全 文 ：葎草 （Humulus scandens L.） 又名拉拉秧、 拉拉
藤， 大麻科 （Cannabaceae） 大麻亚科（Cannaboideae），
葎草属植物， 花单性， 花期 7-8 月， 果期 8-9 月，
雌雄异株， 其性别由基因平衡控制， 雌株染色体组
成是 2n=14+XX； 雄株是 2n=14+XY1Y2， 其性染色
体是最大的染色体 ［1，2］。 葎草染色体较大， 性染色
体易于区分， 取材方便， 是研究雌雄异株植物的有
利材料。
在雌雄异株植物中已找到了一些与已知基因连
锁的遗传标记， 包括形态学、 同工酶 ［3］和 DNA 分
子标记［4-7］， 而近年来的研究主要集中在分子水平。
S. Nakao等人用 RAPD 技术在白麦瓶草中发现一个
Y 染色体特异 DNA 片段， 并应用反向 PCR 对其侧
翼序列进行扩增发现了一个编码 285个氨基酸的开
放阅读框， 原位杂交表明这个序列在 Y 染色体上
是单拷贝的 。 Peil 等发现大麻 （Cannabis sativa）
的 Y染色体上有两个紧密连锁的 AFLP标记构成一
个 PAR （pseudoautosomal region） 区， 使得 X 与 Y
染色体之间发生一定程度的重组 ［8］。 Stehlik 等在叶
蓼 （Rumex nivalis L.） 中获得一个长度为 164bp 的
雄性特异性 AFLP 片段， 并将其转化为序列特异扩
增区域 （Sequence Characterized Amplified Regions，
SCAR） 标记， 此标记是位于 Y 染色体的串联重复
的非编码 DNA 序列。 在酸模 （Rumex acetosa） 中
发现的 Y 染色体特异序列之间存在较大的差异，
这与 Y 染色体的退化以及其进化过程中突变位点
积累的观点是相一致的， 符合 Y 染色体进化的理
论假设 ［10］。 Xu 等人在杜仲 （Eucommia ulmoides
Oliv.） 中发现一个雌性 RAPD 标记 MSDE， 并成功
转化为 SCAR 标记， MSDE 的 Southern 杂交也显示
是雌性特有的标记， 表明 MSDE 位于雌性基因组
特有的染色体区 ， 很可能与性别决定相关 ［11］。
Parasnis等用微卫星 （GATA）4 探针鉴定了番木瓜
（Carica papaya） 1 个 5kb 的特异带仅出现在雄株
中， 表明微卫星 （GATA）n可以鉴定其性别差异［12］。
这些分子标记的获得不仅对雌雄鉴别有重要作用，
同时对研究雌雄异株植物的性别决定与分化机制和
克隆与性别相关的基因具有重要理论意义。
本研究用随机引物扩增的 DNA 多态性技术对
与葎草性别相连锁的特异性片段进行了克隆和分
析， 为其性别决定、 性别分化以及性染色体进化机
制的研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
葎草 （Humulus scandens L.）， 取自河南师范
大学生物园地， 待葎草开花后， 分别取雌性、 雄性
各 10 株葎草的幼嫩叶片提取单株 DNA， 同时将雄
性、 雌性各 10 个单株的叶片等量混合后提 DNA，
分别组成雌、 雄 DNA池。 葎草 DNA提取方法参照
葎草雄性连锁的 RAPD标记的克隆与 SCAR标记的建立*
高武军 孙富从 尹为治 姬艳克 邓传良 卢龙斗 **
（河南师范大学生命科学学院， 河南 新乡 453007）
摘要 应用随机扩增的 DNA 多态性 （RAPD） 技术可以快速简便获得雌雄异株植物雌雄株间的基
因组差异信息， 本文采用该技术对葎草雌雄混合基因池进行了扩增， 在选用的 100 条 10bp 的随机
引物中， 引物 S1519 和 S2142 分别扩增出长度为 1207bp 和 762bp 的雄性连锁标记， 对其进行回
收克隆和测序后发现这两个片段富含 AT 序列， AT 含量分别为 64%、 54.7%， 经核苷酸数据库
BLAST 检索未发现其同源序列。 根据测序结果设计的 SCAR 引物可以将这两个雄性连锁的 RAPD
标记转化为稳定性和特异性更好的 SCAR标记。
关键词： 葎草 雄性连锁 RAPD SCAR
本文 2008 年 9 月 12 日收到。 2009 年 2 月 25 日接受。
**基金项目：河南省自然科学基金项目（0611030300）。
**通讯作者， E-mail： lld5910@yahoo.com
第 42 卷 第 3蛳 4 期 Vol． 42, No．3蛳 4
June 20092009年 6 月
分 子 细 胞 生 物 学 报
Journal of Molecular Cell Biology
42卷高武军 孙富从 尹为治 姬艳克 邓传良 卢龙斗
文献［13］进行。
1.2 RAPD标记扩增
用随机引物分别对葎草雌、 雄基因组 DNA 进
行 PCR 扩增。 反应体系为 10×扩增缓冲液 2.5 μl；
MgCl2 （ 25 mmol/L） 0.5 μl； dNTPs （ 10 mmol/L）
0.5 μl； 引物 （ 25 μmol/L） 0.5 μl， 模板 DNA
（1.25-20 ng/μl） 1 μl； TaqDNA 聚合酶 （2.5 U/μl）
0.3 μl； 加入 ddH2O 补齐到 25 μl。 PCR 反应程序
为 94 ℃预变性 5 min， 94 ℃变性 30 s， 36 ℃退火
45 s， 72 ℃延伸 90 s， 循环 45 次 ， 72 ℃延伸 7
min， 反应结束后 PCR 产物在 1.5％琼脂糖凝胶 5
V/cm 的电压下电泳 3 h 左右， 然后在紫外透射反
射仪中观察， 数码相机拍照分析。
用 100 个 10bp 的随机引物对雌性、 雄性 DNA
池进行筛选， 对筛选出来的随机引物再用雌性、 雄
性葎草的单株基因组 DNA 进行扩增， 筛选性别连
锁的特异性条带。 特异性条带的回收参照 UNIQ kit
（上海生工） 说明书； 感受态细胞的制备、 转化、
阳性克隆的筛选鉴定参照 Sambrook 等 ［14］； 样品送
交上海生工生物有限公司进行测序。
1.3 SCAR标记的引物设计及扩增
根据测序结果， 分别合成两对 24 个碱基的
SCAR引物 （见表 1）。
随机取雌雄葎草单株各 10 株 ， 以其基因组
DNA 为模板进行 PCR 扩增。 反应体系为 ddH2O17
μl， 10×扩增缓冲液 2.5 μl， dNTPs （10 mmol/L）
0.5 μl， 引物 F （25 μmol/L） 0.5 μl， 引物 R （25
μmol/L） 0.5μl， 模 板 DNA （ 25 ng/μl） 1.0μl ，
TaqDNA 聚合酶 （2.5 U/μl） 0.3 μl。 混匀并稍加离
心后， 按预变性 94 ℃， 5 min； 94 ℃， 30 s； 58 ℃
（60℃）， 45 s； 72 ℃， 90 s； 45 个循环； 最后延伸
72 ℃， 7 min 的程序进行 PCR 扩增。 1.5 %琼脂糖
凝胶电泳检测 PCR扩增结果。
2 结 果
2.1 性别连锁的 RAPD标记分析
表 1 葎草 SCAR 标记的构建
Table 1 SCAR markers constructed from two male-linked fragments in Humulus scandens L.
RAPD引物
RAPD primer
S2142
S1519
SCAR引物
SCAR primer
SEXS2142F
SEXS2142R
SEXS1519F
SEXS1519R
SCAR引物序列（5′-3′）
SCAR primer sequence
GTAAGCCGAG CTTGGGTTAA CCAC
GTAAGCCGAG GATAATGATT GATG
AGCCTCGGTT TCCCTATTTA TTTA
AGCCTCGGTT GGAGCTATAC GATA
退火温度
Annealing
58℃
60℃
图 1 随机引物扩增所得的雄性连锁片段
a. S2142 扩增所得的雄性连锁片段； b. S1519 扩增所得的雄性连锁片段。
Lane M：DNA 分子量标记（D514，TaKaRa）。 箭头示雄性连锁片段。
Fig.1 Male-linked DNA fragments produced by PCR with random primers
a. Male-linked DNA fragments produced by PCR with S2142； b. Male-linked DNA fragments produced by PCR with S1519.
Lanes M：Molecular size markers（D514, TaKaRa）. Arrows indicate male-linked fragments.
M M
762bp
1 207bp
a b
212
3蛳 4 期 葎草雄性连锁的 RAPD 标记的克隆与 SCAR 标记的建立
图 2 引物 S2142 扩增的雄性连锁片段 （762bp） 的测序结果
碱基加黑部分是 S2142 引物的序列； 划线部分是 SCAR 标记的引物序列。
Fig.2 Sequence of the male-linked fragment produced by PCR with S2142
The parts in which the letters are bold show the sequences of the primer S2142； the parts underlined show the
two primers of SCAR marker.
图 3 引物 S1519 扩增的雄性连锁片段 (1 207bp) 的测序结果
碱基加黑部分为引物 S1519 引物的序列； 划线部分为 SCAR 引物。
Fig. 3 Sequence of the male-linked fragment produced by PCR with S1519
The parts in which the letters are bold show the sequences of the primer S1519； the parts underlined show the
two primers of SCAR marker.
′ ′
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42卷高武军 孙富从 尹为治 姬艳克 邓传良 卢龙斗
选用的 100 个 10 bp 的随机引物中， 其中引物
S2142， S1519 分别扩增得到了一条雄性连锁片段
（图 1）， 为了验证实验的准确性， 用同样的方法进
行重复实验均得到了同样的结果。
2.2 RAPD标记的 DNA测序与序列分析
将扩增到的两个雄性连锁的 RAPD 标记进行
回收、 克隆， 经测序后得到其全序列 （图 2， 3）。
由 S2142 扩增得到的雄性连锁片段 （GenBank
EU882086） 序列长度为 762 bp， AT 含量为54.7%，
为一富含 AT 的序列。 由引物 S1519 扩增得到的
雄性连锁片段 （GenBank EU882085） 序列长度为
1 207bp， AT 含量为 64%， 也是一个富含 AT 的序
列。 经核苷酸 BLAST 检索， 两个序列均未发现有
同源序列。
2.3 SCAR标记分析及稳定性检测
根据获得的两个雄性连锁的 RAPD 标记的测
序结果， 设计了包含原随机引物 S2142和 S1519序
列的特异引物 （表 1）。 用合成的两对 24 个碱基的
特异性引物对随机筛选的雌雄各 10 株葎草进行
PCR 扩增， 结果表明， 两对引物均仅在雄性植株
中扩增到一条预期大小的条带， 在雌株中未扩增出
任何条带 （图 4）， 这说明用 S2142， S1519 扩增得
到的 RAPD 分子标记可以转化为重复性和特异性
更好的 SCAR分子标记。
3 讨 论
目前认为， 性染色体进化的方式有两种： 一种
是基因的退化［15］， 另一种可能的方式就是利于雄株
发育而不利于雌株发育的基因在 Y 染色体上的积
累 ［16］。 葎草雌株的性染色体组成为 XX； 雄株为
X1X2Y， 性染色体是最大的染色体， 形态特征明显，
可以作为性染色体进化研究的可靠材料。 葎草的 X
和 Y 染色体在形态大小上差别很大， 性染色体被
普遍认为是从常染色体分化而来的［17］， 所以相对于
X染色体前体来说， Y 染色体前体很可能是在体积
上迅速的扩增， 进而获得了某些功能上的特异性，
可是 Y 染色体上这些特异性的片段是怎么产生的，
这些特异性的片段在 Y 染色体上是怎么分布和如
何进化等等目前还不清楚。 相对于大规模的测序及
功能基因分离来说， 分子标记技术可以快速简便的
获得雌雄在基因组方面的差异信息， 为进一步的性
别决定机制的分析提供帮助。
真核生物的基因比较大， 开放阅读框比较大，
一般 100个氨基酸以上的开放阅读框才作为基因来
考虑， 并且真核基因内还有内含子序列， 本研究利
用分子标记技术所获得的两个雄性连锁 DNA 片段
通过 BLAST 检索也未发现其同源序列， 而且不包
含大的开放阅读框， 应属于基因组的非编码区 ［18］，
且仅在雄株中出现， 推测其可能位于 Y 染色体上。
性染色体上的这种非编码序列可能在性染色体的起
源和进化中扮演重要的角色。 根据数学模型推测发
现， 白麦瓶草的 Y 染色体远远大于 X 染色体的主
要原因可能是因为其积累了大量的非编码的重复
DNA序列、 转座因子和串联重复序列［19，20］。 在酸模
Y 染色体的异染色质区域、 地钱和番木瓜的 Y 染
色体上也发现了类似的重复序列［21-23］。 说明这些非
图 4 葎草雄性连锁片段的 SCAR 分子标记
a. S2142 的 SCAR 标记； b. S1519 的 SCAR 标记； Lane M: DNA 分子量标准 （D514， TaKaRa）
Fig.4 The male-linked SCAR marker of Humulus scandens L.
a. Male-linked SCAR marker of the primer S2142； b. male-linked SCAR marker of the primer S1519； Lanes M:
DNA molecular size marker （D514， TaKaRa）.
M M
762bp
1207bp
a b
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3蛳 4 期 葎草雄性连锁的 RAPD 标记的克隆与 SCAR 标记的建立
编码序列可能通过增加拷贝数而在 Y 染色体上过
渡累积， 进而导致了 X 染色体之间的重组， 促进
性染色体的起源。 因此， 进一步的基因组杂交及
FISH 技术可以更好的分析所获得的标记的详细信
息及染色体定位， 为性染色体的进化及性别差异的
分子机制研究提供参考。
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42卷高武军 孙富从 尹为治 姬艳克 邓传良 卢龙斗
ABSTRACT In dioecious plants， the important differences of male and female individuals exist in
the genome， so it is very significant to do a comparative study on the sex differences with the
DNA markers. In this article， Random Amplification Polymorphic DNA （RAPD） technology was
used to increase the Humulus scandens female and male genome teams. The results show that two
of the 100 primers， S1519 and S2142， respectly produced a sex-linked band only found in tested
males， with the length of 1 207bp and 762bp. These fragments were cloned and sequenced and
then aligned with the GenBank database by BLAST， finding that they are abundant in AT (individ-
ually 64%， 54.7%)， and no sequence was significantly similar. The RAPD markers were then con-
verted into male-linked SCAR （Sequence Characterized Amplified Regions） markers.
Key words： Humulus scandens L. Male-linked. RAPD. SCAR
CLONE AND DEVELOPMENT OF RAPD AND SCAR MARKERS
LINKED TO SEX DETERMINATION IN THE DIOECIOUS
SPECIES Humulus scandens L.
GAO Wu Jun SUN Fu Cong YIN Wei Zhi JI Yan Ke DENG Chuan Liang LU Long Dou
（College of Life Sciences， Henan Normal University， Henan Xinxiang 453007）
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