全 文 ： 中国现代应用药学 2016 年 8 月第 33 卷第 8 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 August, Vol.33 No.8 ·989·
余甘子醇提物抑制人胃癌株 AGS 细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用

罗兰 1，林久茂 2，魏丽慧 2，李琼瑜 2，薛曼华 1，彭军 2*(1.福建卫生职业技术学院药学系，福州 350101；2.福建中医药
大学中西医结合研究院，福州 350122)

摘要：目的 考察余甘子醇提物体外对人胃癌 AGS 细胞的生长抑制和诱导凋亡的作用。方法 采用 MTT 法、细胞集落
实验、Hoechst 染色分析、Annexin-V-FITC/PI 等方法对经过余甘子醇提物体外作用的 AGS 细胞进行观察和检测。结果
AGS 细胞经 0.05，0.1，0.15 mg·mL1 余甘子醇提物作用后，各组细胞形态均发生不同程度的变化，并呈现浓度-时间依
赖性；细胞集落实验表明余甘子醇提物抑制肿瘤细胞的集落形成率；Hoechst 染色分析、Annexin V/PI 实验表明余甘子醇
提物能够促进肿瘤细胞的凋亡。结论 余甘子醇提物在体外对人胃癌 AGS 细胞具有良好的抑制生长和诱导凋亡的作用。
关键词：余甘子；人胃癌 AGS 细胞；抑制生长；诱导凋亡
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2016)08-0989-05
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2016.08.006

Effects of Ethanol Extract of Phyllanthi Fructus on Proliferation and Apoptosis of Human Gastric
Cancer AGS Cells

LUO Lan1, LIN Jiumao2, WEI Lihui2, LI Qiongyu2, XUE Manhua1, PENG Jun2*(1.School of Pharmacy, Fujian
Health College, Fuzhou 350101, China; 2.Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine,
Fuzhou 350122, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the effects of ethanol extract of Phyllanthi Fructus on proliferation and apoptosis of
human gastric cancer AGS cells in vitro. METHODS After the action of alcohol extract of Phyllanthi Fructus in vitro, the AGS
cells were observed and detectd through MTT method, Cell colony experiment, Hoechst staining, and Annexin V/PI. RESULTS
After the treatment with 0.05, 0.10, 0.15 mg·mL1 of alcohol extract, the morphology of AGS cells in each group changed
different degrees and showed concentration-time dependence; Cell colony experiments showed that the ethanol extract of
Phyllanthi Fructus can inhibit tumor cell colony formation rate; Hoechst staining analysis, Annexin-V-FITC/PI experiments
showed that the ethanol extract of phyllanthi fructus can promote tumor cell apoptosis. CONCLUSION The alcohol extract of
Phyllanthi Fructus in vitro has good inhibition activity and apoptosis induce on human gastric cancer AGS cells.
KEY WORDS: Phyllanthi Fructus; human gastric cancer cell AGS; growth inhibition; induction of apoptosis


基金项目：福建省卫计委青年科研课题(2015-1-92)
作者简介：罗兰，女，硕士，讲师 Tel: 18960868933 E-mail: fjluolan@qq.com *通信作者：彭军，男，博士，研究员，博导 Tel:
(0571)22861303 E-mail: pjunlab@hotmail.com
肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之
一，已成为人类健康头号杀手。胃癌常见于中年
男性，是最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围
内，胃癌的发病率位列所有恶性肿瘤第 4 位，死
亡率居第 2 位[1]。从多年临床病例看，由于福建地
区的人爱吃腌制及干货食品，所以胃癌发病率也
相对较高。
余甘子为大戟科油柑属植物余甘子(Phyllanthus
emblica L.)的干燥成熟果实。性甘、酸、涩、凉。
归肺、胃经。具有清热凉血，消食健胃，生津止
渴的功效[2]。福建闽南地区盛产该品。1990 年起
余甘子被载入中国药典。前期研究表明，余甘子
中的酚类化合物具有显著的抗肿瘤活性，对人
子宫癌细胞(HeLa)和鼠黑素瘤细胞(B16F10)、人
肝癌细胞 Hep G2 和 BEL-7404、乳腺癌细胞
MCF-7 及人肺癌细胞 A549 的增殖均有很强的抑
制作用[3-7]。本课题继研究余甘子对胃肠道菌群
有着良好抑菌作用[8]后，根据中医中余甘子归胃
经理论，针对余甘子对体外人胃癌 AGS 细胞生长
抑制和诱导凋亡作用进行研究，以期为余甘子更
好地用于临床提供新的实验依据。
1 材料
1.1 仪器
B-290 型实验室小型喷雾干燥机(瑞士 Buchi
公司)；ELX800 酶标仪(BioTek)；HF212UV CO2
培养箱(HealForce)；DMI4000B 荧光倒置相差显微
镜系统(徕卡仪器公司)；SW CJ 1D 超净工作台(苏
州净化设备有限公司)；移液器(德国 Eppendorf 公
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司)；HS-4 恒温浴槽(成都华衡仪器有限公司)；
FACSCalibur 流式细胞仪(BD 公司)。
1.2 药物与试剂
新鲜余甘子采购于福建省惠安县紫山镇，由
福建卫生职业技术学院中药教研室朱扶蓉副教授
鉴定为大戟科余甘子(Phyllanthus emblica L.)的果实。
RPMI 1640 培养基(批号：8116157)、胰蛋白
酶(trypsin-EDTA，批号：1234955)、胎牛血清(FBS，
批号：1453373)均购自美国 life 科技公司；四甲基
偶氮唑蓝(MTT，批号：303H0530)、PBS(批号：
NAA1313)和干粉均购自美国 Sigma 公司；DNA
Ladder 试剂盒(批号：20140900)和 AnnexinV-FITC
细胞凋亡检测试剂盒(批号：20140809)购自南京凯
基生物科技发展有限公司；二甲基亚砜(DMSO，
国药集团化学试剂有限公司，批号：20140401)。
1.3 细胞株
人胃癌 AGS 细胞株购自中国科学院上海细胞
研究所，置于含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中，
在 37 ℃、5% CO2 培养箱中传代培养，取对数生
长期细胞用于实验。
2 方法与结果
2.1 提取物的制备及配制
采用 80%乙醇对新鲜余甘子(灭菌、干燥后备
用)进行提取，加热回流提取 3 次，减压回收溶剂
得流浸膏后，冻干成粉末，保存于 4 ℃冰箱中，
化学成分预实验结果[9]显示其中主要含有多酚类
成分(包括黄酮类成分和酚类成分)。用 RPMI 1640
调至工作母液浓度 1 mg·mL1，20 ℃保存，临用
前用 RPMI1640 调至所需浓度。经过二分法筛选
后，确定 0.05，0.10，0.15 mg·mL1 3 个浓度，以
RPMI 1640 作为对照组，浓度为 0 mg·mL1。
2.2 细胞培养
将人胃癌 AGS 细胞株置于含 10%热灭活 FBS
的 RPMI 1640 培养液中，在 37 ℃、5% CO2、饱
和湿度的细胞培养箱中培养。
2.3 MTT 法检测细胞活性
取生长到 90%的细胞，进行细胞计数，取
0.6×105 个·mL1，接种于 96 孔板中，每孔 100 μL。
置于 37 ℃，5% CO2 培养箱培养，覆盖率达 50%
左右时，加入不同浓度的余甘子醇提物(0.05，0.10，
0.15 mg·mL1)，设 RPMI 1640 培养液为对照组，
平行 8 个复孔，继续培养 24 h 后，吸取各孔中的
液体，每孔加入 0.5 mg·mL1 的 MTT 溶液 100 μL，
37 ℃孵育 4 h，然后吸取各孔中的液体，每孔加入
DMSO100 μL，振荡混匀，室温放置 10 min，使结
晶充分溶解并混匀，在全自动酶标仪 570 nm 处测
定各组吸光度值(即 A 值)，按下列公式计算增殖抑
制率：抑制率(%)=(对照组 A 值实验组 A 值)/对照
组 A 值×100%。抑制率≥30%视为细胞对药物敏感。
2.4 细胞生长曲线的测定
将 AGS 细胞浓度调整为 5×104 个·mL1，接
种于 24 孔板上，每孔 1 mL。培养 12 h 后，分别
加入余甘子醇提物使最终质量浓度为 0.05，0.10，
0.15 mg·mL1，设 RPMI 1640 培养液为对照组，置
于培养箱中培养，从接种时间算起，每隔 12 h 计
数各组细胞密度并计算平均值。为提高准确率，
每孔细胞可计数 2~3 次，绘制细胞生长曲线，实
验重复 3 次。
2.5 集落实验
取长到 90%的细胞，进行细胞计数，取
1×105 个·mL1，接种于 6 孔板中，接种体积为
2 个·mL1。置于 37 ℃，5% CO2 培养箱培养，覆
盖率达 50%左右时，加入不同浓度的余甘醇提物
(0.05，0.10，0.15 mg·mL1)，以 RPMI 1640 培养
液为对照组，重复 3 次，24 h 后进行细胞计数和
接板，每孔 2 mL，每孔 1 000 个细胞，6 d 后，结
晶紫染色后拍照，数集落。按下列公式计算集落
形成率和集落形成抑制率。
集落形成率(%)=(集落数/接种细胞数)×100%
集落形成抑制率(%)=(1给药组集落数/对照
组集落数)×100%。
2.6 Hoechst 实验
长到 90% 的细胞，进行细胞计数， 取
1×105 个·mL1，接种于 6 孔板中，每孔接种 2 mL。
置于 37 ℃，5% CO2 培养箱培养，覆盖率达 50%
左右时，加入不同浓度的余甘醇提物(0.05，0.10，
0.15 mg·mL1)，以 RPMI 1640 培养液为对照组，
重复 3 次，24 h 后吸取上清液，1 mL PBS 清洗，
加 1 mL 4%多聚甲醛，固定 10 min，吸走液体，
PBS清洗。加配好的Hoechst染色，避光作用 10 min
后荧光显微镜下观察凋亡细胞。
2.7 Annexin V/PI 实验
采用 AnnexinV-FITC 流式细胞仪测定。细胞
干预 24 h 后，先用不含 EDTA 0.25%胰蛋白酶消
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化，制成单个细胞悬液，调整待测细胞的密度为
1×105~5×105 个·mL1。取 1 mL 细胞用 PBS 离心
洗涤，2 000 r·min1，4 ℃离心 5 min，共 3 次，弃
上清液。用 500 μL 的 Binding Buffer 重悬细胞，
加入 5 μL AnnexinV-FITC 混匀后，再加入 5 μL
Propidium iodide(PI)，混匀，室温避光反应 15 min，
1 h 之内上机检测。同时染对照管和补偿设置管，即
未染色的裸细胞，单染AV-FITC的管和单染PI的管。
2.8 统计学分析
实验数据均以 sx  表示，应用 SPSS 22.0 统
计软件进行单因素方差分析，比较组间差异性。
组间差异采用 Fisher 精确概率法，P<0.05 为差异
有统计学意义。
3 结果
3.1 余甘子醇提物对 AGS 细胞形态学的影响
显微镜下观察到，未经处理的人胃癌 AGS 细
胞培养 48 h 后，贴壁生长良好，细胞数量增多，
透光性好，逐渐形成细胞岛并连接成片。经
0.05 mg·mL1 余甘子醇提物作用后，AGS 细胞边
界逐渐模糊，折光性差，细胞增殖能力开始下降。
0.10 mg·mL1 余甘子醇提物使得细胞状态进一步
受到影响，可观察到细胞形态逐渐改变，细胞数
逐渐减少，体积缩小，折光性差，细胞悬浮、脱
落而死亡。本实验结果显示，余甘子醇提取物能
够抑制 AGS 细胞的增殖，并随浓度的增加而增强，
呈明显的量效趋势。结果见图 1。

图 1 人胃癌 AGS 细胞经余甘子醇提物作用 48 h后的形
态学变化
Fig. 1 Morphological changes of human gastric cancer AGS
cells affected by alcohol extract of Phyllanthi Fructus after 48 h
3.2 余甘子醇提物对 AGS 细胞的增殖抑制作用
不同质量浓度的余甘子醇提物与细胞作用
24 h 后，对 AGS 细胞的增殖表现出不同程度的抑
制作用(P<0.05)，且随着浓度的增大抑制作用逐渐
增强，具有一定的剂量依赖性。结果见图 2。
图 2 余甘子醇提物对胃癌 AGS细胞活力的影响
与对照组相比，1)P<0.05，2)P<0.01。
Fig. 2 Effect of the alcohol extract of Phyllanthi Fructus on
gastric cancer AGS cells
Compared with control group, 1)P<0.05, 2)P<0.01.
MTT 法结果显示，不同浓度的余甘子醇提物
对 AGS细胞作用 24 h 后细胞生长和增殖受到不同
程度的抑制。随着余甘子醇提物浓度的增加，对
AGS 细胞的生长抑制作用逐渐增加，且有一定的
剂量依赖性，0.05，0.10，0.15 mg·mL1 余甘子醇
提物的细胞活力分别为 87.62%，45.07%，27.52%，
抑制率分别为 12.38%，54.93%，72.48%。通过
计算得 IC50 值为 0.108 mg·mL1。
3.3 余甘子醇提物对 AGS 细胞生长曲线的影响
对照组细胞增殖速度较快，呈典型的指数增
长模式；不同浓度余甘子醇提物对 AGS 细胞的抑
制作用比较明显，且随着药物浓度的增加抑制作
用增强，说明余甘子醇提物对细胞增殖具有一定
的抑制作用，并且呈一定的时间和剂量依赖性。
结果见图 3。
3.4 余甘子醇提物对 AGS 细胞克隆的作用
集落实验中，形成克隆的细胞必为贴壁和有
增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖
性和增殖能力两个重要性状。药物作用 48 h 后去
除药物常规培养 6 d，测定结果见图 4 和表 1。
不同浓度的余甘子醇提物对 AGS 细胞集落形
成率有明显的抑制作用，且随着浓度的增大抑制
作用逐渐增强，呈一定的剂量依赖性，结果见表 1。
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与对照组相比，其集落形成率及集落形成抑制率
有显著性差异(P<0.01)。

图 3 余甘子醇提物对人胃癌 AGS细胞生长曲线的影响
Fig. 3 Effect of the alcohol extract of Phyllanthi Fructus on
the growth curve of human gastric cancer AGS cells

图 4 余甘子醇提物对 AGS细胞集落形成的影响
Fig. 4 AGS cells colony formation by the alcohol extract of
Phyllanthi Fructus
表 1 余甘子醇提物对 AGS细胞的集落形成的影响(n=5)
Tab. 1 Colony formation effect of alcohol extract of
Phyllanthi Fructus on AGS cells(n=5)
组 别 浓度/
mg·mL1
集落数 集落形 成率/%
集落形成
抑制率/%
对照组 0 81610 81.6 0
余甘子醇提物 0.05 6848 68.41) 16.21)
0.10 3515 35.11) 57.01)
0.15 1132 11.31) 86.11)
注：与对照组相比，1)P<0.01。
Note: compared with control group, 1)P<0.01.
3.5 Hoechst 染色显示余甘子醇提物对 AGS 细胞
凋亡的影响
Hoechst 染色结果显示，在 0 mg·mL1时，细胞
呈蓝色，几乎见零星亮蓝色荧光。在 0.05 mg·mL1
时，可看到大部分细胞依旧形态完整，亮蓝色荧
光数目增加。但在 0.10 mg·mL1 时，细胞形态开
始发生变化，细胞边缘模糊，亮蓝色荧光增加。
在 0.15 mg·mL1 时，细胞形态发生变化，产生强
烈荧光，提示出现了明显的凋亡，结果见图 5。

图 5 Hoechst 染色观察余甘子醇提物对 AGS 细胞凋亡形
态学的影响
Fig. 5 Hoechst staining observation on the apoptosis effect
of alcohol extract of Phyllanthi Fructus on AGS cells
3.6 Annexin V/PI 实验检测余甘子醇提物对 AGS
细胞凋亡的影响
AGS 细胞经余甘子醇提物 0.05， 0.10，
0.15 mg·mL1 处理后，与对照组(7.28%)相比，凋
亡细胞数及坏死细胞数明显增多(P<0.01)，分别为
20.04%，30.17%，43.76%。显示余甘子醇提物对
AGS 细胞有明显的促凋亡作用，并存在浓度依赖
性，结果见图 6。
4 结论
中药抗肿瘤作用最重要机制之一是诱导肿瘤
细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的进一步恶化，乃至
消灭全部残留的肿瘤细胞[10]。作为药食同源的中
药余甘子，目前国内外对其抗肿瘤的研究包括余
甘子叶、果实、枝、根部位对诱导多种人肿瘤细
胞株凋亡均有涉及，但对胃癌细胞的作用未见报
道。福建地区盛产余甘子，且福建地区的胃癌发
病率居高不下，因此，本研究为余甘子在人胃癌
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图 6 Annexin V/PI实验观察余甘子醇提物对 AGS细胞凋
亡的影响
Fig. 6 Annexin V/PI experimental observation on the
effects of alcohol extract of Phyllanthi Fructus on apoptosis
of AGS cells
细胞的治疗开发应用提供实验依据，以人胃癌
AGS 细胞为研究对象，从增殖、凋亡的角度考察
了余甘子醇提物的体外抗肿瘤活性。本实验研究
结果发现 0.15 mg·mL1 的余甘子醇提物能够较明
显抑制胃癌细胞的生长，并使细胞形态学发生非
常明显的变化。集落法的实验结果也进一步证明
了余甘子醇提物对胃癌细胞的增殖具有一定的抑
制作用。除增殖抑制以外，Hoechst 试验、Annexin
V/PI 实验的结果也表明经余甘子醇提物作用后，
极大促进了胃癌细胞的凋亡，余甘子醇提物能够
抑制与肿瘤发生发展密切相关的生物学行为。关
于中药余甘子对诱导人胃癌细胞的凋亡机制须进
一步深入研究。
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收稿日期：2015-12-06



乙酰半胱氨酸活性炭微囊对肝纤维化大鼠的保护作用

方红英，庄让笑，席建军，王福根，孙晶晶，潘旭旺，史婷婷(浙江中医药大学附属杭州西溪医院，杭州 310023)

摘要：目的 初步研究乙酰半胱氨酸活性炭微囊(activated carbon N-acetylcysteine microcapsule，ACNAC)对肝纤维化模型
大鼠保护作用。方法 以二甲基亚硝胺建立 SD 大鼠肝纤维化模型，ACNAC 按剂量 20，40，80 mg·kg1(按乙酰半胱氨酸
计算)每日分别灌胃进行治疗，8 周后处死大鼠，检测各组大鼠血清学 ALT、AST 指标，肝组织 TGF-β1 指标。结果 病
理结果显示肝纤维化造模处于Ⅲ-Ⅳ期；与模型组比较，各药物治疗组血清 ALT、AST 有明显好转，且肝组织 TGF-β1 的

基金项目：杭州市科技计划项目(20110833B17，20130633B09)
作者简介：方红英，女，副主任药师 Tel: (0571)85463955 E-mail: fhyzj88@126.com