全 文 ：第2 3卷第 2 2期
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中国矫形外科杂志
Orthopedic Journal of China
Vol. 23，No. 22
Nov. 2015
·基础研究·
接骨丹介导成骨细胞增殖促进骨折愈合的观察
翟献斌，吴方云
(山东省泰安市中医医院骨科，泰安市 271000)
摘 要:［目的］观察接骨丹对新西兰乳兔成骨细胞增殖的影响，探讨接骨丹促进骨折愈合的机制。［方法］普
通级新西兰大白乳兔，耳缘静脉空气栓塞处死，无菌条件下取颅盖骨，Ⅰ型胶原酶消化法获取成骨细胞并进行体外
培养、鉴定及传代。将鉴定后的第二代成骨细胞随机分为正常对照组及实验组，正常对照组应用正常兔血清培养，
实验组应用接骨丹含药血清培养，MTT法观测两组细胞的生长曲线;不同血清干预 48 h后，倒置显微镜观测接骨丹
对成骨细胞碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原表达的影响，Elisa 法观测接骨丹对成骨细胞培养上清液中骨钙素表达的影响。
［结果］Ⅰ型胶原酶消化法成功获取并建立成骨细胞体外培养体系，MTT观测显示实验组能够显著促进成骨细胞的
增殖，倒置显微镜观测实验组中碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原的表达要优于正常对照组，并能够促进成骨细胞分泌骨钙素。
［结论］接骨丹能够促进骨折的愈合，其机制可能与促进成骨细胞中碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨钙素的表达进而促
进成骨细胞增殖和分化有关。
关键词:接骨丹， 含药血清， 成骨细胞， 骨折愈合
中图分类号:Ｒ683 文献标志码:A 文章编号:1005 － 8478 (2015)22 － 2094 － 05
Bone － Joining Elixir mediated osteoblast proliferation could promote fracture healing∥ZHAI Xian-bin，WU Fang-
yun． Orthopaedic Department，the TCM Hospital，Taian 271000，China
Abstract:［Objective］To observe the Bone － Joining Elixir influence on osteoblasts proliferation of New Zealand newborn
rabbit，and to explore the mechanism of Bone － Joining Elixir promoting fracture healing．［Method］Conventional grade New
Zealand white newborn rabbit were sacrificed by ear venous air embolism，craniums was taken in aseptic conditions，and osteo-
blasts was got by type Ⅰ collagenase digestion method for in vitro culture，identification of osteoblasts and and passages． After i-
dentification，the second generation of osteoblasts were randomly divided into normal control group and experimental group． In
the normal control group，normal rabbit serum was used for culturing，while in the experimental group Bone － Joining Elixir med-
icated serum was applied for culturing，MTT method were determined to observe the cell growth curve of the two groups． After 48
h intervention of different serum，the influence of Bone － Joining Elixir on osteoblast alkaline phosphatase was observed and the
expression of collagen typeⅠwas surveyed by inverted microscope，and osteocalcin expression of Bone － Joining Elixir on osteo-
blast culture supernatant was detected by ELISA．［Ｒesult］Type Ⅰcollagenase digestion method successfully established the os-
teoblasts cultrue system in vitro，MTT observation showed the experiment could significantly promote the proliferation of osteo-
blast，the inverted microscope observed alkaline phosphatase and the expression of collagen type Ⅰ in the experimental group
were superior to that of the normal control group，and could promote osteoblast secrete osteocalcin．［Conclusion］The Bone －
Joining Elixir can promote the healing of fracture，the mechanism may be related to promoting of the expression of osteoblast al-
kaline phosphatase，collagen type Ⅰ and osteocalcin，resulting in promoting proliferation and differentiation of osteoblasts．
Key words:bone － joining elixir， medicated serum， osteoblasts， fracture healing
DOI:10. 3977 / j. issn. 1005 － 8478. 2015. 22. 18
△基金项目:山东省中医药科技发展计划项目(编号:2011 － 284)
作者简介:翟献斌，副主任医师，研究方向:中西医结合治疗脊柱病，
(电话)18653840212，(电子信箱)13853880212@ 163. com
骨折是临床最常见的多发病，具有极其复杂的修
复过程，受诸多因素的影响，包括患者本身因素，医
源性因素等。从微观来看还受内分泌激素、生物化学
和生物物理因子的调控及微量元素的影响。临床流行
病学最新调查显示约 5% ～ 10%骨折可因各种原因发
生骨折迟缓愈合和不愈合，因此临床针对如何促进骨
折愈合、缩短愈合时间的研究方兴未艾。骨折属于祖
国医学“血瘀证”的范畴，而骨科疾病首载于 《黄帝
内经》，认为骨折耗损气血，致其运行不畅，淤积不
散，因此“活血化瘀”是治疗骨折的核心治则。
接骨丹具有“祛瘀、生新、合骨”的作用，亦是
治疗骨折的基本方剂，前期不乏研究证实接骨丹对骨
折的治疗具有理想疗效，但关于接骨丹促折愈合的机
理研究仍未明了，使得临床上应用接骨丹缺乏实验研
究基础，因此本研究旨在观察接骨丹对体外培养的新
西兰兔成骨细胞增殖分化的影响，从而为接骨丹治疗
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骨折提供基础数据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物 10 只普通级新西兰大白乳兔，雌
雄各半，体重 4. 1 ～ 5. 4 kg，平均 (4. 8 ± 0. 8)kg，购
自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号为
No. SCXK － (军)2007 － 004。
1. 1. 2 主要试剂 接骨丹 (规格 10g /包，由山东省
泰安市中医医院制剂室提供)并加工成每毫升含生药
0. 1 g的药液，密封 4℃保存备用;DMEM培养基 (美
国 Gibco公司);MTT (Sigma公司);山羊抗小鼠 IgG
标记二抗 (Biosharp 公司);DMSO (Sigma 公司);
ECL发光液 (碧云天);β － acting (博奥森);胰酶
(Biosharp公司);碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及 BGP单克
隆抗体 (北京中杉)。
1. 1. 3 含药血清的制备 换算人与动物的药物等效
剂量［1］，人与新西兰兔的折算系数 (周)为 6. 25，接
骨丹等效给药剂量 (g) =人体用药剂量 (g /kg) ×
周 ×新西兰兔的体重 (g) /1 000 g = (20 g /60 kg)
× 6. 25 ×新西兰兔体重 (g) /1 000 g。新西兰兔连续
灌胃 5 d，于最后一次灌胃后 3 h 腹主动脉采血，
2 500 r /min离心 25 min，于 56℃水浴灭活 30 min，过
滤、分装， － 20℃保存备用。
1. 1. 4 主要仪器 超净工作台 (苏州安泰公司);
CO2 培养箱 (日本 SANYO公司);倒置显微镜 (日本
OLYMPUS);酶标定量测定仪 (Thermo Multiskan As-
Cant公司);低温高速离心机 (美国 Sigma公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 成骨细胞分离、培养、纯化、传代 普通级
新西兰大白乳兔，耳缘静脉空气栓塞处死，无菌条件
下取颅盖骨后立即置于预冷的 0. 01 mol /L PBS 溶液
中，将结缔组织剔除干净后再次使用 0. 01 mol /L PBS
溶液清洗 3 次，随后将颅盖骨置于盛有 DMEM培养基
的培养皿中，用无菌剪刀将颅盖骨剪成大小约 0. 5
mm ×0. 5 mm的碎块，再加入 5 ml 0. 25%的胰酶消化
20 min，随后加入 5 ml 完全培养基 (10%胎牛血清)
终止消化，摒弃上清液后加入 10 mlⅠ型胶原酶，置
于 37℃、5%CO2 孵箱中孵育 90 min，随后离心 1 000
r /min × 3 min，弃去上清，再用 0. 01 mol /L PBS 溶液
清洗 3 次后利用 200 目滤网过滤颅盖骨碎片，加入 5
ml完全培养基 (10%胎牛血清)，用巴士吸管轻轻吹
打，使细胞悬浮，接种于培养瓶中，置于 37℃、5%
CO2 孵箱中孵育，24 h 换液，以后隔天换液 1 次，弃
去没贴壁的细胞，继续培养，待细胞铺满瓶底 80%以
上时，以 0. 25%的胰酶消化传代，取第 2 代以后的细
胞用于实验。
1. 2. 2 成骨细胞鉴定 细胞进入对数生长期后接种
于干净无菌盖玻片上，正常培养，待细胞生长汇合率
达到 50% ～ 80%时弃去培养液，PBS 清洗 1 遍，丙
酮:甲醇 (1:1)室温固定 30min，3% H2O2 去离子
水室温孵育 10 min 封闭，用山羊血清室温孵育 30
min，滴加一抗 4℃孵育过夜，滴加山羊抗小鼠 IgG 标
记二抗 37℃孵育 30 min，避光，随后置于倒置显微镜
下观察。每步操作之间均用 PBS洗 3 × 5 min。
1. 2. 3 MTT法测细胞增殖情况 将处于对数生长期
的细胞密度调整为 2 × 104 个 / ml，接种于 24 孔板，
37℃5%CO2 培养箱培养，将实验分为正常组及实验
组，各组 6 个复孔，24 h后用培养基进行同步消化 24
h。正常对照组:给予不含药 DMEM 完全培养液;实
验组:用体积分数为 10%的接骨丹含药血清的 DMEM
完全培养液，分别于加药 1 ～ 10 d后，每孔加入 20 μl
5g /L MTT，继续孵育 4 h 后，吸弃上清，每孔加入
DMSO 150 μl，振荡 10 min，酶标仪在 490 nm 波长处
读取 OD值。
1. 2. 4 碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原表达情况 将处于对
数生长期的细胞密度调整为 2 × 104 个 / ml后制成细胞
涂片，4%多聚甲醛 40℃固定过夜，0. 01 mol /L PBS
充分冲洗、晾干，3% H2O2 室温孵育 20 min，0. 01
mol /L PBS冲洗，滴加 30 μl /片羊血清封闭液，室温
30 min 后倾去，滴加 1:100 稀释的一抗 30 μl /片
(0. 01 mol /L PBS 稀释)，置湿盒内 4℃ 过夜，0. 01
mol /L PBS洗 (5 min × 3)，滴加 1:200 稀释的生物
素化二抗 30 μl /片 (0. 01 mol /L PBS 稀释)，37℃湿
盒内温育 30 min，0. 01 mol /L PBS洗 (5 min × 3)，加
辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素 30 μl /片，37℃孵
育 30 min，0. 01 mol /L PBS 洗 (5 min × 3)，DAB 显
色，镜下观察显色后充分水洗，常规脱水、透明、中
性树胶封片，随后置于倒置显微镜下观察。
1. 2. 5 骨钙素 (BGP)的表达情况 干预成骨细胞
48 h后，将收集的细胞在 4℃条件下进行 3 000 × g 离
心 5 min后用高压枪头吸取离心后的上清液，使用酶
联免疫吸附试验 (ELISA)进行检测，利用抗原、抗
体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合原
理进行相关因子浓度的检测，具体步骤如下:用 0. 05
mol /L pH9. 6 碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质
含量为 1 ～ 10 μg /ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中
加 0. 1 ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤
缓冲液洗 3 次，每次 3min。加一定稀释的待检样品
0. 1 ml于上述已包被之反应孔中，置 37℃孵育 1 h。
然后洗涤。同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照
孔。随后在各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体 (经
滴定后的稀释度)0. 1 ml。37℃孵育 0. 5 ～ 1 h，洗涤。
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再于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0. 1
ml，37℃10 ～ 30 min，于各反应孔中加入 2 mol /L 硫
酸 0. 05 ml。试剂盒由广州达安基因股份有限公司提
供，显色后采用 492 nm 波长，TMB 反应产物检测需
要 450 nm波长。检测时一定要首先进行空白孔系统
调零，用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔
平均值的比值 (P /N)表示。以空白对照孔调零后测
各孔 OD值，若大于规定的阴性对照 OD 值的 2. 1 倍，
即为阳性。操作过程全部按照试剂盒说明书进行检
测。
1. 3 统计学方法
采用 SPSS 17. 0 单因素方差分析 (One － Way
ANOVA)，各组数据均用 珋x ± s表示，各组所得数据与
正常组比较，计量资料符合正态分布，P ＜ 0. 05 为差
异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 成骨细胞的培养与鉴定
分离的成骨细胞在培养 24 h 后，活细胞贴壁生
长，死细胞悬浮在培养液中。培养第 5 d，骨膜成骨
细胞成放射状贴壁生长，形态多为梭形和多边形，核
内可见两三个核仁，轮廓清晰，饱满透明，立体感
强，培养 10 d左右基本铺满整个瓶底 (图 1)。
2. 2 接骨丹含药血清对成骨细胞增殖的影响
MTT法检测发现:加入接骨丹含药血清培养后对
成骨细胞具有明显的增殖作用，且呈现一定的时间依
赖性 (图 2)。
图 1 第 2 代成骨细胞的镜下形态 a:第 2 代成骨细胞
(100 ×) b:第 2 代成骨细胞 (200 ×) 图 2 接骨
丹对成骨细胞增殖的影响
2. 3 接骨丹含药血清对成骨细胞中Ⅰ型胶原表达的
影响
免疫组化染色显示，正常对照组及实验组中成骨
细胞胞浆均呈棕黄色，其中可见黄褐色颗粒，细胞外
也可见到棕黄色染色。与正常对照组比较，实验组中
成骨细胞不仅数量增多，而且经免疫组化染色后其阳
性表达颜色变深 (图 3)。
2. 4 接骨丹含药血清对成骨细胞中碱性磷酸酶表达
的影响
免疫组化染色显示，正常对照组及实验组中成骨
细胞中均有灰黑至深黑色的颗粒状或片状沉淀。与正
常对照组比较，实验组中成骨细胞不仅数量增多，而
且经免疫组化染色后其阳性表达颜色变深 (图 4)。
2. 5 接骨丹含药血清对成骨细胞中 BGP表达的影响
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采用 Elisa 法检测成骨细胞培养上清液中骨钙素
的表达，研究结果表明两组细胞上清液中均有骨钙素
的表达，与正常对照组相比，实验组骨钙素的表达明
显增高 (P ＜ 0. 05)(图 5)。
图 3 Ⅰ型胶原免疫组化染色 (200 ×) a:实验组
b:正常对照组 图 4 碱性磷酸酶疫组化染色 (200
×) a:实验组 b:正常对照组 图 5 48 h时各组
成骨细胞培养上清液中骨钙素表达的比较 2 为实验组
成骨细胞培养上清液中骨钙素蛋白表达柱状图，与正常
对照组比较 a:P ＜ 0. 05 1:正常对照组 2:实验组
3 讨 论
自春秋战国时期起已有中医药治疗骨折的记载，
从中医学角度认为骨折的愈合经历 “瘀去、新生、骨
合”三个环节，在整体观和辨证论治的指导下中医强
调综合运用整复、外固定、练功及内外用药综合运
用，此四大疗法随着现代医学进步而不断更新，其中
内外用药已然成为各医家研究的重点［2 － 3］。中医理论
认为肝主筋，肾主骨生髓，骨的生长愈合依赖精血的
濡养，肝肾亏虚可导致骨生化无源，筋骨失养，而筋
骨断损容易伤及肝肾，补肝益肾是促进骨折愈合的重
点。接骨丹主要成分补碎骨、续断及杜仲均是补肝益
肾之良药，共奏接骨续筋之功;龟板、熟地滋阴降
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火，补肾健骨;自然铜接骨续筋;土鳖虫、乳香、没
药活血祛瘀止痛合为臣药;云苓、白术、陈皮健脾和
胃为佐使药。现代药理检测发现骨碎补具有促进蛋白
多糖合成的效应，而蛋白多糖是促进钙化的主要因
子，其通过加速钙磷沉积促进骨的生长发育［4］;二氧
化硫是自然铜的主要成分，可加速骨痂形成及增强骨
的抗撕力;有研究人员通过透射电镜发现土鳖虫提取
物可以促进组织血管新生，促进骨周围组织的血供，
促进肉芽组织的生长［5］。接骨丹全方实现活血养血、
接骨连筋通络的功效。
近年来不少学者基于中医理论体系，以现代科学
检测手段为媒介，从不同视角探讨中医药促进骨折愈
合的机理［6 ～ 11］。以往不少报道从病理切片、影像学、
血液流变学等宏观角度探讨干预手段促进骨折愈合的
机理，近些年，随着分子生物学的日益发展，使从细
胞水平探讨接骨丹作用机理成为可能。作者以成骨细
胞为研究对象，成骨细胞是一类具有多向分化能力的
间充质干细胞，它的分化是骨形成的关键环节，因此
促进成骨细胞的成骨功能是治疗骨折的基础。作者采
用 MTT法检测含有接骨丹血清对新西兰兔成骨细胞增
殖的影响发现加入接骨丹含药血清培养后对成骨细胞
具有明显的增殖作用，且呈现一定的时间依赖性。作
者检测了碱性磷酸酶在不同组别的表达，碱性磷酸酶
是一种公认的鉴定成骨细胞分化的重要表型之一，成
骨细胞分泌碱性磷酸酶可促使无机磷酸盐水解，从而
减轻其对骨盐抑制效应，有利于骨形成。随着成骨细
胞的不断分化，碱性磷酸酶表达不断增加，碱性磷酸
酶的活性越强预示着成骨细胞骨形成状况越理
想［12 ～ 15］。本研究证实虽然不同组别均有碱性磷酸酶
表达，但是经过含有接骨丹血清培养后的细胞碱性磷
酸酶表达更明显，且Ⅰ型胶原表达越高，说明接骨丹
可以通过促进碱性磷酸酶的合成、Ⅰ型胶原表达的增
加而发挥诱导成骨细胞增殖分化的作用。BGP 是一种
由成骨细胞合成和分泌的非胶原蛋白，其在调控软骨
矿化中发挥重要作用，研究中作者还发现含接骨丹血
清可上调成骨细胞 BGP的浓度，说明接骨丹提高了成
骨细胞的矿化能力，促使胶原钙化，从而达到增加骨
量的目的。
总之，接骨丹能够促进骨折的愈合，其机制可能
与促进成骨细胞中碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨钙素的
表达进而促进成骨细胞增殖和分化有关。
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