全 文 ：收稿日期:2014-05-06
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81160188);包头市科技计划项目(BK2008123)
作者简介:刘海艳(1983-),女,硕士,主治医师,主要从事消化系统疾病研究。
*通讯作者:穆永旭,E-mail:myongxu702@126.com。
蝙蝠葛酚性碱抑制胃癌 MGC-803细胞增殖
及对EGFR和HER-2表达的影响
刘海艳1,穆永旭1,2*,闫瑞强1,刘鹤鸣1,2
(1.包头医学院第一附属医院介入科,内蒙古 包头014010;2.西安交通大学医学院,陕西 西安710061)
摘要 目的:研究蝙蝠葛酚性碱对胃癌细胞株 MGC-803增殖的抑制作用以及对表皮生长因子受体(EGFR)和
人类表皮生长因子受体2(HER-2)表达的影响以探讨其抗癌机制。方法:采用 MTT法检测不同时间点不同浓度
蝙蝠葛酚性碱对MGC-803细胞增殖的抑制作用,采用流式细胞仪检测不同时间点不同浓度蝙蝠葛酚性碱对MGC-
803细胞周期及对EGFR、HER-2表达的影响。结果:蝙蝠葛酚性碱10~160μg/mL作用24、48h均可抑制胃癌细
胞株 MGC-803的增殖;蝙蝠葛酚性碱20~80μg/mL作用24、48h可阻滞细胞于S期,诱导细胞凋亡率升高,并显
著抑制胃癌细胞株 MGC-803中EGFR和 HER-2的表达。结论:蝙蝠葛酚性碱可显著抑制胃癌 MGC-803细胞的
增殖,其作用机制可能与下调EGFR和 HER-2的表达有关。
关键词 蝙蝠葛酚性碱;胃癌;表皮生长因子受体
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)09-1656-04
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.09.038
胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,每
年新诊断的癌症病例数中胃癌居第四〔1〕,并且在全
球范围内胃癌建所导致的死亡居癌症死亡率之
首〔2〕。在我国胃癌的发病率位居第2,为33.68/10
万〔3,4〕。胃癌侵袭性强且易于转移,目前除手术治
疗外,尚无其他好的治疗方法,研制治疗胃癌药物成
为新药研发的难点。蝙蝠葛酚性碱是防己科植物北
豆根的主要有效成分,包括蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林
碱〔4〕。据报道,蝙蝠葛酚性碱对人肿瘤细胞株PC-3
和BT5637、血病细胞株K562、人胰腺癌细胞株BX-
PC-3等均有抑制作用〔5,6〕。表皮生长因子受体(Ep-
idermalgrowthfactorreceptor,EGFR)和人类表皮
生长因子受体2(Humanepithelialgrowthfactor
receptor2,HER-2)的异常表达与恶性肿瘤的增殖
密切相关。本实验研究蝙蝠葛酚性碱对胃癌细胞株
MGC-803的抑制作用,并通过蝙蝠葛酚性碱对胃癌
细胞株 MGC-803中EGFR和和 HER-2表达的影
响以探讨其抗癌机制。
1 材料与仪器
1.1 细胞株 人胃癌细胞株 MGC-803,由中国医
学科学院上海生命科学院提供。培养液为含10%
胎牛血清、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素
的RPMI-1640培养液。将细胞置于37℃、5%CO2
恒温恒湿培养箱中培养24h,传代后待用。
1.2 药品与试剂 蝙蝠葛酚性碱,购自由中国医学
科学院昆明植物研究所,质量分数98.0%,用DM-
SO溶解(DMSO终体积分数≤0.1%)得1.6mg/
mL原液,微孔滤膜过滤除菌,-20℃冰箱保存待
用;5-氟尿嘧啶(5-Fu),天津金耀氨基酸有限公司产
品;RPMI-1640培养基,由美国Gibco公司提供;四
甲基偶氮唑盐(MTT)和DMSO,美国Sigma公司
产品;胎牛血清、胰蛋白酶,均为北京华美公司产品;
FITC-EGFR、FITC-HER2,美国 Becton-Dickinson
公司产品。
1.3 主要仪器 NAPCOseries5400CO2 培养箱,
美国Nuair公司产品;Elx酶标仪,奥地利TECAN
公司产品;EPICSXL流式细胞仪,美国COULTER
公司产品。
2 方法
2.1 蝙蝠葛酚性碱对细胞增殖的抑制作用 将对
数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化,用培养液调
制成5×104/mL的细胞悬液,接种于96孔板(100
μL/孔),置37℃、5%CO2 恒温恒湿培养箱中培养
24h,吸出原培养液,分别加入蝙蝠葛酚性碱使其终
浓度为10、20、40、80、160μg/mL的新鲜培养液,同
时PBS为阴性对照组和5-氟尿嘧啶(5-Fu)对照组。
各组细胞分别孵育24h或48h,分别加入5mg/
mLMTT溶液20μL,孵育4h,弃上清液,加DM-
SO150μL,振荡溶解15min,即可用酶标仪测定
570nm处光密度D(λ)值。
细胞生长抑制率(%)=
1-D(λ)实验组
D(λ)空白对照组×100%
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网络出版时间：2014-10-21 15:17
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2.2 蝙蝠葛酚性碱对细胞周期的影响 将对数生长
期细胞用0.25%胰蛋白酶消化,用培养液调制成5×
104/mL的细胞悬液,接种于96孔板(100μL/孔),置
37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱中培养24h,吸出原培
养液,分别加入蝙蝠葛酚性碱使其终浓度为20、40、80
μg/mL的新鲜培养液,孵育24或48h收集细胞,用4
℃预冷的PBS洗涤细胞3次,然后离心弃去PBS液,加
入-20℃ 预冷的无水乙醇固定6h后离心弃去固定
液,再用-4℃预冷的PBS洗涤细胞1次,弃去PBS液
后,加入150μLRNA酶及150μLPI染液,轻轻混匀
后,置于4℃环境中避光孵育。同时以PBS为阴性对
照进行相同操作,每组均设6个复孔。30min后采用
流式细胞仪进行检测,应用Celquest软件分析细胞凋
亡率和细胞周期。
2.3 蝙蝠葛酚性碱对EGFR和HER-2表达的影响
EGFR和HER-2的测定应用流式细胞术(Flowcytom-
etry,FCM)通过间接免疫荧光标记方法进行。将对数
生长期胃癌细胞株MGC-803经0.25%胰蛋白酶消化,
用RPMI-1640培养液调制成5×104/mL的细胞悬液,
加入蝙蝠葛酚性碱使其终浓度为20、40、80μg/mL,孵
育24或48h,PBS冲洗,加入无水乙醇固定、封闭,然后
加入FITC-EGFR或FITC-HER-2孵育后在荧光显微
镜下进行检测。同时以PBS为阴性对照进行相同操
作,每组均设6个复孔。以荧光强度表示各组蛋白的
含量。
2.4 统计学处理 所有结果均以􀭵x±s表示,采用
SPSS13.0统计软件进行数据分析,P<0.05为差异有
统计学意义。
3 结果
3.1 蝙蝠葛酚性碱对人胃癌细胞株MGC-803细胞增
殖的影响 结果如表1所示,蝙蝠葛酚性碱10~160
μg/mL作用24、48h均能显著抑制人胃癌细胞株
MGC-803的增殖(P<0.01)。
表1 蝙蝠葛酚性碱对人胃癌细胞株 MGC-803细胞增殖的影响(􀭵x±s,n=6)
组别 浓度/(μg/mL)
24h 48h
D(λ)值 抑制率/% D(λ)值 抑制率/%
阴性对照组 - 0.21±0.01 - 0.31±0.02 -
5-Fu组 10 0.14±0.01* 33.3 0.19±0.01* 38.7
蝙蝠葛酚性碱组 10 0.16±0.01* 23.8 0.23±0.02* 25.8
20 0.12±0.02* 42.8 0.16±0.02* 48.4
40 0.08±0.01* 61.9 0.11±0.01* 64.5
80 0.07±0.02* 67.7 0.09±0.01* 71.0
160 0.06±0.01* 71.4 0.08±0.01* 74.2
注:与阴性对照组比较,*P<0.01
3.2 蝙蝠葛酚性碱对细胞周期及细胞凋亡的影响
结果如表2、3所示,蝙蝠葛酚性碱20、40、80μg/
mL与胃癌细胞株 MGC-803共同培养24、48h均
可使胃癌细胞株 MGC-803细胞周期发生明显改
变,使G0/G1期比例显著降低(P<0.01),S期比例
显著升高(P<0.01),G2/M 比例无明显变化,以二
倍体峰(G0/G1)前出现亚G1峰表示凋亡细胞峰位;
根据其分布组方图计算细胞凋亡率,细胞凋亡率显
著升高(P<0.01)。
3.3 蝙蝠葛酚性碱对人胃癌细胞株 MGC-803中
EGFR和HER-2表达的影响 结果如表4所示,蝙
蝠葛酚性碱浓度为20、40、80μg/mL与胃癌细胞株
MGC-803共同培养24、48h时均能显著抑制胃癌
细胞株 MGC-803中EGFR及 HER-2的表达(P<
0.01)。
4 讨论
胃癌为全球四大恶性肿瘤之一,每年新增
900000个病例〔7〕。胃癌发病一般无明显特异性,很
表2 蝙蝠葛酚性碱对胃癌 MGC-803细胞周期的影响(%,􀭵x±s,n=6)
组别
浓度/
(μg/mL)
24h 48h
G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M
阴性对照组 - 65.19±1.48 33.20±1.17 1.52±0.24 71.28±1.52 26.85±1.23 1.83±0.27
蝙蝠葛酚性碱组 20 57.45±1.52* 41.25±1.28* 1.32±0.19 64.57±1.56* 33.64±1.28*1.76±0.25
40 53.72±1.39* 45.00±1.32* 1.27±0.21 59.31±1.47* 39.11±1.24*1.64±0.21
80 48.37±1.61* 50.23±1.25* 1.35±0.25 56.47±1.44* 41.83±1.19*1.68±0.23
注:与阴性对照组比较,*P<0.01
·7561·JournalofChineseMedicinalMaterials 第37卷第9期2014年9月
表3 蝙蝠葛酚性碱对胃癌 MGC-803细胞
凋亡率的影响(􀭵x±s,n=6)
组别
浓度/
(μg/mL)
24h 48h
阴性对照组 - 1.12±0.27* 1.45±0.32
蝙蝠葛酚性碱组 20 2.48±0.31* 4.53±0.31*
40 7.23±0.67* 11.41±0.93*
80 16.32±0.73* 19.76±1.27*
注:与阴性对照组比较,*P<0.01
多患者确诊时已经发展为中晚期,失去手术机会。
常规化疗药物由于毒副作用较大,在临床上应用受
到限制,毒性小、副作用少的抗胃癌药物为研发的方
向。中药在抗肿瘤方面有独特的优势而日益受到重
视,从中药中寻找和筛选抗癌药物已引起世界各国
的关注,并且取得较大的进步。
北豆根为防己科植物蝙蝠葛的干燥根茎,近年
来研究发现北豆根具有抗肿瘤作用,能诱导肿瘤细
表4 蝙蝠葛酚性碱对人胃癌细胞株 MGC-803中EGFR和HER-2表达的影响(􀭵x±s,n=6)
组别 浓度/(μg/mL)
EGFR HER-2
24h 48h 培养24h 培养48h
阴性对照组 - 16.48±1.52 21.32±2.26 7.24±0.83 11.89±1.14
蝙蝠葛酚性碱组 20 12.53±1.24* 14.62±1.53* 5.36±0.78* 8.94±0.94*
40 9.28±1.36* 11.45±0.97* 3.48±0.72* 5.73±0.67*
80 7.53±1.26* 8.43±0.72* 2.36±0.35* 3.25±0.39*
注:与阴性对照组比较,*P<0.01
胞凋亡,并有免疫调节作用。北豆根主要有效成分
为蝙蝠葛酚性碱,包括蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱,已
有多篇文献报道蝙蝠葛酚性碱对不同肿瘤细胞具有
抑制作用〔5,6〕。目前未见蝙蝠葛酚性碱对胃癌
MGC-803作用的报道。本实验采用 MTT法观察
蝙蝠葛酚性碱对胃癌 MGC-803体外增殖的抑制作
用,结果显示蝙蝠葛酚性碱10、20、40、80、160μg/
mL时对胃癌 MGC-803生长具有显著的抑制作用
(P<0.01),且随着蝙蝠葛酚性碱浓度的升高,其抑
制作用增强。此外各浓度蝙蝠葛酚性碱作用48h
对胃癌 MGC-803生长的抑制作用强于作用24h的
抑制作用表现显著的浓度和时间依赖性。20、40、80
μg/mL蝙蝠葛酚性碱可使胃癌细胞株 MGC-803细
胞G0/G1期DNA含量显著降低,S期DNA含量显
著增加,使胃癌细胞株 MGC-803出现明显的S期
阻滞。
EGFR是一种位于细胞膜上的酪氨酸激酶受
体,生理情况下EGFR与其配体结合后通过自身磷
酸化介导细胞内一系列的生长信号,诱导细胞正常
分裂、促进细胞分化等〔8,9〕。EGFR表达异常与肿瘤
细胞增殖、黏附、诱导肿瘤新生血管形成等关系密
切,是肿瘤细胞增殖、分化和抗凋亡过程中的重要调
节因子,已经成为抗肿瘤分子靶向研究中最为关注
的治疗靶点之一〔10〕。EGFR的检测可作为胃癌发
生发展和浸润、转移程度及预后判断的一个重要指
标,EGFR的过度表达常预示患者预后差、转移快、
对放化疗抗拒、激素耐药、生存时间较短等〔11〕。
HER-2是表皮生长因子受体家族的一个成员,又称
ErbB受体家族。HER-2和EGFR有近50%的同
源性,在结构和功能上均相似,可接受表皮生长因子
样物质的信息,刺激细胞增殖,具有酪氨酸激酶的活
性〔12〕。当受到体内外某些因素作用后,其结构或表
达调控失常从而被激活,具有肿瘤转化活性,通过下
游信号的转导参与肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润及转移
等的调控〔13〕。HER-2的过表达与肿瘤患者不良总
体预后相关,可作为胃癌预后指标、治疗反应预测指
标和治疗靶点,已成为国际肿瘤生物治疗的热
点〔14〕。本实验结果显示,20、40、80μg/mL蝙蝠葛
酚性碱作用24、48h均可显著抑制胃癌 MGC-803
细胞中EGFR和 HER-2的表达,提示蝙蝠葛酚性
碱对胃癌 MGC-803细胞的抑制可能通过抑制EG-
FR和HER-2发挥作用。但蝙蝠葛酚性碱的抗胃
癌活性还需在体内实验进行进一步验证。
综上所述,蝙蝠葛酚性碱可显著抑制胃癌
MGC-803细胞的增殖,其作用机制可能与下调EG-
FR和HER-2的表达有关。
参 考 文 献
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收稿日期:2014-03-13
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81373603)
作者简介:渠景连(1987-),女,在读博士研究生,专业方向:温病方药的临床应用及研究;Tel:13770714096,E-mail:qjldoctor2012@
gmail.com。
*通讯作者:龚婕宁,Tel:13901580022,E-mail:wbgongjiening@163.com。
养肺活血方对肺纤维化大鼠肺组织水通道
蛋白、黏附分子表达的影响
渠景连1,郭 海2,龚婕宁1*,辛丽丽1,陈 惠1
(1.南京中医药大学基础医学院,江苏 南京210023;2.南京医科大学附属淮安第一医院肿瘤中心,江苏
淮安223300)
摘要 目的:探讨养肺活血方对平阳霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织水通道蛋白、黏附分子表达的影响。方法:
将40只大鼠随机分为假手术组、模型组、地塞米松组和养肺活血组4组,采用气管注入平阳霉素的方法建立大鼠
肺纤维化模型,造模术后第2天开始每天灌胃给药。假手术组和模型组予5‰羧甲基纤维素钠(CMC钠)溶液,地
塞米松组、养肺活血组分别予地塞米松蒸馏水溶液、养肺活血合剂。给药28d处死大鼠,取左肺组织,用免疫组化
SP法检测肺组织AQP1、AQP5、ICAM-1和VCAM-1。采用光学显微镜和ImageProPlus6.0测量并计算其平均
光密度(IOD)值。结果:模型组大鼠肺组织AQP1、AQP5表达显著低于假手术组(P<0.01),而ICAM-1、VCAM-1
表达显著高于假手术组(P<0.01)。与模型组比较,养肺活血组肺组织 AQP1、AQP5表达显著升高(P<0.01),
ICAM-1、VCAM-1表达显著降低(P<0.01);地塞米松组肺组织AQP5显著表达高于模型组(P<0.05),ICAM-1、
VCAM-1表达显著低于模型组(P<0.01,P<0.05),AQP1表达与模型组无显著性差异(P<0.05)。结论:上调肺
纤维化大鼠肺组织AQP1、AQP5表达和抑制ICAM-1、VCAM-1表达可能是养肺活血方减轻肺部炎症和抗纤维化
的作用机制之一。
关键词 肺纤维化;养肺活血方;水通道蛋白;黏附分子
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)09-1659-04
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.09.039
肺纤维化(Pulmuonaryfibrsis,PF)是多种因素
引起的弥漫性肺间质疾病,以弥漫性肺泡炎和肺泡
结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征。其发病机
制未明,临床缺乏特效药物,是目前医学研究的热
点。养肺活血方由江苏省名老中医王灿晖教授的验
方化裁而成,临床疗效可靠,且前期研究已证实该方
可减轻肺部炎症反应〔1〕,影响基因调控及TGF-β和
ERK1/2、NF-κB、VEGF信号转导而达到其防治肺
·9561·JournalofChineseMedicinalMaterials 第37卷第9期2014年9月