williamsii Hance;Berberine hydrochloride
接骨木为忍冬科植物接骨木(Sambucus william-
sii Hance)的干燥茎枝，又名公道老、扦扦活、马尿
骚，为常用蒙药，具有接骨续筋，活血止痛，祛风利湿
的功效，用于骨折，跌打损伤，风湿性关节炎，痛风，
大骨节病，急、慢性肾炎，外用治创伤出血等症［1］。
其抑(杀)菌有效成分主要有四大类:萜类化合物及
其衍生物;生物碱、酰胺及蛋白质等含氮含硫化合
物;脂肪类化合物;芳香族化合物［2］。国内外对该
属植物的化学成分和药理活性方面的研究已进行了
大量工作，研究发现接骨木含有黄酮类及盐酸小檗
碱等活性物质［3］。本试验提取接骨木中总生物碱
类成分，然后采用 HPLC 法测定其中盐酸小檗碱的
含量，并规定了盐酸小檗碱含量限度。从而为有效
地开发和利用接骨木的药用价值提供了依据，为提
高接骨木质量标准提供参考。
1 仪器和试剂试药
1. 1 仪器 高效液相色谱仪:Waters e2695;超声
波清洗器:JL360DT;万分之一电子天平:ES － 180J;
十万分之一电子天平:AB135 － S。
1. 2 对照品及试剂 盐酸小檗碱对照品(中国食
品药品检定研究院，批号:110713 － 200911，供含量
测定用，纯度为 86. 80%);甲醇为色谱纯，盐酸和磷
酸为分析纯;水为高纯水。
2 试验方法及结果
2. 1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS C18(4. 6 mm
×250 mm，5 μm);流动相:甲醇 －水 －磷酸 (25∶75
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∶0. 2);流速:1. 0 mL·min －1;柱温:30 ℃;检测波
长:340 nm，进样量:10 μL。对照品及样品色谱图见
图 1 和图 2。
图 1 对照品图谱
图 2 样品图谱
2. 2 标准品溶液的制备 精密称取纯度为 86. 80%
的盐酸小檗碱对照品 5. 28 mg，置于 200 mL 量瓶，
加甲醇定容至刻度，制成盐酸小檗碱浓度为 22. 915 2
μg·mL －1的对照品溶液。
2. 3 供试品溶液的制备 取本品粗粉约 1 g，精密称
定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸 －甲醇(1∶100)混
合溶液 50 mL，密塞，称定重量，冷浸 30 min，超声处
理(功率 500 W，频率 40 kHz)30 min，放冷，再称定
重量，用盐酸 －甲醇(1∶100)混合溶液补足减失的重
量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 25 mL，蒸干，残渣
加盐酸 －甲醇(1 ∶100)混合溶液使溶解，转移至 5
mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，
即得。
2. 4 系统适用性试验
2. 4. 1 线性关系考察 精密称取纯度为 86. 80%盐
酸小檗碱对照品 5. 64 mg，置 50 mL容量瓶中，甲醇溶
解，定容至刻度，即得浓度为 97. 910 4 μg·min －1的
对照品溶液。精密量取上述溶液 0. 5、1. 0、2. 0、
3. 0、4. 0、5. 0 mL于 10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至
刻度，摇匀，作对照品稀释液，在上述色谱条件下分
别进样 10 μL测定，以盐酸小檗碱峰面积为纵坐标，
盐酸小檗碱的浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方
程为 Y = 7 897. 1X + 191. 73，r = 0. 999 8。结果表明
盐酸小檗碱在 4. 895 5 ～ 48. 955 μg·min －1范围内
线性关系良好。
2. 4. 2 精密度试验 精密吸取盐酸小檗碱对照品
溶液 10 μL，重复进样 6 次，测定色谱峰面积值，以
盐酸小檗碱峰面积计 ＲSD为 0. 36%。
2. 4. 3 稳定性试验 在相同色谱条件，于 0、2、4、
8、16、24 h分别吸取同一供试品进行测定，盐酸小檗
碱的 ＲSD为 1. 08%，表明样品溶液在 24 h 内稳定
性良好。
2. 4. 4 重复性试验 分别取同一样品 6 份，按供试
品的制备和测定方法进行测定。盐酸小檗碱的 ＲSD
为 0. 92%，表明方法的重复性良好。
2. 4. 5 加样回收率试验 精密称取已知含量的接
骨木样品 6 份，每份约 1 g，准确计算样品中盐酸小
檗碱的含量，分别加入适量的盐酸小檗碱对照品溶
液。按照上述含量测定法操作，计算平均回收率为
98. 68%，ＲSD 为 0. 55%，符合要求，详细结果见
表 1。
表 1 加样回收率试验
样品含量
(mg)
对照品加入
量(mg)
总含量
(mg)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
ＲSD
(%)
1. 732 1. 828 3. 508 97. 16
1. 728 1. 828 3. 531 98. 63
1. 735 1. 828 3. 548 99. 18
1. 723 1. 828 3. 537 99. 23
1. 737 1. 828 3. 526 97. 87
1. 726 1. 828 3. 534 98. 91
98. 68 0. 55
2. 5 样品含量测定 分别精密吸取对照品和样品
溶液 10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，接骨木中
盐酸小檗碱的含量结果见表 2。
表 2 样品含量结果
样品编号 1 2 3 4 5 6
样品含量(%) 0. 173 0. 168 0. 179 0. 171 0. 165 0. 174
3 讨论
3. 1 检测波长的选择 用可见 －紫外分光光度法
对盐酸小檗碱的甲醇溶液进行扫描，在 220 ～ 360
nm区域内，盐酸小檗碱在 258、311、340 nm 处有三
个最大吸收峰，在 340 nm 处杂质干扰相对较少，故
选取 340 nm作为测定波长。
3. 2 流动相的选择 分别选用流动相为甲醇 －水
－磷酸不同比例对样品进行测定，结果表明在甲醇
－水 －磷酸(25∶75∶0. 2)条件下的分离度、拖尾因子
相对较好，其配制比较简单，因此选用其作为流
动相。
3. 3 提取溶剂的选择 本试验选用参考文献［4］中
盐酸 －甲醇(1∶100)混合溶液作为提取溶剂，并用加
热回流和超声方法取分别对样品 ( 下转第 707 页)
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接种试验菌的量进行预测试验。高浓度的标准品溶
液所产生抑菌圈的直径应在 18 ～ 22 mm 为宜，过小
或过大的抑菌圈直径都会加大实验的误差;加入菌
液的量不应超过培养基体积的 2%，加入过量的菌
液，会稀释菌层培养基，使培养基的营养成分及硬度
降低，会影响细菌的生长和药液的扩散。菌圈过大
或过小都要重新调整加菌液量，加菌液的量达到培
养基体积的 2%时仍不符合要求应重新制备菌液。
在制备菌层平板时，将经过高压灭菌的培养基提前
放入 60 ℃的恒温水浴锅内 15 min 后，快速加入菌
液，混匀后均匀的摊布菌层。不宜过早加入菌液，因
试验菌受热时间过长会被杀死，会使抑菌圈破裂甚
至无菌圈。加入菌层后，待培养基凝固好，挑选摊铺
平整的碟子使用。一般选 8 ～ 10 个进行测量，最少
不低于 6 个。
5． 4 滴加抗生素溶液
5． 4． 1 加样工具 采用毛细滴管滴加溶液，以肉
眼观察所加药液是否平满产生的测量误差加大，而
且滴加药液时间较长，检验人员易产生疲劳，造成操
作失误的概率较大［4］。采用微量移液器定量一次
性加液 300 μL，可消除用肉眼观测钢管中的药液是
否平满的视觉误差，提高准确度，缩短滴加时间，减
少污染机会，降低了劳动强度，因此，建议滴加抗生
素溶液时使用移液器。
5． 4． 2 加样时间和顺序 将需要滴加的碟子分成
3 ～ 5 个一组，按照 SH － TH － TL － SL的顺序分组滴
加［3］，平均每个碟子用时控制在 0． 5 ～ 1 min 左右，
避免抗生素在培养基内的扩散产生差异，降低碟间
和剂间的差异。
5． 5 培养 双碟在培养时不宜靠近热源，因培养温
度不均匀会同一双碟上的细菌生长速度不一致，造
成抑菌圈变小或不圆整。要求培养箱上、中、下、左、
右各位置的温度应基本一致，要保持恒定的温度。
为避免影响培养箱内各部分温度的均匀性，在培养
过程中不宜开启培养箱。
6 结语
以上分析了琥乙红霉素效价测定法中的各种影
响因素及其控制方法，可能还有未涉及的因素，而且
各因素往往不是孤立的而是相互联系、相互作用和
相互影响的。本文提出的关于琥乙红霉素效价测定
法中的各种影响因素及其控制方法在实践中收到了
良好效果，我们实验室在参加中国合格评定国家认
可委员会组织，上海市食品药品检定所实施的抗生
素微生物检定法测定药品含量能力验证计划结果活
动中获得满意的评价。因此，在管碟法测定琥乙红
霉素效价的过程中，只要对各影响因素产生的原因
认真分析，并采取相应措施，就可消除各影响因素产
生的误差，从而保证测量结果准确性高，同时可信限
率也能满足《中国药典》的要求。
参考文献:
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范(2005年版)［S］．北京:中国医药科技出版社，2005:
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射液含量的影响［J］．中国药业，2010，19(2):35 － 36．
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微生物检定法测定药品含量能力验证计划报告［Ｒ］．
中国合格评定国家认可委员会，上海市食品药品检定
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国药事，2006，20(2):112 － 113．
( 上接第 692 页)
进行提取，通过测定分析，超声提取的提取率和回收
率都更好，为药材中盐酸小檗碱的提取提供参考
依据。
3. 4 分析方法讨论 分析试验数据结果表明，建立
测定接骨木中盐酸小檗碱含量的高效液相色谱法，该
方法简单、准确度高、重现性好，为制定接骨木的质量
控制标准提供参考依据。
参考文献:
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