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超声波辐射对酶法制备椰子油脂肪酸甲酯的影响
龚本前，刘钟栋*
(河南工业大学粮油食品学院，郑州 450052)
摘 要:生物柴油作为可再生能源，是环境友好的生物燃料，作为石化柴油的替代品及补充品具有可再生、
易于降解、燃烧排放的污染物低、基本无温室效应等特点。本文利用超声辐射强化酯化制备生物柴油具有反应速度
快，产率高等优点，探讨了超声辐照对有机相中脂肪酶催化脂肪酸与甲醇酯化反应的促进作用。以蒸馏椰子油脂肪
酸、甲醇及 Novozym435脂肪酶为主要原料，研究了不同因素及超声辐射对酶法促进油脂脂肪酸甲酯化的影响。对
反应条件进行单因素实验，确定了最佳反应工艺参数。经分析初步得出脂肪酶催化甲酯化最佳条件为:酶用量 7%，
水加入量 10%，超声功率 250W，反应总时间 25min，2mL正己烷 /1g脂肪酸，甲醇与椰子油脂肪酸的摩尔比 2∶ 1。
在此条件下，脂肪酸甲酯转化率达到 90. 18%。
关键词:椰子油脂肪酸;超声波;固定化脂肪酶;转酯化反应;甲酯
中图分类号:TS201. 2 + 5 文献标识码:A 文章编号:1006 － 2513 (2011)06 － 0060 － 04
Effects of ultrasound radiation on coconut fatty
acid methyl esters preparation by enzyme
GONG Ben-qian，LIU Zhong-dong*
(College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，ZhengZhou 450052)
Abstract:Biodiesel，a renewable energy，is environmental friendly． As the substitute and supplement for petroleum，
biodiesel has many advantages，such as renewable，easily degradation，low of the combustion emissions and almost no
greenhouse effect． In this paper ultrasonic radiation was used in esterifying synthesis biodiesel． The reaction was fast
and yield was high． Ultrasonic radiation can assist lipase catalyzed ester synthesis by fatty acid and methanol in organic
medium． Effects of different factors and ultrasound radiation on coconut fatty acid methyl esters preparation by enzyme
were studied． Coconut fatty acid，ethanol and lipozyme Novozym435 were the major raw material． The single factor is
used in optimizing the parameters． The best condition was:enzyme 7% (mass fraction based on oil) ;water 10%
(mass fraction based on oil) ;ultrasonic power 250W;the total reaction time 25min;n-hexane，2mL /g oil;molar ra-
tion of ethanol to coconut fatty acid 2∶ 1． The transesterification yield of 90． 18% was obtained under the optimum con-
ditions．
Keywords:coconut fatty acid;ultrasound wave;lipase immobilization;transesterifi-cation;methylesters
生物柴油 (脂肪酸甲酯)是一种绿色能源，
作为石化柴油的替代品及补充品具有可再生、易
于降解、燃烧排放的污染物底、基本无温室效应
等特点［1 － 2］。目前生物柴油主要采用化学酯化法
生产，即采用化学试剂，如浓硫酸、氢氧化钠等
酸碱作为催化剂，催化脂肪酸、甘油酯与甲醇反
应生成脂肪酸甲酯［3］。但化学法污染大，能耗
高，酯化产物难于回收，成本高，且生产过程有
废酸碱液排放。为解决上述问题，人们开始研究
用生物酶法合成生物柴油，酶法合成生物柴油具
有条件温和、醇用量小、无污染排放等优点，但
目前主要问题之一是:对甲醇及乙醇的转化率较
低［4 － 5］。
收稿日期:2011 － 07 － 11 * 通讯作者
作者简介:龚本前 (1985 －) ，男，汉族，河南信阳人，硕士，研究方向为食品资源开发与利用
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1 材料与方法
1. 1 材料、仪器
1. 1. 1 材料
蒸馏椰子油脂肪酸，益海 (连云港)油化工
业有限公司惠赠;Novozym435 脂肪酶，诺维信
(中国)生物技术有限公司惠赠;甲醇，氢氧化
钾，正己烷，无水乙醇，酚酞均为分析纯。
1. 1. 2 仪器
XO － SM50 型超声波微波组合反应系统 (超
声频率 25KHz) ，南京先欧仪器制造有限公司;
GC2010 型气相色谱仪，日本岛津;FA1104 型分
析天平，精天电子仪器厂。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 椰子油脂肪酸甲酯的合成
将一定量的椰子油脂肪酸置于烧杯中，再按
具体实验所要求比例分别加入乙醇、正己烷、
水。将上述各种物质在磁力搅拌器上混合均匀，
将混合均匀的反应液及所需的脂肪酶转入专用反
应皿中，将反应皿置于超声微波组合反应系统
中，在进行反应。反应结束后将反应体系进行过
滤、分液、蒸馏分离乙醇、萃取、分液、干燥、
蒸馏，所得产品即为脂肪酸甲酯。
1. 2. 2 酯化率的测定
移取 200μL 样品，加入 10mL 无水乙醇终止
反应，以两滴 1% (v /v)酚酞为指示剂，用
0. 025mol /L的氢氧化钾溶液滴定反应体系剩余的
脂肪酸，通过测定体系在反应前、后酸值的降低
值确定酯化反应产率。
酯化率 (%) = (1 － v2 /v1) × 100
式中:v1┄┄为反应前的酸值，mgKOH /g
v2┄┄为反应后的酸值，mgKOH /g
1. 2. 3 气相色谱分析
采用 GC2010 型气相色谱仪分析产品中脂肪
酸甲酯的含量，其工作参数为:SGE 脂肪酸柱
(0. 25 mm × 120. 0 mm) ;FID 检测器;柱温:
180℃;进 样 口 温 度: 210℃;检 测 器 温 度:
230℃;氢 气 流 量: 47. 0mL /min;空 气 流 量:
400mL /min;柱 流 量: 1. 0mL /min;分 流 比:
1:20;进样量:0. 5μL。
2 结果与讨论
2. 1 加酶量对酯化率的影响
在生物酶催化油脂脂肪酸与甲醇酯化反应
中，固定化脂肪酶是最重要的催化效率最高的催
化剂。酶用量直接影响反应速度和转化率。酶剂
量越大，催化活性越强，剂量饱和后，由于酶促
反应界面的限制，再增加酶用量不会提高催化效
率。实验条件为外加水量 10% (水与脂肪酸质量
比) ，2mL 正己烷 /1g 脂肪酸，超声功率 250W，
反应总时间 25min (超声时间 2s，间隙时间 3s) ，
醇油摩尔比 6∶ 1，考察了 2% ～11% (酶质量与脂
肪酸质量比)酶用量，反应结果如图 1。
图 1 酶添加量对脂肪酸甲酯化产率的影响
图 1 表明，酶添加量对脂肪酸甲酯化产率有
着相当大的影响。当在反应体系中加入少量酶
(小于 7%)的情况下，随着酶添加量的增大，甲
酯产率逐渐增大，而且增大速度很快。当酶添加
量增大到 7%时，继续提高加酶量，甲酯的产率
变化幅度不大，从反应产率和经济方面综合考
虑，适宜的加酶量为椰子油脂肪酸质量的 7%。
2. 2 加水量对酯化率的影响
酶需要少量水保持其活性三维构象。酶周围的
水能降低酶分子中极性氨基酸的相互作用，防止产
生不准确构象结构。酶分子周围水化层作为酶表面
和反应介质之间的缓冲剂，它是酶微环境主要成
分。有机溶剂酶含水量低于最适水含量时酶构象过
于“刚性”而失去催化活性;含水量过高时，酶
结构柔性过大，酶的构象将向疏水环境热力学稳定
状态变化，引起酶结构改变和失活。只有在最适水
量时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间
达到平衡，酶才变现出最大活力。
实验条件为酶用量 7%，其他条件不变，实
验研究了不同外加水量对反应的影响，结果如图
2 所示。发现无外加水条件下，反应酯化率较低，
反应甲酯产率随反应外加水量升高而迅速增大，
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并在 10%外加水条件下出现极大值;继续增加外
加水量，反应甲酯产率开始下降。适量的水改变
了酶的活性中心的构象，水同时稀释了反应体系
中底物甲醇，降低了甲醇对酶的毒性。过量水的
加入引起了酶活性中心水簇形成，影响脂肪酶活
力，并造成固定化酶脱落，反应酯化率下降。确
定最佳水加入量为 10%。
图 2 外加水量对脂肪酸甲酯化产率的影响
2. 3 超声功率对酯化率的影响
超声既可能加速有机相酶反应，也可能使酶
变性失活，其对酶反应的影响如何，取决于超声
的强度。低频超声辐射对部分相容的液体体系有
着很好的乳化作用，被辐射体系会产生局部的高
温高压同时可以促进反应的进行。
实验条件为酶用量 7%，外加水量 10%，其他
条件不变，实验研究了不同超声功率对反应的影响，
结果如图2所示。超声功率在150W时，转化率达到
58. 93%，随着超声功率的增加，脂肪酸甲酯的酯化
率很明显的增加，在 250W 时酯化率出现极大值，
并且随着超声功率的增加，酯化率明显降低。这主
要因为超声功率较低时，醇油两相不能混合均匀，
反应体系仍呈分层状态，相界面处有微冲流现象，
反应进行的缓慢。而当功率增加时，醇油两相在超
声作用下，体系中介质分子振动速度增大，乳化效
果明显加强，醇油两相界面面积增大，使得反应速
度加快。功率过大时，固定化酶可能因为被强超声
辐射导致部分酶变性失活，最终导致相应的酯化率
很低。确定最佳超声功率为 250W。
图 3 超声功率对脂肪酸甲酯化产率的影响
2. 4 超声反应总时间对酯化率的影响
在实验条件为酶用量 7%，外加水量 10%，
超声功率 250W，其他条件不变，实验研究了不
同反应总时间对反应的影响，结果如图 4 所示。
图 4 超声反应总时间对脂肪酸甲酯化产率的影响
由图 4 表明，随着反应时间的延长，酯化率
开始逐渐增加，在反应进行到 25min 时，酯化率
达到最高，再随着时间延长反应酯化率降低。这
可能因为超声反应时间过长，固定化酶可能受到
超声辐射的影响，其活性有所降低。确定超声反
应总时间为 25min。
2. 5 溶剂正己烷加入量对酯化率的影响
溶剂可能与许多因素有关，如体系传质，反
应体系均质性，底物抑制等等。实验参考相关文
献［7 － 8］选择正己烷作有机溶剂。因此，对正己烷
作溶剂条件下的溶剂量进行优化。实验条件为酶
用量 7%，外加水量 10%，超声功率 250W，反应
总时间 25min，醇油摩尔比 6∶ 1，实验研究了不同
用量的正己烷对反应的影响，结果如图 5 所示。
图 5 溶剂正己烷加入量对脂肪酸甲酯化的影响
由图 5 表明，在无正己烷情况下反应的转化
率为 70%，随着溶剂量增大甲酯产率升高，并在
溶剂用量为 2mL /g时出现最大值。当体系中溶剂
量超过 2mL /g后，反应酯化率又有所降低。这种
现象说明反应体系中加入溶剂后，反应底物的浓
度降低，活动空间大，有利于与酶活性中心进行
立体定位接触，使反应转化率提高。但是底物浓
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度稀释到一定程度后，底物与酶的接触几率变
小，不利于反应的进行。确定 2mL 正己烷 /1g 脂
肪酸的比例为最佳溶剂比例。
2. 6 醇油摩尔比对酯化率的影响
在实验条件为酶用量 7%，外加水量 10%，
超声功率 250W，反应总时间 25min，2mL 正己烷
/1g脂肪酸，实验研究了不同醇油摩尔比对反应
的影响，结果如图 6 所示。
图 6 甲醇和脂肪酸摩尔比对脂肪酸甲酯化的影响
在利用不同醇油摩尔比进行反应时，如果甲醇
量不足，会使反应不完全，造成产率不高，但当甲
醇过量时，对固定化酶的催化转酯化反应有明显的
抑制作用，原因可能是过量的甲醇使酶的活性降低。
由图 6可以发现，当醇油摩尔比为 2∶ 1时，甲酯化
产率达到最高。这表明最佳醇油比为 2∶ 1。
2. 7 椰子油脂肪酸甲酯的气相色谱分析
将采用最佳工艺条件制得的椰子油脂肪酸甲
酯，气相色谱分析如图 7。由图 7 可见，1、2、3、
4、5、6、7、8、9号峰分别为正己烷、辛酸甲酯、
癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲
酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯的峰。
3 结论
实验结果表明，超声波辅助固定化酶合成脂
肪酸甲酯的最佳工艺条件为:固定化酶用量 7%
(占椰子油脂肪酸质量) ，外加水量 10% (占椰子
油脂肪酸质量) ，超声功率 250W，超声反应总时
图 7 超声辐射酶法合成的椰子油脂肪酸甲酯气相色谱图
间 25min (超声时间 2s，间隙时间 3s)，2mL正己烷
/1g脂肪酸，甲醇与椰子油脂肪酸摩尔比为2∶ 1。在
此条件下的脂肪酸甲酯最高，可以达到 90. 18%。
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(1) :
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