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荜拔酰胺通过调控PI3K/Akt信号通路促进胃癌BGC-823细胞p53表达的实验研究



全 文 :·论著·
荜拔酰胺通过调控PI3K/Akt信号通路促进
胃癌BGC-823细胞p53表达的实验研究*
温桂海1 王涛1 朱涛2
(1.邯郸市中心医院普外一科,河北 邯郸056001;2.四川大学华西医院,四川 成都610041)
  【摘要】 目的 研究荜拔酰胺对胃癌BGC-823细胞的抑制作用和对p53表达的调节作用及相关的分子机制。
方法 采用不同浓度的荜拔酰胺(0μM、2μM和20μM)对胃癌BGC-823细胞进行干预。在不同时间点(0h、24h和48h)
采用 MTT法对BGC-823细胞活性进行检测。干预48h后,采用qPCR对荜拔酰胺干预的BGC-823细胞p53mRNA表
达水平进行检测。采用western blot对荜拔酰胺干预的BGC-823细胞p53蛋白表达水平以及PI3K和Akt活化水平进
行检测。结果 采用不同浓度荜拔酰胺(0μM、2μM和20μM)对胃癌BGC-823细胞进行干预后,细胞活性呈时间依赖性
和浓度依赖性下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。荜拔酰胺干预48h后,胃癌BGC-823细胞p53mRNA和蛋白的
表达水平呈浓度依赖性增加而PI3K和Akt活化水平呈浓度依赖性降低,差异均存在统计学意义(P<0.05)。结论 研
究结果表明,荜拔酰胺可以通过下调PI3K/Akt信号通路的活化水平对胃癌BGC-823细胞的增殖产生显著抑制作用,并
发现该机制与促进抑癌基因p53的表达密切相关。
【关键词】 荜拔酰胺;胃癌;BGC-823细胞;p53;PI3K;Akt
【中图分类号】 R 735.2  【文献标志码】 A   doi:10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.003
Piperlongumine promotes p53expression via inactivation of PI3K/Akt signal
pathway in gastric cancer BGC-823cels
WEN Guihai 1,WANG Tao1,ZHU Tao2
(1.Department of The First General Surgery,Handan Central Hospital,Handan056001,Hebei,China;
2.West China Hospital,Sichuan University,Chengdu610000,China)
  【Objective】 To explore the anti-cancer property of piperlongumine(PL)in gastric cancer BGC-823cels and its
underlying molecular mechanism.Methods Three specific concentrations(0μM,2μM and 20μM)of PL were included in
current study.At different time points(0h,24hand 48h),the cel viabilities of gastric cancer BGC-823cels were calcu-
lated by MTT assay.Meanwhile,the mRNA expression of p53was measured by qPCR.Then,Western blot was per-
formed to analyze the protein expression of p53and the phosphorylation of PI3Kand Akt.Results Gastric cancer BGC-
823cels viabilities were dosage-dependently and time-dependently inhibited by PL.Meanwhile,after 48hours of admin-
istrations,our data figured out that p53expression was dosage-dependently up-regulated and the phosphorylation of PI3K
and Akt were dosage-dependently reduced by PL in gastric cancer BGC-823cels.Conclusion The anti-tumor property of
piperlongumine(PL)very likely results from up-regulation of p53through the inactivation of PI3K/Akt signal pathway in
gastric cancer BGC-823cels,provides the promising of the clinic use of piperlongumine in the treatment of gastric cancer
and other malignant tumors in future.
【Key words】 Piperlongumine;Gastric cancer;BGC-823cels;p53;PI3K;Akt
  基金项目:中国博士后科研基金(2014M552369)
  流行病学调查显示,近年来胃癌(gastric cancer)
的发病率虽有所降低,但其仍然是人类最常见的恶性
肿瘤之一,目前仍位居全球恶性肿瘤发病率的第4位
和肿瘤死亡人数的第2位[1-4]。国际癌症研究机构
(international agency for research on cancer,IARC)
2008年的调查发现胃癌的发病有明显的地域性,其中
东亚地区的韩国(62.2/10万人)、蒙古共和国(48.2/
10万人)、日本(46.8/10万人)和中国(41.3/10万人)
是胃癌发病率最高的区域[1-4]。临床研究显示胃癌的
病理类型以腺癌(adenocarcinomas)更为常见[1-4]。荜
·5431·西部医学2016年10月 第28卷第10期 Med J West China,October 2016,Vol.28,No.10
拔酰胺(piperlongumine,PL)是胡椒科植物荜茇
(Piper longum Linn.)、长 柄 胡 椒 (P.sylvaticum
Roxb)和瘤突胡椒(P.tuberculatum Jacq.)等的有效
药理成分,其主要在植物的根部含量较高[5-7]。目前多
个研究发现荜拔酰胺具有抑制炎症反应、抑制肿瘤细
胞增殖和分化等多种药理作用[5-7]。同时在对非小细
胞肺癌和白血病细胞的研究中证实荜拔酰胺的抗肿
瘤活性与调控PI3K/Akt信号通路密切相关[8,9]。本
文研究荜拔酰胺对胃癌BGC-823细胞的抑制作用和
对p53表达的调节作用及相关的分子机制。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料 PCR试剂盒购自北京百泰克
生物技术有限公司;MTT 试剂盒购买于美国 Pro-
mega公司;鼠抗人p53抗体、鼠抗人phospho-PI3K
抗体、鼠抗人PI3K抗体、鼠抗人phospho-Akt抗体、
鼠抗人Akt抗体和鼠抗人β-actin抗体购于美国San-
ta Cruz公司;小牛血清购买于美国Bovogen公司;荜
拔酰胺购买于美国Sigma公司;RPMI-1640培养基购
买于美国Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 胃癌BGC-823细胞常规接种在含
10%FBS、100g/L 青霉素、100g/L链霉素的 RPMI
1640培养液中,置于37℃、95%空气、5% CO2 孵箱内
培养。每48h换液、传代1次,取对数生长期细胞用
于实验。
1.2.2 细胞活性检测 取对数生长期细胞消化制成
单细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔接种100μL
约含5×103 个细胞。贴壁后无血清培养细胞16h至
24h,使细胞同步化。加入不同浓度(0μM、2μM 和
20μM)的荜拔酰胺,在37℃,5% CO2 条件下培养细
胞,未干预组作为对照组。使用 MTT比色试验对不
同时间点(0h、24h和48h)的细胞生长状态进行测定,
实验重复4次。对应时间点的细胞活性(%)= (OD
干预组/OD对照组)×100(%)[10]。
1.2.3 细胞GLUT1mRNA表达检测 按照试剂盒
说明书提取细胞总RNA,反转录为cDNA,以cDNA
为模板进行qPCR反应。p53正义5′-GAGGGATG
TTTGGGA GATGTAA-3′,反义5′-CCCTGGTTA
GTACGG TGAAGTG-3′;β-actin 正义:5′-TGGCA
TTGCCG ACAG GAT-3′,反义:5′-GCTCAGGAGG
AGCAATGATCT-3′。使用β-actin作为内参基因,
使用 2-△△CT 公式计算目的基因相对表达量。
ΔΔCt= (Ct,目标 -Ct,β-actin)干预组 - (Ct,目标 -
Ct,β-actin)对照组
[11]。
1.2.4 Western blot法检测细胞p53蛋白表达水平
以及PI3K和 Akt磷酸化水平 按照试剂盒操作要
求,首先提取细胞总蛋白,并进行聚丙烯酰胺凝胶电
泳(SDS-PAGE),然后转移至硝酸纤维素滤膜上,用脱
脂奶粉封闭1h,分别加入鼠抗人p53抗体、鼠抗人
phospho-PI3K 抗 体、鼠 抗 人 PI3K 抗 体、鼠 抗 人
phospho-Akt抗体、鼠抗人 Akt抗体和鼠抗人β-actin
抗体,4℃孵育过夜,洗膜后加入相应的辣根过氧化物
酶标记的二抗(1∶2000),用ECL进行显色,用凝胶成
像分析系统进行扫描[12]。
1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0进行单因素方差
分析,计量资料以均数±标准差表示。两样本均数多
重比较采用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MTT法结果分析 在不同浓度(0μM、2μM 和
20μM)荜拔酰胺(PL)干预后,采用 MTT法对不同时
间点(0h、24h和48h)胃癌BGC-823细胞活性进行检
测。与对照组细胞相比较,荜拔酰胺干预的胃癌
BGC-823细胞活性呈浓度依赖性和时间依赖性降低,
差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。
表1 MTT比色法测定胃癌BGC-823细胞活性(n=4,珔x±s)
Figure 1 Cel viabilities of gastric cancer BGC-823cels at different time
points
药物浓度
不同时间点
0h 24h 48h
0μM  100% 100% 100%
2μM  99.07±4.13  71.88±13.06① 51.29±7.16①
20μM  101.11±3.89  42.32±9.24①② 30.05±4.52①②
注:对应时间点与0μM 相比较①P<0.05,对应时间点与2μM 相比较
②P<0.05。
2.2 p53mRNA和蛋白的表达 给予胃癌BGC-823
细胞不同浓度(0μM、2μM 和20μM)荜拔酰胺(PL)干
预48h后,采用qPCR和 western blot法对BGC-823
细胞p53mRNA和蛋白的表达进行检测。与对照组
细胞相比较,给予荜拔酰胺干预的BGC-823细胞p53
mRNA和蛋白表达水平呈浓度依赖性增加,差异均有
统计学意义(P<0.05),见表2和图1。
表2 胃癌BGC-823细胞p53mRNA和蛋白表达水平以及PI3K和Akt
磷酸化水平(n=4,珔x±s)
Table 2 The mRNA and protein expression levels of p53and the phos-
phorylation of PI3Kand Akt in gastric cancer BGC-823cels
药物
浓度 p53mRNA  p53蛋白
PI3K磷酸化
水平
Akt磷酸化
水平
0μM  1  0.25±0.05  0.96±0.02  0.98±0.03
2μM  7.22±2.13①  0.48±0.15① 0.61±0.21①  0.56±0.18①
20μM 18.89±6.17①② 0.94±0.09①②0.37±0.04①② 0.41±0.09①②
注:与0μM相比较①P<0.05,②与2μM相比较P<0.05
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图1 胃癌BGC-823细胞p53蛋白表达的western blot结果
Figure 1 Western blot result of the protein expression of p53in gastric
cancer BGC-823cels
2.3 PI3K磷酸化水平 给予胃癌BGC-823细胞不
同浓度(0μM、2μM和20μM)荜拔酰胺(PL)干预48h
后,采用western blot法对BGC-823细胞PI3K磷酸
化水平(phospho-PI3K/PI3K)进行检测。与对照组细
胞相比较,荜拔酰胺干预的BGC-823细胞PI3K磷酸
化水平呈剂量依赖性下降,差异均有统计学意义(P<
0.05),见图2和表2。
图2 胃癌BGC-823细胞PI3K磷酸化的western blot结果
Figure 2 Western blot result of the phosphorylation of PI3Kin gastric
cancer BGC-823cels
2.4 Akt磷酸化水平 给予胃癌BGC-823细胞不同
浓度(0μM、2μM 和20μM)荜拔酰胺(PL)干预48h
后,采用western blot法对BGC-823细胞Akt磷酸化
水平(phospho-Akt/Akt)进行检测。与对照组细胞相
比较,荜拔酰胺干预的BGC-823细胞PI3K磷酸化水
平呈剂量依赖性下降,差异均有统计学意义(P<
0.05)。见图3和表2。
图3 胃癌BGC-823细胞Akt磷酸化的western blot结果
Figure 3 Western blot result of the phosphorylation of Akt in gastric
cancer BGC-823cels
3 讨论
胃癌(gastric cancer)作为消化系统最常见的恶性
肿瘤之一,在我国具有高发病率、高致死率和低治愈
率的特征[1~4]。临床和基础研究均证实幽门螺旋杆菌
感染(Helicobacter pylori infection)是最为重要的胃
癌发生的危险因素[2,13-14]。研究认为有幽门螺旋杆菌
感染与65%~80%的胃癌(即全球约660000例)发生
密切相关[2,13-14]。同时研究还发现使用抗菌素有效治
疗幽门螺旋杆菌感染可以显著降低胃癌的发病
率[2,13-14]。进一步研究显示幽门螺旋杆菌感染可以诱
导胃组织浅层的炎症反应和上皮细胞表型的改
变[2,13-14]。同时流行病学调查揭示吸烟、种族、饮食习
惯和经济状况以及地理环境等均与胃癌的发生有相
关性[2,13-14]。由于胃癌较高的发病率和较低的生存率
(大部分5年生存率均在20%左右),寻求新的治疗方
式和方法将具有重要的价值和意义[2,13-14]。
中草药荜茇主要用于腹泻、呕吐和消化不良的临
床治疗。荜拔酰胺(piperlongumine,PL)是中药胡椒
科植物荜茇(Piper longum Linn.)、长柄胡椒(P.syl-
vaticum Roxb)和瘤突胡椒(P.tuberculatum Jacq.)
等的有效药理成分[5-9]。近期的研究表明荜拔酰胺具
有抑制血小板凝集、抗细菌和真菌以及蠕虫、镇痛、抑
制炎症反应、抑制肿瘤细胞增殖、分化、浸润和转移等
多种生物学活性[15-18]。Sun LD等的研究发现荜拔酰
胺及其衍生物对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7
细胞表达的 NO、PGE2、iNOS以及COX-2等炎症分
子均有显著的抑制作用[15]。同时Son DJ等的研究发
现荜拔酰胺对于小鼠冠状动脉粥样硬化斑块的形成
有显著的抑制作用[16]。Jin HO等的研究显示荜拔酰
胺可以有效的抑制乳腺癌细胞的增殖[17]。Liu QR等
的实验揭示荜拔酰胺对胶质母细胞瘤LN229细胞和
U87MG细胞的增殖和侵袭有显著的抑制作用[18]。在
本研究中我们的数据显示与对照组未干预细胞相比
较,荜拔酰胺干预的胃癌BGC-823细胞活性呈浓度依
赖性和时间依赖性降低,差异均有统计学意义(P<
0.05)。该结果表明荜拔酰胺对胃癌BGC-823细胞的
增殖有显著的抑制作用。
目前大量的研究证实PI3K/Akt信号通路的过度
活化在包括非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌和
肝癌等恶性肿瘤细胞的增殖、分化、浸润以及血管生
成过程均扮演着重要的角色[19-21]。Boneli MA等的
研究 显 示 PI3K 抑 制 剂 NVP-BKM120 和 NVP-
BYL719均可有效的抑制肺鳞状细胞癌细胞上皮-间
质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)
过程及肿瘤细胞体外和体内增殖过程[19]。Ying J等
·7431·西部医学2016年10月 第28卷第10期 Med J West China,October 2016,Vol.28,No.10
对胃癌患者病理组织分析后发现 PI3K 和磷酸化
AKT的表达水平与患者肿瘤的神经和血管浸润、肿
瘤的大小以及淋巴结转移及其他组织器官转移等与
肿瘤分期和恶性程度相关的指标间具有正相关性[20]。
Tian F等的实验也证实防己诺林碱可以通过下调
PI3K/Akt信 号 通 路 的 活 化 水 平 有 效 抑 制 胃 癌
SGC7901细胞的增殖过程[21]。另一方面近期的研究
显示荜拔酰胺的生物活性与下调PI3K/Akt信号通路
的活化密切相关[8-9]。Wang F等通过在体和离体实
验显示荜拔酰胺对于非小细胞肺癌A549细胞的抑制
作用与下调PI3K/Akt信号通路的活化密切相关[8]。
在本实验中我们发现与对照组未干预细胞相比较,荜
拔酰胺干预的胃癌BGC-823细胞PI3K和 Akt磷酸
化水平呈剂量依赖性下降,差异均有统计学意义(P
均<0.05)。该结果表明荜拔酰胺可以有效下调胃癌
BGC-823细胞PI3K/Akt信号通路的活化。
此外由于PI3K/Akt信号通路对于重要抑癌基因
p53的表达具有关键调控作用[22-23]。本实验中我们对
p53的表达进行检测后发现与对照组未干预细胞相比
较,给予荜拔酰胺干预的BGC-823细胞p53mRNA
和蛋白表达水平呈浓度依赖性增加,差异均有统计学
意义(P 均<0.05)。该结果表明荜拔酰胺对于胃癌
BGC-823细胞p53的合成有促进作用。
4 结论
本研究表明,荜拔酰胺可以通过下调PI3K/Akt
信号通路对胃癌BGC-823细胞的增殖产生显著抑制
作用,并发现该机制与促进抑癌基因p53的表达密切
相关。
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(收稿日期:2015-10-08;编辑:陈舟贵)
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