全 文 ：收稿日期:2013-12-13; 修订日期:2014-07-28
基金项目:江苏省中医药局科技基金资助项目(No． LZ13247)
作者简介:王 霞(1979-) ，女(汉族) ，江苏泰兴人，南京医科大学讲师，在
读博士研究生，主要从事中西医结合对消化道肿瘤的研究工作．
* 通讯作者简介:孙志广(1963-) ，男(汉族) ，山东淄博人，南京中医药大
学附属江苏省中医院教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事中西医
结合对消化系统疾病的诊断与治疗工作．
猫人参提取物
对亚硝基胍诱发的胃癌发生的预防作用
王 霞1，2，魏睦新2，刘 皓2，孙志广3*
(1．南京中医药大学，江苏 南京 210046; 2．南京医科大学，江苏 南京 210029;
3．南京中医药大学附属江苏省中医院，江苏 南京 210029)
摘要:目的 观察猫人参(Actinidia valvata Dunn)提取物对 N －甲基 － N＇－硝基 － N －亚硝基胍(MNNG)诱发的胃癌发生
的预防作用及对胃黏膜 Cyclind1 蛋白表达的影响。方法 以 MNNG 作为癌变的诱导剂，将大鼠随机分为空白对照组(A
组)，模型对照组(B组) ，猫人参常规剂量组(C组)，猫人参高剂量组(D组) ，维甲酸组(E组) ，观察治疗前后大鼠的一般
情况，肿瘤的发生率和死亡率，免疫组化观测胃黏膜 Cyclind1 的变化。结果 肿瘤的发生率中，A组 0%，B组 72． 7%，C组
28． 6%，D组 35． 7%，E组 38． 5%。C、D、E组能显著降低 Cyclind1 蛋白的表达，与 B组相比有明显差异(P ＜ 0． 01)。结论
猫人参提取物有降低不典型增生、胃癌的发生率的趋势，作用机制可能与其能降低 Cyclind1 蛋白的表达有关。
关键词:胃癌; 预防; 猫人参; Cyclind1
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 11． 032
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2014)11-2649-03
胃癌是临床常见的消化道恶性肿瘤之一。每年世界范围内
有近 100 万人被诊断为胃癌，70 万左右死于胃癌，致死率高于其
他常见的恶性肿瘤如直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等［1］。在中国，
胃癌居恶性肿瘤发病率的第 2 位、死亡率的第 3 位［2］。尽管目前
治疗水平有提高，但胃癌的 5 年生存率仍只有 20%左右［3］。由
于早期诊断比较困难，对胃癌的防治着重于饮食习惯的改变、幽
门螺杆菌(HP)的根除及化学预防药的发现，如研究发现环氧合
酶 2(COX2)抑制剂、过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(PPAＲγ)
可以减少发生胃癌的风险［4，5］。猫人参是江浙地区常用的中草
药，主要用于骨髓炎、疮疡脓肿、消化系统肿瘤等。研究发现单味
猫人参注射液对白血病、肝癌及结肠癌细胞株有一定的抑制作
用，对小鼠皮下移植瘤有显著抑制作用［6］。其中发挥抗肿瘤活
性的最主要两个有效部位是从猫人参醇提取物中分离出的含蒽
醌类的 MA和含皂苷类的 MB［7］。但有关猫人参在体内的作用
鲜有报道。本实验通过口服猫人参提取物，探讨其对亚硝基胍诱
发的大鼠胃腺癌发生的化学预防作用。
1 材料
1． 1 动物 Wistar雄性大鼠(4 ～ 6 周龄清洁级)80 只，体重 60 g
左右，由南京医科大学实验动物中心提供。
1． 2 药物和试剂 N －甲基 － N＇－硝基 － N －亚硝基胍(MNNG)
为东京化成工业株式会社产品;雷尼替丁为江苏正大天晴药业股
份有限公司生产。维甲酸由上海第六制药厂生产。猫人参醇提
取物参考张亚妮等［8］的提取方法:取材粗粉 20kg，8 倍 80%乙醇
作提取溶剂，回流提取多次，滤过得醇提液(产率 9． 5%)，由江苏
省药物研究所协助提供。兔抗鼠一抗 Cyclind1 (Santa Cruz公司，
美国)，免疫组织化学二抗试剂盒、DAB显色试剂、磷酸盐缓冲液
PBS(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
2 方法
2． 1 造模及分组 老鼠饲养于室温(22 ± 2)℃，湿度(55% ±
5%)的环境中，保持昼夜节律各 12 h，自由饮食和喝水。适应性
喂养 1 周后，随机分为正常组 10 只(A 组)，造模组 70 只。正常
组给予正常饮食。造模组参照 P J Hu［4］、李春启［9］的方法并加
以改进，进食含 0． 03%雷尼替丁的标准鼠料，自由饮用 MNNG液
(用蒸馏水配成 100 μg /ml的溶液，1 周配 3 次，避光保存)。前 6
周，每周灌胃 1 次 10%NaCl溶液 1 ml。造模持续 24 周。结束后
将造模组成活大鼠(66 只)随机分为模型对照组(B 组)、猫人参
常规剂量组 3 g(生药)/kg(C 组)和高剂量组 6g(生药)/kg(D
组)(大鼠用药和人的换算按体表面积计算，成人的常规每日用
量为 30g，30 × 0． 018 /0． 2 = 2． 7g /kg，常规剂量的 2 倍作为高剂量
组)、阳性对照药维甲酸组 0． 04 g /kg(E组)。每组 16 只左右，正
常饮食和饮水。各组每天分别给予相应药物灌胃，灌胃容积 10
ml /kg(体质量≤200 g)、5 ml /kg(体质量 ＞ 200 g)，每天 1 次，连
续 16 周。正常组和模型对照组给以等量生理盐水灌胃。实验期
间观察所有大鼠的一般情况，每周测量 1 次体质量。实验进行中
死亡的大鼠解剖以了解死亡原因及观察有无胃癌的发生。41 周
末处死所有老鼠。
2． 2 组织病理学检测 实验结束后大鼠禁食不禁水 24 h，用
10%的水合氯醛(3ml /kg)腹腔注射麻醉，剖腹取胃，沿胃大弯剪
开，冰生理盐水漂洗，平铺于冰盘上肉眼观察胃黏膜的变化情况，
在胃窦以及肿块部位剪取组织 1 块，Carnoy 液固定，石蜡包埋，5
μm切片，作苏木精 －伊红染色，参照实验性胃腺癌的分类及诊
断标准［10］于光镜下观察胃黏膜病理形态学变化。计算各组浅表
性胃炎(CSG)、萎缩性胃炎(CAG)、肠化生(IM)、不典型增生
(ATP)、胃癌(GC)的发生例数。
2． 3 免疫组化测定 Cyclind1 SP法进行免疫组织化学染色，PBS
代替一抗作阴性对照，已知阳性表达的胃癌切片作阳性对照。
Cyclind1 定位于胞核，阳性细胞呈棕黄色颗粒，用 Image － Pro
Plus6． 0 软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标
准对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值
(IOD)。每组所有照片的平均值代表该组的 IOD 值用 Mean ± s
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 11 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 11 期
表示。
2． 4 统计学方法 所有数据采用 SPSS 13． 0 进行统计分析，计数
资料采用 χ2 检验，计量资料组间比较采用方差分析。组间两两
比较采用单因素方差分析(one － way ANOVA)，以 P ＜ 0． 05 为有
统计学差异，P ＜ 0． 01 为有统计学显著差异。
3 结果
3． 1 大鼠一般情况的变化 造模期间共有 4 只老鼠死亡，实验中
共有 17 只老鼠死亡，其中 A 组 0 只，B 组 5 只，C 组 4 只，D 组 4
只，E组 4 只。存活率比较各组间没有差异(P ＞ 0． 05)。各组老
鼠死亡原因见表 1。A组生长状况良好，精神状态、活动度、反应
能力良好，进食较多，形体肥胖。B 组大鼠逐渐消瘦，活动缓慢，
喜扎堆，食量减少。CDE 组精神状态、食量、活动情况等均比正
常对照组差，比模型对照组好，三组之间没有明显差别。各组体
重变化见图 1。
图 1 各组大鼠体重的变化
3． 2 大鼠胃黏膜的病理变化
3． 2． 1 肉眼所见 A组大鼠胃黏膜呈浅红色，黏膜厚，皱襞光滑，
弹性好。B组黏膜变薄，颜色苍白，皱襞变平、减少或消失，弹性
差，内见多个结节，呈息肉状或菜花样，质地较硬。C、D、E 组多
数胃粘膜呈暗红色，内有结节，多位于胃窦部，皱襞变平。
3． 2． 2 光镜下病理组织学改变 造模组大部分大鼠的胃黏膜均
有病变，早期表现为不同程度的糜烂、充血或溃疡，晚期出现不同
程度的不典型增生和癌变。其中 B 组中出现 9 例 GC，伴不典型
增生。C组出现 4 例 GC，5 例 ATP，5 例 CSG。D组出现 3 例 GC，
4 例 ATP，2 例 GC伴不典型增生，5 例 CSG。E组出现 4 例 GC，4
例 ATP，1 例 GC伴不典型增生，4 例 CSG。各组没有出现明显的
肠上皮化生，这和文献报道的“MNNG 诱发的动物模型多为胃黏
膜 ATP，少有 IM”［11］相一致(见表 1)。大鼠胃黏膜的组织病理
见图 2。
表 1 各组大鼠肿瘤发生率和死因
组别 数量 死亡原因(数量)
肿瘤发生
例 率(%)
ATP发生
例 率(%)
A 10 0 0 0 0 0
B 16 胃癌(3) ，食道癌(1) ，不明原因(1) 9 81． 8 9 81． 81
C 17 胃癌(2) ，不明原因(1) 4 28． 6 5 35． 72
D 17 胃癌(3) 3 21． 4 4 28． 62
E 17 胃癌(3) ，小肠癌(1) 4 30． 8 4 30． 8
与 A组相比，1P ＜0． 05。与 B组比较，2P ＜0． 05
3． 2． 3 Cyclind1 蛋白表达情况 Cyclind1 呈典型胞核表达，核膜
染色明显(图 3)。与 A组(264． 51 ± 143． 74)相比，B组 Cyclind1
蛋白表达上升(4809． 32 ± 554． 89，P ＜ 0． 01)。猫人参和维甲酸
表现出一定的调节作用。和 B 组相比，C、D、E 组均可显著降低
Cyclind1 蛋白表达，其中 C 组蛋白表达为 993． 68 ± 459． 01
(P ＜ 0． 01)，D组蛋白表达为 1667． 2757 ± 392． 0578(P ＜ 0． 01) ，E
组蛋白表达为 1561． 8400 ± 156． 4589 (P ＜ 0． 01) ，但 C、D、E三组
相比无明显差异(P ＞ 0． 05)。见图 4。
A －空白对照组 B －模型对照组 C －猫人参 3g /kg组
D －猫人参 6g /kg组 E －维甲酸组
图 2 光镜下胃黏膜的组织学变化(200 ×)
A －空白对照组 B －模型对照组 C －猫人参 3g /kg组
D －猫人参 3g /kg组 E －维甲酸组
图 3 各组大鼠胃黏膜 Cyclind1 阳性细胞的表达(200 ×)
4 讨论
恶性肿瘤的发生是一个漫长的过程，世界卫生组织在 2006
年正式将肿瘤列入慢性病的范畴［12］。受环境及遗传因素的双重
影响，胃癌的发生是多基因改变、多因素参与及多阶段发生的复
杂过程，其机制至今仍不十分明确，目前针对胃癌的治疗没有特
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 11 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 11
别有效的方法。但是胃癌与其他大多数恶性肿瘤一样，很少直接
从正常组织发生癌变，而是在临床上出现肿瘤之前，经过一个相
当长的演变阶段，其过程中细胞增殖、凋亡的动态平衡被打破。
细胞周期调节着细胞的增殖和凋亡，分为 G1 期、S 期、G2 期和 M
期。负责细胞周期调控的相关蛋白称为调控子(cell cycle regula-
tor)，包括细胞周期蛋白(CD，cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶
(CDK，cyclin dependent kinase)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物
(CKI)三大类［13，14］。作为细胞周期重要的正调控因子，cyclinD1
是 G1 期细胞周期蛋白，驱动细胞从 G1 期进入 S期，促进细胞增
殖，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用［15 ～ 17］。正常细胞
周期中，cyclinD1 于 G1 初期开始累积，于 DNA 合成前达峰值，S
期含量最低。若 cyclinD1 过表达则会使 G1 期间隔缩短，降低细
胞对促细胞分裂剂的依赖性，促进那些在正常情况下对特异的环
境信号刺激发生生长阻滞的细胞，无视这些刺激，提前进入 S期，
使细胞增殖失控，最终形成肿瘤［18，19］。cyclinD1 作为一种原癌基
因，在正常组织中表达很低，但在许多恶性组织中则过量表达。
研究证实，在胃癌前病变期，cyclinD1 的表达已发生改变。和正
常对照组相比，胃癌前病变、胃癌组织中 cyclinD1 的表达呈逐步
增高［20］，这和我们实验中观察到的结果一致。
C． D． E组与 B组比较，P ＜ 0． 01
图 4 Cyclind1 阳性细胞数分析，
猫人参是民间草药，主产于江浙地区，来源于猕猴桃科植物
对萼猕猴桃(Actinidia valvata Dunn)或大籽猕猴桃 (A． macrosper-
ma C． F． Liang)的根，性凉，味苦涩，归肺胃经，功效为清热解毒，
祛风除湿，临床主要用于骨髓炎、疮疡脓肿、消化系统肿瘤等的治
疗。如名医刘嘉湘认为猫人参既有清热解毒之效，又具苦涩收敛
之性，常用于癌症胸水的治疗［21］。文献报道从猫人参中提取的
单体化合物科罗索酸(CＲA)在体外对人结肠癌细胞 HCT － 8、K
－562 白血病细胞、人宫颈腺癌 Hela细胞、人胃癌细胞 SNU － 601
等有明显抑制作用，能诱导细胞周期阻滞，导致细胞凋亡［22 ～ 24］。
本研究通过目前公认的 MNNG 诱导胃癌发生的造模方法，发现
猫人参提取物有降低胃癌发生的趋势。病理组织学发现猫人参
干预组大鼠不典型增生率明显降低，考虑这可能与猫人参降低胃
黏膜 cyclinD1 蛋白表达相关。
参考文献:
［1］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al． Global cancer statistics［J］． CA
Cancer J Clin，2011，61(2):69．
［2］ 郝 捷，陈万青．中国肿瘤登记年报，第 1 版［M］． 北京:军事医学
科学出版社，2012:1．
［3］ Naginis． Carcinoma of the stomach:A review of epidemiology，pathogen-
esis，molecular genetics and chemoprevention［J］． World Gastrointest
Oncol，2012，4(7) :156．
［4］ Hu P J，Yu J，Zeng Z Ｒ，et al． Chemoprevention of gastric cancer by
celecoxib in rats［J］． Gut，2004，53(2) :195．
［5］ Chen BL，Yu J，Zeng ZＲ，et al． Ｒosiglitazone suppresses gastric carcino-
genesis by up － regulating HCaＲG expression［J］． Oncol Ｒep，2008，20
(2) :1093．
［6］ 易婷娇，徐燕丰，郑国银，等．猫人参总皂苷对小鼠皮下移植瘤的抑
制作用［J］．中华中医药学刊，2009，27(8) :1642．
［7］ 张亚妮，刘 岭，凌昌全．猫人参有效部位对小鼠移植性肿瘤 H22的
抑制作用及机制探讨［J］．中国中药杂志，2006，31(11) :918．
［8］ 张亚妮，姜远英． 猫人参抗肿瘤有效部位的筛选及相关实验研究
［D］．上海:第二军医大学硕士论文，2005:10．
［9］ Li CQ，Liu WW，Fang DC． Experimental study on model establishment，
mechanism of Production，and reverse therapy of gastric mucosal precan-
cerous lesions in rats［J］． J Med Coll PLA，1994，9(2) :103．
［10］ 张均田．现代药理实验方法，上册［M］． 北京:北京医科大学 中国
协和医科大学联合出版社，1998:885．
［11］ 魏 玥，杨晋翔，李志刚，等． N －甲基 － N＇－硝基 － N －亚硝基胍胃
癌前病变大鼠造模联合因素的探讨［J］． 中国中西医结合消化杂
志，2011，19(2) :111．
［12］ 朱元民，刘玉兰．感染、炎症与肿瘤的发生［J］． 胃肠病学和肝病学
杂志，2013，22(2) :105．
［13］ Weinberg ＲA． The Ｒetinoblastoma protein and cell cycle control［J］．
cell，1995，81(5) :323．
［14］ Besson A，Dowdy SF，Ｒoberts JM，et al． CDK Inhibitors:cell cycle regu-
latsors and beyond［J］． Der cell，2008，14(2) :159．
［15］ Moghaddam SJ，Haghighi EN，Samiee S，et al． Immunohistochemical a-
nalysis of P53，cyclinD1，ＲB1，c － fos and N － ras gene expression in
hepatocellular carcinoma in Iran［J］． World J Gastroenterol，2007，13
(4) :588．
［16］ Ｒose SL，Buller ＲE． The role of p53 mutation in BＲCA1 － associated o-
varian cancer［J］． Minerva Ginecol，2002，54(3) :201．
［17］ Zhou JX，Niehans GA，Shar A，et al． Mechanisms of Gl checkpoint loss
in resected early stage non － small cell lung cancer［J］． Lung Caneer，
2001，32(1) :27．
［18］ Motokura T，Bloom T，Kim HG，et al． A novel cyclin encoded by a bcll
－ linked candidate oncogene［J］． Nature，1991，350(6318) :462．
［19］ Qu Z，Weiss JN，Mac Lellan WＲ． Ｒegulation of the mammalian cell cy-
cle:a model of the G1 － to － S transition［J］． Am J Physiol Cell Physi-
ol，2003，284(2) :349．
［20］ Motohashi M，Wakui S，Muto T，et al． Cyclin D1 /cdk4，estrogen recep-
tors α and β，in N － m ethyl － N＇ － nitro － N － nitrosoguanidine － in-
duced rat gastric carcinogenesis:immunohistochemical study［J］． Toxi-
colSci，2011，36(3) :373．
［21］ 李 雁．刘嘉湘治疗癌症用药经验［J］．上海中医药杂志，2007，41
(1) :9．
［22］ Ahn KS，Hahm MS，Park EJ，et al． Corosolic acid isolated from the fruit
of Crataegus pinnatifida var． psilosa is a protein kinase C inhibitor as
well as a cytotoxic agent［J］． Planta Med，1998，64(5) :468．
［23］ Xu YE，Ge，ＲL，Du J，et al． Corosolic acid induces apoptosis through
mitochondrial pathway and caspases activation in human cervix adeno-
carcinoma HeLa cells［J］． Cancer Lett，2009，284(4) :229．
［24］ Lee MS，Cha EY，Thuonq PT，et al． Down － regulation of human epider-
mal growth factor recerptor2 /Neu oncogene by corosolic acid induced
cell cycle arrest and apoptosis in NCI － N87 human gastric cancer cells
［J］． Biol Pharm Bull，2010，33(6) :931．
·1562·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 11 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 11 期