全 文 ：第４４卷　第６期
２０１６年１１月
河南师范大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
　 Ｖｏｌ．４４　Ｎｏ．６
　 Ｎｏｖ．２０１６
　　文章编号：１０００－２３６７（２０１６）０６－０１２６－０５　 ＤＯＩ：１０．１６３６６／ｊ．ｃｎｋｉ．１０００－２３６７．２０１６．０６．０２２
葎草单染色体的显微分离及
ＤＯＰ－ＰＣＲ技术体系建立
秦瑞云，李双双，李书粉，袁金红，高武军，邓传良
（河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡４５３００７）
摘　要：葎草是具有ＸＸ／ＸＹ１Ｙ２ 性染色体系统的雌雄异株植物，是研究植物性染色体演化的模式材料之一．
利用染色体显微分离技术从葎草根尖有丝分裂中期分裂相中将单条染色体进行了显微分离及ＤＯＰ－ＰＣＲ（Ｄｅｇｅｎｅｒ－
ａｔｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒ－ＰＣＲ）扩增，并构建了单染色体ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增产物的荧光探针，对葎草根尖有丝分裂中期
分裂相染色体进行了荧光原位杂交，其结果表明荧光信号分布在所有的染色体上，表明所建立的技术体系能够成功
分离葎草单染色体并进行ＤＮＡ扩增．本研究结果为进一步进行葎草Ｘ，Ｙ染色体的细胞及分子生物学研究提供了
技术支持．
关键词：葎草；单染色体；显微分离；ＤＯＰ－ＰＣＲ
中图分类号：Ｑ３７ 文献标志码：Ａ
葎草（Ｈｕｍｕｌｕｓ．ｊａｐｏｎｉｃａｓ　Ｌ．）为桑科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）葎草属（Ｈｕｍｕｌｕｓ）一年生或多年生枝蔓性草本雌雄
异株植物，其性别由Ｘ性染色体／常染色体平衡控制：当Ｘ性染色体／常染色体比率为１时为雌性，当比率为
０．５时为雄性［１］，基因组大小为１．７ｐｇ［２］．葎草雌株为２ｎ＝１６＝１４＋ＸＸ，雄株为２ｎ＝１７＝１４＋ＸＹ１Ｙ２［３］，其
性染色体非常容易辨认，Ｘ染色体是最大的染色体，Ｙ染色体比最大的常染色体要大［４］．葎草性染色体演化
处于性染色体演化非常重要的阶段，因此是研究性染色体演化的模式材料之一［１］．荧光原位杂交技术和改良
Ｃ带技术相结合，以５ＳｒＤＮＡ，４５ＳｒＤＮＡ、末端重复序列 ＨＪＳＲ为探针的研究表明，Ｘ染色体短臂上有一个
富含ＡＴ序列的区域，Ｙ１ 含有两个富含ＡＴ序列的区域，Ｙ２ 则是完全没有信号；Ｙ１ 染色体两条臂亚末端部
区域均分布有 ＨＪＳＲ荧光信号，而Ｙ２ 染色体上无荧光信号分布．因此，我们通过这些荧光信号分布，在细胞
形态学上能够轻易地分辨出性染色体与常染色体［５］．借助激光切割技术，Ｙａｋｏｖｉｎ等在葎草花粉母细胞减数
分裂中分离出ＸＹ１Ｙ２ 性染色体，并进行了ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增、涂染及ＤＮＡ文库的构建［６］．性染色体连锁分子
标记的获得不但可以用于葎草早期的性别鉴定，而且有助于葎草性染色体演化的研究，前期，许多学者在这
方面做了大量工作［７－１１］．
自从Ｓｃａｌｅｎｇｈｅ第一次建立染色体微分离和微克隆技术到目前已经发展了将近３０多年［１２］．经过许多学
者的改进［１３－１６］，染色体微分离和微克隆已经成为从特定染色体和／或染色体特异区域分离ＤＮＡ的有效和
直接的方式［１７］．分离的ＤＮＡ在基因组研究中具有许多作用，包括（１）构建遗传连锁和物理图谱，（２）筛选进
行染色体涂染的探针，和（３）组装染色体特异表达序列标签（ＥＳＴ）库［１８－１９］．显微分离技术已经被应用于菠菜
（Ｓｐｉｎａｃｉａ　ｏｌｅｒａｃｅａ）、芦笋（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、白麦瓶草（Ｓｉｌｅｎｅ　ｌａｔｉｆｏｌｉａ）、酸模（Ｒｕｍｅｘ　ａｃｅｔｏｓａ）、葎
草等雌雄异株植物性染色体的分离、鉴定、ＤＮＡ文库构建及特异重复序列获得等方面的研究［６，２０－２４］．
在前期研究中，葎草ＸＹ１Ｙ２ 性染色体是作为一个整体从葎草花粉母细胞减数分裂相中分离出来，而要
分离Ｘ，Ｙ１，Ｙ２ 性染色体特异序列，一种非常重要的方式是分别将Ｘ，Ｙ１，Ｙ２ 性染色体分别进行分离和克隆．
收稿日期：２０１６－０４－０７；修回日期：２０１６－１０－０１．
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０００１６５）；河南省高校科技创新团队（１７ＩＲＴＳＴＨＮ０１７）；河南省高等学校青年骨干
项目资助（２０１４ＧＧＪＳ－０５０）．
第１作者简介：秦瑞云（１９７６－），女，山东菏泽人，河南师范大学实验师，主要从事植物分子遗传学研究．
通信作者：邓传良（１９７５－），男，山东菏泽人，教授，博士，主要从事植物分子遗传研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ＤＣＬ７５＠１６３．ｃｏｍ．
基于此，本研究将葎草单条染色体进行了显微分离、ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增及ＦＩＳＨ验证，建立了相应的技术体系，
研究结果为进一步分离葎草Ｘ，Ｙ染色体奠定了基础．
１　材料与方法
１．１　植物材料
本研究所用的材料为野生葎草萌发的不定根．在八月中旬，等葎草雌、雄花绽放，鉴别雌、雄株，分别选取
葎草雌、雄茎段进行水培，萌发不定根用于本实验研究．
１．２　葎草单条染色体的显微分离及ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增
参考Ｋａｔｏ等［２５］的方法进行葎草单条染色体的制备、微分离及微克隆．待水培茎段不定根萌发长到１．０
～２．０ｃｍ长．切断的根尖用笑气处理２ｈ，然后用冰冷的９０％乙酸固定１０ｍｉｎ，于７０％乙醇中－２０℃保存
备用．在冰上对根尖进行清洗，生长点部分用１％果胶酶Ｙ２３（Ｙａｋｕｌｔ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｔｏｋｏｙｏ）和２％纤维素
酶Ｏｎｏｚｕｋａ　Ｒ－１０（Ｙａｋｕｌｔ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｔｏｋｏｙｏ）混合液于３７℃酶解５０ｍｉｎ．酶解后，根尖用７０％乙醇清
洗一次，然后用１００％乙醇再清洗一次．用大头针将根生长点部分仔细捣碎，用１００％乙醇将溶液室温重旋
３０ｓ以分离细胞．通过离心将细胞收集在离心管底部，用９０％乙酸进行重旋．将细胞悬浮液滴再放在湿盒内
的玻璃制片上，慢慢展片．根尖细胞立即用于微分离．用固定在倒置显微镜（奥林巴斯１Ｍ，日本）上显微操作
仪（ＬｅｉｔＺ）上的玻璃针将葎草中单条染色体进行分离．
分离的单条染色体被收集在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，用蛋白酶Ｋ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）进行消化．参考
Ｔｅｌｅｎｉｕｓ等［２６］的方法，利用简并寡核苷酸引物５’－ＣＣＧ　ＡＣＴ　ＣＧＡ　ＧＮＮ　ＮＮＮ　ＮＡＴ　ＧＴＧ　Ｇ－３’对单条染色
体进行ＰＣＲ扩增．在所有的操作过程中，执行严格的阴性对照试验．
１．３　单染色体ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增产物验证
为了进一步验证单条染色体ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增产物来源于葎草基因组，利用 Ｈａｎ等［２７］的方法对葎草中期
分裂相染色体进行制备．借助切口平移方法，用Ｃｈｒｏｍａ　Ｔｉｄｅ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８－５－ｄＵＴＰ对微分离单条染色
体第二轮扩增产物进行荧光标记并作为探针．探针混合液（２０ｎｇ／μＬ，用２×ＳＳＣ和１×ＴＥ混合液进行稀
释）首先在沸水中变性５ｍｉｎ，然后放置在冰上．每一张制片用６μＬ探针溶液．杂交时，制片先在１００℃处理
５ｍｉｎ，接着５５℃于湿盒里放置过夜．杂交后，制片用２×ＳＳＣ溶液进行清洗，然后用Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ防淬灭剂
（包含１．５μｇ／ｍＬ　ＤＡＰＩ，Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）进行处理．用蔡司荧光显微镜（Ｚｅｉｓｓ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）上的 Ｍａｇｎａｆｉｒｅ　ＣＣＤ相机对图像进行捕捉，用Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　７．０软件对图像进行处理．
２　实验结果
２．１　单条染色体的鉴定、微分离及扩增
在葎草中期分裂相中，随机选择一条单染色体（图１ａ），利用玻璃针将该条染色体进行分离（图１ｂ）．每一
个分离的染色体单独放在一个管中，被用来进行ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增．经过两轮连续扩增后，用１％琼脂糖凝胶电
泳进行检测，可以看到所扩增的ＤＮＡ分子量在５００～２０００ｂｐ（图２泳道２）范围内呈现弥散量的条带．作为
控制可能ＤＮＡ污染的阴性对照，无模板ＤＮＡ的阴性对照试验在微分离和扩增的所有过程中均同步执行．
如图２泳道１所示，阴性对照没有扩增出ＤＮＡ产物．
２．２　单染色体ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增产物验证
借助切口平移方法，用Ｃｈｒｏｍａ　Ｔｉｄｅ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８－５－ｄＵＴＰ对单染色体ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增产物进行荧
光标记，在没有封阻的情况下，与葎草根尖中期分裂相染色体进行杂交，荧光信号分布在所有染色体的所有
区域（图３）．
３　讨　论
对于Ｘ／Ａ比率决定性别的雌雄异株植物（如酸模），Ｘ染色体对于雌雄株都是必需的．多个Ｙ染色体系
统可能来源于两种方式：一种是来源于常染色体与Ｘ染色体的易位（由于易位的发生，同型的Ｘ、Ｙ染色体
７２１第６期　　　　　　　　　　　　秦瑞云，等：葎草单染色体的显微分离及ＤＯＰ－ＰＣＲ技术体系建立
变成了异型的Ｘ，Ｙ染色体，后来为了保持一个平衡的核型，正常常染色体与原始Ｙ染色体共分离，从而导
致两个Ｙ染色体的产生）；另一种来源于ＸＹ性染色体的断裂事件（Ｙ染色体着丝粒区域的断裂形成了两个
具端着丝粒的性染色体（Ｙ１ 和Ｙ２），后来两个具端着丝粒染色体形成等臂染色体，最后两个新形成的Ｙ染色
体在臂的一端缺失了同源区域的部分）［２８］．目前，不清楚易位事件是否在酸模中发生，因为同种类型的重复
序列分布在所有的Ｙ染色体上（Ｙ１ 和 Ｙ２），表明 Ｙ１ 和 Ｙ２ 染色体具有共同的起源［２４，２９］．因此，对于ＸＸ／
ＸＹ１Ｙ２ 性染色体系统的雌雄异株植物，Ｙ染色体起源问题仍是一个悬而未决的事件．作为ＸＸ／ＸＹ１Ｙ２ 性染
色体系统代表植物葎草，本研究借助染色体显微分离技术，成功的将其单条染色体进行显微分离及ＤＯＰ－
ＰＣＲ扩增（图１，图２）．当将荧光标记的单条染色体ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增产物与葎草根尖中期分裂相进行杂交时，
荧光信号分布在所有染色体上（图３），这一结果表明微分离的单条染色体ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增产物来源于葎草基
因组．同时，我们可以看到单染色体扩增产物荧光标记没有特异的杂交到某条染色体上，这可能是由于植物
染色体上具有许多同源的重复序列．不过，我们可以借助一些技术手段如单染色体差减杂交、单染色体ＥＳＴ
序列快速克隆等来获得单染色体特有的序列，从而为研究单染色体的起源演化奠定基础．
本研究结果建立了葎草单染色体显微分离技术体系，为进行Ｘ，Ｙ染色体的细胞及分子生物学研究提供
了技术支持，同时也为探讨Ｙ染色体可能的演化方式提供了新的思路．
８２１ 河南师范大学学报（自然科学版）　　　　　　　　　　　　　　　　２０１６年
参　考　文　献
［１］　Ｍｉｎｇ　Ｒ，Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ　Ａ，Ｒｅｎｎｅｒ　Ｓ　Ｓ．Ｓｅｘ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｉｎ　ｌａｎｄ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，２０１１，６２：４８５－５１４．
［２］　Ｇｒａｂｏｗｓｋａ－Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ　Ａ，Ｓｌｉｗｉｎｓｋａ　Ｅ，Ｐｉｇｕｌａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｓｉｚｅ　ｉｎ　Ｈｕｍｕｌｕｓｌｕｐｕｌｕｓ　Ｌ．ａｎｄ　Ｈ．ｊａｐｏｎｉｃａｓ　Ｓｉｅｂｏｌｄ＆Ｚｕｃｃ．（Ｃａｎｎａ－
ｂａｃｅａｅ）［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｓｏｃｉｅｔａｔｉｓ　Ｂｏｔａｎｉｃｏｒｕｍ　Ｐｏｌｏｎｉａｅ，２００６，７５：２０７－２１４．
［３］　Ｗｉｎｇｅ　Ｏ．Ｏｎ　ｔｈｅ　ｎａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓｅｘ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｉｎ　Ｈｕｍｕｌｕｓ［Ｊ］．Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ，１９２９，１２：５３－６３．
［４］　王连军，邓传良，卢龙斗，等．葎草的核型和性染色体研究［Ｊ］．河南农业科学，２００７，１０：６１－６３．
［５］　Ｇｒａｂｏｗｓｋａ－Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ　Ａ，Ｍｏｓｉｏｌｅｋ　Ｍ，Ｌｅｃｈ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｃ－Ｂａｎｄｉｎｇ／ＤＡＰＩ　ａｎｄ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｆｌｅｃｔ　ｋａｒｙｏｔｙｐｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｓｅｘ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＨｕｍｕｌｕｓｊａｐｏｎｉｃａｓＳｉｅｂｏｌｄ＆Ｚｕｃｃ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ，２０１１，１３２：２０３－２１１．
［６］　Ｙａｋｏｖｉｎ　Ｎ　Ａ，Ｄｉｖａｓｈｕｋ　Ｍ　Ｇ，Ｒａｚｕｍｏｖａ　Ｏ　Ｖ，ｅｔ　ａｌ．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｌａｓｅｒ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍｕｌｕｓｊａｐｏｎｉｃａｓ　Ｓｉｅｂｏｌｄ　ｅｔ
Ｚｕｃｃａｒｉｎｉ，１８４６（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）ｓｅｘ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ，２０１４，８（４）：３２３－
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［７］　肖理慧，高武军，张小莉，等．葎草ＤＮＡ的提取及ＡＦＬＰ标记反应体系的建立［Ｊ］．分子植物育种，２００８，６（２）：３９３－３９８．
［８］　高武军，孙富从，尹为治，等．葎草雄性连锁的ＲＡＰＤ标记的克隆与ＳＣＡＲ标记的建立［Ｊ］．分子细胞生物学报，２００９，６（２）：２１２－２１５．
［９］　高武军，沙　涛，姬艳克，等．葎草雄－性连锁的ＩＳＳＲ标记克隆及ＳＣＡＲ标记的建立［Ｊ］．热带亚热带植物学报，２０１０，１８（３）：２８３－３８７．
［１０］　Ａｌｅｋｓａｎｄｒｏｖ　Ｏ　Ｓ，Ｄｉｖａｓｈｕｋ　Ｍ　Ｇ，Ｋａｒｌｏｖ　Ｇ　Ｉ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｓｅｘ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｈｏｐ　Ｈｕｍｕｌｕｓ　Ｊａｐｏｎｉｃｕｓ
Ｓｉｅｂｏｌｄ　＆Ｚｕｃｃ［Ｊ］．Ｒｕｓｓ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ，２０１１，４７（８）：１１４５－１１４９．
［１１］　邓传良，任映雪，张卫丽，等．葎草性别相关ＳＲＡＰ分子标记的鉴定［Ｊ］．植物研究，２０１４，３４（６）：７９８－８０２．
［１２］　Ｓｃａｌｅｎｇｈｅ　Ｆ，Ｔｕｒｃｏ　Ｅ，Ｅｄｅｒｓｔｒｍ　Ｊ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ
ｐｏｌｙｔｅｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，１９８１，８２：２０５－２１６．
［１３］　Ｒｈｍｅ　Ｄ，Ｆｏｘ　Ｈ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ　ｍｅｔａｐｈａｓｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．
Ｃｅｌ，１９８４，３６：７８３－７８８．
［１４］　Ｂａｔｅｓ　Ｇ　Ｐ，Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ　Ｂ　Ｊ，Ｗｉｌｉａｍｓｏｎ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｃｌｏｉｎｇ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｈｏｒｔ　ａｒｍ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　２［Ｊ］．Ｍｏｌ
Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌ，１９８６，６：３８２６－３８３０．
［１５］　Ｌüｄｅｃｋｅ　Ｈ　Ｊ，Ｓｅｎｇｅｒ　Ｇ，Ｃｌａｕｓｓｅｎ　Ｕ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ　ｂｙ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｎｄｅｄ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３８：３４８－３５０．
［１６］　Ｋａｏ　Ｆ　Ｔ，Ｙｕ　Ｊ，Ｑｉ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｒｅｇｉｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　２ｐ２３→ｐ２１ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎ　ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　２ｐ２１［Ｊ］．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ　Ｃｅｌ　Ｇｅｎｅｔ，１９９５，６８：１７－１８．
［１７］　Ｙｕ　Ｊ　Ｗ，Ｔｏｎｇ　Ｓ　Ｈ，Ｆｅｎｇ　Ｔ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｒｏｍｏ－
ｓｏｍｅ　２ｑ３５－ｑ３７［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９２，１４：７６９－７７４．
［１８］　Ｚｈｏｕ　Ｒ　Ｎ，Ｈｕ　Ｚ　Ｍ．Ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００７，８：６７－７２．
［１９］　Ｚｈｏｕ　Ｒ　Ｎ，Ｓｈｉ　Ｒ，Ｊｉａｎｇ　Ｓ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｒａｐｉｄ　ＥＳＴ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１Ｒｏｆ　ｒｙｅ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，２００８，８：２８－４１．
［２０］　Ｄｅｎｇ　Ｃ　Ｌ，Ｑｉｎ　Ｒ　Ｙ，Ｃａｏ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｉｎｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｉｎ　ｓｐｉｎａｃｈ（Ｓｐｉｎａｃｉａ　ｏｌｅｒａｃｅａ）［Ｊ］．Ｊ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｓ，
２０１３，１２６：５４９－５５６．
［２１］　Ｄｅｎｇ　Ｃ　Ｌ，Ｑｉｎ　Ｒ　Ｙ，Ｚｈａｎｇ　Ｗ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｉｎｔｉｎｇ　ｏｆ　ａｓｐａｒａｇｕｓ　Ｌ５ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ［Ｊ］．Ｃａｒｙｏｌｏｇｉａ，２０１４，６７：１８５－１９０．
［２２］　Ｄｅｎｇ　Ｃ　Ｌ，Ｚｈａｎｇ　Ｗ　Ｌ，Ｃａｏ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｒａｐｉｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｐｉｎａｃｈ　Ｙ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＥＳＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｊ
Ｇｅｎｅｔ，２０１５，９４：７０５－７１３．
［２３］　Ｈｏｂｚａ　Ｒ，Ｌｅｎｇｅｒｏｖａ　Ｍ，Ｃｅｒｎｏｈｏｒｓｋａ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．ＦＡＳＴ－ＦＩＳＨ　ｗｉｔｈ　ｌａｓｅｒ　ｂｅａｍ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ　ＤＯＰ－ＰＣＲ　ｐｒｏｂｅ　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ　ｔｈｅ　ｓｅｘ　ｃｈｒｏ－
ｍｏｓｏｍｅｓ　ｏｆ　Ｓｉｌｅｎｅｌａｔｉｆｏｌｉａ［Ｊ］．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｒｅｓ，２００４，１２：２４５－２５０．
［２４］　Ｓｈｉｂａｔａ　Ｆ，Ｈｉｚｕｍｅ　Ｍ，Ｋｕｒｏｋｉ　Ｙ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｐａｉｎｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｙ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ａｎｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｙ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉｏｅｃｉｏｕｓ　ｐｌａｎｔ　Ｒｕｍｅｘａｃｅｔｏｓａ［Ｊ］．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，１９９９，１０８：２６６－２７０．
［２５］　Ｋａｔｏ　Ａ，Ｌａｍｂ　Ｊ　Ｃ，Ｂｉｒｃｈｌｅｒ　Ｊ　Ａ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｐａｉｎｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｓ　ｐｒｏｂｅｓ　ｆｏｒ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｉｎ　ｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００４，１０１：１３５５４－１３５５９．
［２６］　Ｔｅｌｅｎｉｕｓ　Ｈ，Ｃａｒｔｅｒ　Ｎ　Ｐ，Ｂｅｂｂ　Ｃ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｐｒｉｍｅｄ　ＰＣＲ：Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ＤＮＡ　ｂｙ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｄｅ－
ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９２，１３：７１８－７２５．
［２７］　Ｈａｎ　Ｆ　Ｐ，Ｌａｍｂ　Ｊ，Ｂｉｒｃｈｌｅｒ　Ｊ．Ｈｉｇｈ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｉｎ　ｓｔａｂｌｅ　ｄｉｃｅｎｔｒｉｃ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００６，１０３：３２３８－３２４３．
［２８］　Ｖｙｓｋｏｔ　Ｂ，ｎｄ　Ｈｏｂｚａ　Ｒ．Ｇｅｎｄｅｒ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ：ｓｅｘ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ａｒｅ　ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆｏｇ［Ｊ］．ＴＲＥＮＤＳ　Ｇｅｎｅｔ，２００４，２０（９）：４３２－４３８．
（下转第１５８页）
９２１第６期　　　　　　　　　　　　秦瑞云，等：葎草单染色体的显微分离及ＤＯＰ－ＰＣＲ技术体系建立
［１２］　Ｖａｌｅｎｔｉ　Ｓ，Ｎｅｒｉ　Ｆ，Ｃｕｃｃｈｉａｒｅｌｉ　Ａ．Ａｎ　Ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｅｓｓａｙ　Ｇｒａｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ－
ｇｙ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，２０１２（２）：３１９－３３０．
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［１７］　江进林．中国学生英译汉机器评分模型的研究与构建［Ｍ］．北京：外语教学与研究出版社，２０１０：８８－９２．
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Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｏｃａｌ　Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ
ＥＦＬ　Ｌｅａｒｎｅｒｓ′Ｅｓｓａｙｓ　ｗｉｔｈ　ＷｏｒｄＮｅｔ
ＬＩＵ　Ｇｕｏｂｉｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ；Ｔｈｅ　Ｃｏｒｐｕｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｅｎａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ　４５３００７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　８０ｅｓｓａｙｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｔｌｅ　ａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｔｈｅ　ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｗｉｔｈ　ＷｏｒｄＮｅｔ；ｔｈｅｎ
ｗｅ　ｂｕｉｌｔ　ａｎ　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｌｏｃａｌ　ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｌｅａｒｎｅｒｓ′ｅｓｓａｙｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ　ｔｅｓｔ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｓｉｇｎｉｆ－
ｉｃａｎｔ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ｓｃｏｒｅｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ　ｗｅ　ｂｕｉｌｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ－ｍａｄｅ　ｓｃｏｒｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＷｏｒｄＮｅｔ；ｌｅａｒｎｅｒｓ′ｅｓｓａｙｓ；ｌｏｃａｌ　ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ；ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ
（上接第１２９页）
［２９］　Ｒｅｊｏｎ　Ｃ　Ｒ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｘ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｒｕｍｅｘａｃｅｔｏｓａ［Ｊ］．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ，１９９４，７２：２０９－
２１５．
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ＤＯＰ－ＰＣＲ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ
Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｉｎ　Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃａｓ
ＱＩＮ　Ｒｕｉｙｕｎ，ＬＩ　Ｓｈｕａｎｇｓｈｕａｎｇ，ＬＩ　Ｓｈｕｆｅｎ，ＹＵＡＮ　Ｊｉｎｈｏｎｇ，ＧＡＯ　Ｗｕｊｕｎ，ＤＥＮＧ　Ｃｈｕａｎｌｉａｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ　４５３００７，Ｃｈｉｎａ．）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃａｓ　ｉｓ　ｄｉｏｅｃｉｏｕｓ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＸＸ／ＸＹ１Ｙ２ｓｅｘ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｓｙｓｔｅｍ，ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｍｏｄｅｌ　ｍａｔｅ－
ｒｉａｌｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｓｅｘ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃａｓｗａｓ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ
ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒｏｏｔｓ　ｔｉｐ　ｏｎ　ｍｉｔｏｓｉｓ　ｍｅｔａｐｈａｓｅｓ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ　ＤＯＰ－ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｗｅｒｅ
ｌａｂｅｌｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ－４８８ｂｙ　ｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｏｆ　ｆｅｍａｌｅ　Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃａｓｐｌａ－
ｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｏｎ　ａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｈｕｍｕｌｕｓ
ｊａｐｏｎｉｃａｓｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｆｏｕｎｄ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔ　ｔｈｅ　Ｘ　ｏｒ　Ｙ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｈ．ｊａ－
ｐｏｎｉｃａｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃａｓ；ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ；ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒ－ＰＣＲ
８５１ 河南师范大学学报（自然科学版）　　　　　　　　　　　　　　　　２０１６年