全 文 ：植物资源与环境学报 2012，21(2) :107－113
Journal of Plant Resources and Environment
天目山山胡椒不同部位内生真菌组成及多样性分析
吴晓菡1，2，李文超2，秦路平1，2，①
(1． 华东师范大学生命科学学院，上海 200026;2． 第二军医大学药学院生药教研室，上海 200433)
摘要:采用表面消毒法，从浙江天目山野生山胡椒〔Lindera glauca (Sieb． et Zucc．)Blume〕的茎、叶和树皮中分离出
内生真菌，基于 ITS序列分析进行分类鉴定;并以内生真菌的分离率、定殖率、分离频率、多样性指数(H)及相似性
系数为指标，分析了山胡椒内生真菌的菌群组成及多样性。结果显示:在 26 株山胡椒样株的 728 块组织块中共分
离得到 328 株内生真菌(茎、叶和树皮中分别有 161、40 和 127 株) ;共鉴定出 44 个分类单元(茎、叶和树皮中各有
19、18 和 28 个) ，其中 25 个分类单元鉴定到种、17 个鉴定到属、2 个鉴定到科，ITS 序列的 GenBank 登录号从
JF502420 至 JF502462。在 44 个分类单元中，有 40 个分类单元属于子囊菌(310 株) ，存在于山胡椒的各个部位;仅
有 4 个分类单元属于担子菌(18 株) ，且仅存在于茎和树皮中。山胡椒茎、树皮和叶中内生真菌的定殖率分别为
65%、60%和 15%，分离率分别为 0． 77、0． 61 和 0． 19;叶和树皮中内生真菌的多样性指数均为 2． 63，远大于茎(H =
1． 83)。山胡椒内生真菌的优势属为 Phomopsis、Paraconiothyrium、Phoma和 Colletotrichum，大量存在于叶、茎和树皮
中。山胡椒茎与树皮、茎与叶及叶与树皮间内生真菌的相似性系数分别为 0． 27、0． 19 和 0． 18，显示树皮和叶之间
以及树皮和茎之间内生真菌的组成极不相似。研究结果表明:山胡椒体内存在大量的内生真菌，其茎、叶和树皮的
内生真菌菌群组成具有一定程度的多样性和差异性，且内生真菌的分布具有组织特异性。
关键词:山胡椒;内生真菌;组成;多样性;ITS序列分析;相似性
中图分类号:Q949． 32;Q948． 12+2． 3 文献标志码:A 文章编号:1674－7895(2012)02－0107－07
Analyses on composition and diversity of endophytic fungi in different parts of Lindera glauca
from Tianmu Mountain WU Xiao-han1，2，LI Wen-chao2，QIN Lu-ping1，2，① (1． School of Life
Sciences，East China Normal University，Shanghai 200026，China;2． Department of Pharmacognosy，
School of Pharmacy，Second Military University，Shanghai 200433，China) ，J． Plant Resour． ＆
Environ． 2012，21(2) :107－113
Abstract:By the surface sterilization method，endophytic fungi were isolated from stem，leaf and bark of
wild Lindera glauca (Sieb． et Zucc．)Blume from Tiammu Mountain of Zhejiang Province，and were
identified and classified according to ITS sequence analysis result． Taking isolation rate (IR) ，
colonization rate(CR) ，relative frequency (RF) ，Shannon-Wiener biodiversity index (H)and similarity
coefficient (Cs) as indexes， the composition and diversity of endophytic fungal community were
analyzed． The results show that 328 strains of endophytic fungi (161 strains in stem，40 strains in leaf
and 127 strains in bark)are obtained from 728 tissues of 26 individuals of L． glauca． 44 taxa are
identified (19 taxa in stem，18 taxa in leaf and 28 taxa in bark) ，in which，25 taxa are identified to
species，17 taxa to genus and 2 taxa to family． The accession numbers of their ITS sequences in GenBank
are from JF502420 to JF502462． In all of 44 taxa，40 taxa belong to Ascomycota (310 strains)which
exist in all parts of L． glauca，and 4 taxa belong to Basiodiomycota (18 strains)which only exist in stem
and bark of L． glauca． Endophytic fungal CR in stem，bark and leaf of L． glauca is 65%，60% and
15%，IR is 0． 77，0． 61 and 0． 19，respectively． Endophytic fungal H in leaf and bark both is 2． 63，
which is obviously higher than that in stem (H = 1． 83)． The dominant genera of endophytic fungi in L．
glauca are Phomopsis，Paraconiothyrium，Phoma and Colletotrichum，most of them exist in leaf，stem
and bark． Cs value of endophytic fungi between stem and bark， stem and leaf， leaf and bark is 0． 27，
收稿日期:2011－05－09
作者简介:吴晓菡(1986—) ，女，河南南阳人，硕士研究生，研究方向为资源植物化学。
①通信作者 E-mail:qinsmmu@ 126． com
0． 19 and 0． 18，respectively，which shows the composition of endophytic fungi between bark and leaf or
bark and stem is not extremely similar． It is indicated that there are a lot of endophytic fungi in L．
glauca，the composition of endophytic fungal community in stem，leaf and bark has a certain diversity
and difference，and the distribution of endophytic fungi has the tissue specificity．
Key words:Lindera glauca(Sieb． et Zucc．)Blume;endophytic fungus;composition;diversity;ITS
sequence analysis;similarity
山胡椒〔Lindera glauca (Sieb． et Zucc．)Blume〕
又名牛筋条、牛筋树、野胡椒、假死柴等，是樟科
(Lauraceae)山胡椒属(Lindera Thunb．)灌木或者小乔
木，广泛分布于中国黄河以南地区。山胡椒入药的记
载始于唐代的《新修本草》，称其“叶辛、大热、无毒”，
主治“心腹痛、中冷破滞”［1－2］。现代实验研究证明:
山胡椒叶精油对鸡胚具有抗流感病毒作用，并且对常
见的 14 种细菌有不同程度的抗菌作用［3－4］;山胡椒
根用水煎服能散瘀通络，治疗跌打损伤、心腹冷痛;民
间用其叶泡茶服用，用于预防感冒、中暑，外敷可治疗
疮痈肿毒［5］。
内生真菌(endophytic fungus)是指在其生活史中
某一阶段生活在植物组织内、并且没有引起植物组织
明显病害症状的真菌，包括那些在其生活史中的某一
阶段营表生生活的腐生真菌和对宿主暂时没有伤害
的潜伏性病原真菌和菌根菌［6］。
植物内生真菌的数量巨大，具有产生新天然产物
的能力，甚至可以产生与宿主植物相同或相似的代谢
产物，因而植物的内生真菌是一个巨大的资源宝库，
是天然产物的重要来源［7］。目前对植物内生真菌的
鉴定主要采用以孢子形态特征为主要依据的传统形
态鉴定方法，但实际上总有一些菌株在人工培养条件
下不能产生孢子，这类不产孢菌株的比例从 4． 5%到
54%［8－15］，采用传统的方法无法确定这些菌株的分类
地位。因此，作者拟采用分子生物学方法、通过内生
真菌 ITS序列的比较对菌株加以鉴定，以期反映它们
的系统发育关系，并为不产孢菌株的鉴定提供分子生
物学依据。
目前，国内对山胡椒的研究主要集中在其化学成
分组成和药理作用等方面［1－5，16］，尚未见有关山胡椒
内生真菌的研究报道。为了研究山胡椒内生真菌的
多样性，作者借助于 ITS序列对产自浙江天目山的野
生山胡椒体内的内生真菌进行分离鉴定，并分析其种
类组成，为山胡椒药用成分与内生真菌关系的研究以
及植物内生真菌的分离鉴定提供实验依据。
1 材料和方法
1． 1 材料
供试山胡椒植物样品于 2009 年 11 月采自浙江
临安天目山，选择 26 株健康植株，采集叶片、枝条和
树皮供试。所采样品由第二军医大学药学院生药教
研室秦路平教授鉴定。
试剂:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) ;CTAB
缓冲液(pH8． 0) ;Taq DNA 聚合酶、10 ×PCR Buffer、
dNTPs Mix、MgCl2、引物 ITS4 和 ITS5 等，均购自上海
生工生物工程有限公司。
仪器:SW－CJ－1D 型单人净化工作台(江苏苏净
集团) ;隔水式电热恒温培养箱和 THZ－82A 台式恒
温振荡器(上海跃进医疗器械厂) ;5333 型 PCR 仪
(德国 Eppendorf) ;EPS 300 电泳系统和 Tanon 1600
凝胶成像系统(上海天能科技有限公司) ;飞鸽 TGL－
16G态势超速离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1． 2 方法
1． 2． 1 内生真菌分离方法 将新鲜健康的山胡椒的
叶、枝条和树皮用流水洗净后表面消毒，方法如下:在
超净工作台中用体积分数 75%乙醇漂洗 1 min，用体
积分数 3%NaClO 溶液漂洗 3 min，体积分数 75%乙
醇漂洗 30 s，无菌水冲洗 4 次。用无菌滤纸吸干水
分，叶片切成 0． 5 cm×0． 5 cm 的小片、枝条切成 0． 5
cm长的小段、树皮切成 0． 5 cm×0． 5 cm的小块，每个
培养皿接种 4 块相同类型组织块，每个植株每个部位
接种 2 个培养皿。置于 28 ℃恒温培养箱中培养 3 ～
30 d，待培养基上可观察到从组织块内部向周围长出
菌丝时，采用尖端菌丝挑取法将真菌转移到新培养基
上继续培养，待纯化后转移到 PDA斜面试管中，编号
备用［17］。分离过程中设置对照组，将经表面消毒的
同类组织块在空白培养基上滚动，使组织块的每个表
面都接触到培养基，按前述方法同期培养，对照培养
基上未长出菌落，说明表面消毒彻底。
801 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 21 卷
1． 2． 2 DNA 提取和 ITS 序列 PCR 扩增方法 参照
文献［18］采用 CTAB法提取 DNA。分别以通用引物
ITS5 (5 － GGAACTAAAAGTCGTAACAAGG － 3)和
ITS4 (5－TCCTCCGCTIATIGATATGC－3 )为上、下
游引物进行扩增。PCR 反应体系总体积 50 μL，包
含:20 mmol·L－1 Tris－HCl (pH 8． 4)、20 mmol·L－1
KCl、10 mmol·L－1(NH4)2SO4、2 mmol·L
－1 MgSO4、
200 μmol·L－1 dNTPs Mix、15 pmol ITS5、15 pmol
ITS4、100 ng 模板 DNA和 2． 5 U Taq DNA聚合酶，用
ddH2O补足至 50 μL。扩增程序:95 ℃预变性 3 min;
94 ℃变性 40 s，52 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，共
35 个循环;最后于 72 ℃延伸 10 min。
采用含 40 mmol·L－1Tris 和 1 mmol·L－1EDTA
(pH 8． 0)1×TAE的 0． 8%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR
产物，点样量 4 μL;于 75 V 电泳 40 min，然后用 0． 5
μg·mL－1 溴化乙啶染色 10 min，在紫外灯下检测电
泳结果。测序由上海申速生物技术有限公司完成。
1． 3 数据分析
利用 BLAST软件将获得的 ITS 序列与 GenBank
中已登录的序列进行对比并下载同源序列。通过
Clustal X1． 81 程序进行序列间的匹配排序［19］，并用
NJ法构建系统树，通过置信度评估，确定菌株的亲缘
关系及分类地位。
采用分离率(isolation rate)、定殖率(colonization
rate)、分离频率(relative frequency)、多样性指数
(biodiversity index，H)以及相似性系数(similarity
coefficient)等 5 个指标对不同样株及不同部位内生
真菌的侵染状况、多样性及相似度进行比较。
分离率是指得到的内生真菌菌株总数与供试植
物组织块总数的比值。该指标可以度量在一个特定
的植物组织样品中内生真菌的丰度以及植物组织样
品中多重侵染的频率。
定殖率是指被内生真菌侵染的组织块数占全部
组织块数的百分率［8］，该指标能够反映不同植物或
者同一植物不同组织受到内生真菌侵染的程度。
分离频率是指样本中分离到的某种内生真菌的
菌株数占总菌株数的百分率，该指标能反映某种内生
真菌在植物体内的丰富度。
根据 Shannon －Wiener 指数公式计算多样性指
数:H = －∑
k
i = 1
Pi×lnPi。式中:k 为宿主体内内生真菌种
类的总数;Pi 是指某种内生真菌的菌株数占全部内
生真菌菌株总数的百分率。多样性指数可反映内生
真菌的物种数量及其分布的均匀度。
相似性系数根据 Jaccard公式［20］进行计算:J = j /
(a+b－j) ，其中 j为两部位共有的内生真菌种类数;a、
b是两部位各自的内生真菌种类数。根据 Jaccard 相
似性系数原理，当 J 为 0． 00 ～ 0． 25 时为极不相似;J
为 0． 25 ～ 0． 50 时为中等不相似;J 为 0． 50 ～ 0． 75 时
为中等程度相似;J为 0． 75 ～ 1． 00 时为极为相似。
2 结果和分析
2． 1 山胡椒不同部位内生真菌分离率和定殖率及多
样性比较
山胡椒不同部位内生真菌的分离率、定殖率及多
样性指数见表 1。山胡椒茎中内生真菌的定殖率最
高(65%)、树皮中略低(60%) ，而叶中最低(仅
15%)。分离率的变化规律与定殖率一致，从高到低
依次为茎(0． 77)、树皮(0． 61)、叶(0． 19)。与其他宿
主中内生真菌定殖率和分离率［21－23］相比，山胡椒叶
中内生真菌的定殖率和分离率偏低，而树皮和茎中则
与其他宿主相似。山胡椒叶和树皮中内生真菌的多
样性指数均为 2． 63，远高于茎(H = 1． 83)。虽然树
皮和叶中内生真菌总数比茎少，但因种类数比茎多，
因而内生真菌的多样性指数高于茎。
表 1 山胡椒不同部位内生真菌的定殖率、分离率和多样性指数(H)
Table 1 The colonization rate，isolation rate and Shannon-Wiener
biodiversity index (H) of endophytic fungi in different parts of
Lindera glauca (Sieb． et Zucc．)Blume
部位
Part
定殖率 /%
Colonization rate
分离率
Isolation rate H
茎 Stem 65 0． 77 1． 83
叶 Leaf 15 0． 19 2． 63
树皮 Bark 60 0． 61 2． 63
合计 Total 47 0． 53 2． 58
2． 2 山胡椒不同部位内生真菌种类组成分析
在 26 株山胡椒样株的 728 块组织块中共分离得
到 328 株内生真菌，鉴定到 44 个分类单元，GenBank
登录号从 JF502420 到 JF502462。其中 25 个分类单
元鉴定到种、17 个鉴定到属、2 个鉴定到科(见表 2)。
从山胡椒茎的木质部中分离得到内生真菌 161
株，占菌株总数的 49． 1%;包含 19 个分类单元，其中
12 个鉴定到种、7 个鉴定到属。从山胡椒叶中分离得
901第 2 期 吴晓菡，等:天目山山胡椒不同部位内生真菌组成及多样性分析
到内生真菌 40 株，占菌株总数的 12． 2%;包含 18 个
分类单元，其中 10 个鉴定到种、7 个鉴定到属、1 个鉴
定到科。从山胡椒树皮中分离得到内生真菌 127 株，
占菌株总数的 38． 7%;包含 28 个分类单元，其中 15
个鉴定到种、12 鉴定到属、1 个鉴定到科。
表 2 山胡椒不同部位内生真菌的分离频率
Table 2 The relative frequency of endophytic fungi in different parts of Lindera glauca (Sieb． et Zucc．)Blume
分类单元
Taxon
分离频率 /% Relative frequency
茎
Stem
叶
Leaf
树皮
Bark
合计
Total
分类单元
Taxon
分离频率 /% Relative frequency
茎
Stem
叶
Leaf
树皮
Bark
合计
Total
-
Alternaria tenuissima 1． 86 0． 91 Paraconiothyrium sp． 2 1． 24 15． 00 1． 57 3． 05
Chaetomium murorum 0． 79 0． 30 Paraconiothyrium sp． 3 0． 62 0． 79 0． 61
Cladosporium cladosporioides 0． 62 4． 72 2． 13 Pestalotiopsis clavispora 0． 62 0． 79 0． 61
Colletotrichum coffeanum 1 1． 24 0． 61 Pestalotiopsis cocculi 0． 62 1． 57 0． 91
Colletotrichum coffeanum 2 5． 00 0． 61 Pezicula spec 2． 50 8． 66 3． 66
Colletotrichum coffeanum 3 2． 50 0． 30 Phaeosphaeriopsis sp． 2． 50 0． 30
Colletotrichum crassipes 7． 45 7． 50 4． 72 6． 40 Phoma bellidis 3． 11 5． 00 2． 36 3． 05
Cosmospora sp． 2． 50 0． 30 Phoma rhei 1 0． 79 0． 30
Creosphaeria sassafras 2． 50 0． 30 Phoma rhei 2 5． 00 4． 72 2． 44
Diaporthe sp． 1 0． 79 0． 30 Phoma senecionis 1． 24 0． 61
Diaporthe sp． 2 5． 00 0． 61 Phoma sp． 1． 57 0． 61
Diaporthe sp． 3 6． 30 2． 44 Phomopsis sp． 54． 66 20． 00 34． 65 42． 60
Diaporthe sp． 4 1． 57 0． 61 Plectosphaerella sp． 0． 79 0． 30
Dicarpella dryina 2． 50 0． 30 Plesporales sp． 1 2． 36 0． 91
Fusarium solani 2． 48 1． 57 1． 83 Plesporales sp． 2 3． 94 1． 52
Gibberella sp． 0． 62 5． 00 2． 36 1． 83 Pyrenochaeta sp． 2． 48 1． 22
Helminthosporium velutinum 1 2． 48 2． 50 1． 52 Sarcosomataceae sp． 2． 50 0． 30
Helminthosporium velutinum 2 7． 50 0． 91 Trichoderma atroviride 1． 57 0． 61
Massarinaceae sp． 0． 79 0． 30 Irpex lacteus 6． 21 2． 36 3． 96
Microdiplodia hawaiiensis 1． 57 0． 61 Peniophora sp． 0． 62 0． 30
Paraconiothyrium brasiliense 3． 11 1． 52 Schizophyllum commune 1． 57 0． 61
Paraconiothyrium sp． 1 8． 70 5． 00 3． 15 6． 10 Trametes versicolor 1． 57 0． 61
在 44 个分类单元中，有 40 个分类单元属于子囊
菌，占 90． 9%;其中 22 个鉴定到种、16 个鉴定到属、
2个鉴定到科;子囊菌共计310株，占菌株总数的
94． 51%，存在于山胡椒的各个部位。有 4 个分类单
元属于担子菌，占 9． 1%;这 4 个分类单元是 Irpex
lacteus，Peniophora sp．， Schizophyllum commune 和
Trametes versicolor;担子菌的比例很小，仅有 18 株，占
菌株总数的 5． 49%，仅存在于山胡椒的茎和树皮中。
2． 3 山胡椒不同部位内生真菌优势类群分析
Phomopsis sp．在山胡椒各部位中广泛存在，在茎、
叶和树皮中的分离频率都较高。另外 2 个同目的属
是 Diaporthe和 Dicarpella，其中，Dicarpella dryina在叶
中仅 1 株;而属于 Diaporthe sp．的 4 个分类单元均仅
鉴定到属，并且在叶和树皮中分别仅有 2 株和 11 株，
分离频率为 3． 96%。
从山胡椒中获得的 Paraconiothyrium 属真菌有 4
个分类单元，其中，Paraconiothyrium sp． 1 和 sp． 2 在
茎、叶和树皮中均有分布，分离频率相对较高，分别达
到 6． 10%和 3． 05%;Paraconiothyrium sp． 3 仅从茎和
树皮中各分离到 1 株;而同属的 P． brasiliense 只存在
于茎中。
Colletotrichum crassipes也是山胡椒内生真菌的优
势类群，共获得 21 株，在茎、叶和树皮中分别有 12
株、3 株和 6 株，分离频率为 6． 40%;另外有 3 个分类
单元属于同属的 C． coffeanum，存在于茎和叶中，共 5
株，分离频率仅为 1． 52%。
山胡椒体内内生真菌的优势属还有 Phoma。其
中，Phoma bellidis共有 10 株，分离频率为 3． 05%，在
茎、叶和树皮中分别有 5 株、2 株和 3 株;Phoma rhei
共有 9 株，分离频率为 2． 74%，在叶和树皮中分别有
2 株和 7 株;Phoma senecionis仅从茎中分离得到 2 株;
Phoma sp．仅从树皮中分离得到 2 株。
011 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 21 卷
除上述 4 属外，山胡椒茎、叶和树皮中常见的内
生真菌还有 Pezicula sp．、Helminthosporium velutinum、
Cladosporium cladosporioides、Gibberella sp．、Fusarium
solani和 Plesporales sp． 2。Pezicula sp．只分布在叶(1
株)和树皮 (11 株)中，该菌的主要侵染部位是树皮。
Helminthosporium velutinum 的分离频率为 2． 43%，共
分离得到 8 株，茎和叶中各有 4 株。Cladosporium
cladosporioides共有 7 株，其中 6 株存在于树皮中，茎
中仅 1 株，分离频率为 2． 13%。Gibberella sp． 只鉴定
到属的水平，仅分离到 6 株，分离频率为 1． 83%，但在
茎、叶和树皮中均有分布;该属真菌能够产生赤霉素，
可以促进植物的生长，也曾在可可(Theobroma cacao
L．)和南方红豆杉〔Taxus chinensis var． mairei (Lemée
et H． Léveillé)W． C． Cheng et L． K． Fu〕中分离得
到。Fusarium solani在茎中有 4 株，在树皮中有 2 株。
Plesporales sp． 2 有 5 株、Plesporales sp． 1 有 3 株，这 2
个分类单元仅存在于树皮中。
2． 4 山胡椒不同部位间内生真菌的相似性分析
在内生真菌的 44 个分类单元中，仅有 6 个分类
单元在山胡椒 3 个部位中均有分布，分别是 Phomopsis
sp．、Paraconiothyrium sp． 1 和 sp． 2、Colletotrichum
crassipe、Gibberella sp．和 Phoma bellidis，占分类单元总
数的 13． 6%;共有 207 个 菌 株 ，占 菌 株 总 数 的
63． 1%。其中，有 27 个分类单元仅在 1 个部位有分
布，占分类单元总数的 63． 6%，共计 61 株，占菌株总
数的 18． 6%。
山胡椒茎、叶和树皮中内生真菌的优势属是
Phomopsis、Paraconiothyrium、Phoma 和 Colletotrichum，
在山胡椒各部位均有分布，共 226 株，占菌株总数的
68． 9%。从相似性系数上看，茎与树皮间内生真菌的
相似度值最高(0． 27) ，茎与叶间、叶与树皮间内生真
菌的相似度值分别为 0． 19 和 0． 18。根据 Jaccard 相
似性系数原理，树皮和叶之间以及树皮和茎之间内生
真菌的组成极为不相似，而树皮和茎之间内生真菌组
成的不相似程度为中等。
3 讨 论
内生真菌存在较为广泛，目前所发现的内生真菌
种类主要为子囊菌及其无性型，同时也有少量的担子
菌和接合菌［24－28］。从山胡椒茎、叶和树皮 3 个部位分
离得到的内生真菌经 ITS 序列验证大部分是子囊菌，
该结果和前人的研究结果基本一致。
山胡椒茎、叶和树皮中内生真菌的优势属为
Phomopsis、Paraconiothyrium、Colletotrichum 和 Phoma。
Phomopsis 属的真菌大部分是植物病原菌，能引起植
物组织病变，其中的一些种类是常见的热带植物病原
菌，在冬青栎(Quercus ilex L．)、蒲葵〔Livistona chinensis
(Jacq．)R． Br． ex Mart．〕、印楝树(Azadirachta indica
A． Juss．)和肖菝葜(Heterosmilax japonica Kunth)等多
种植物的内生真菌中均分离得到该属真菌［29－32］。
Paraconiothyrium属真菌是 2004 年分离获得的，是
Paraphaeosphaeria 的无性型［33］，该属真菌是月桂
(Laurus nobilis L．)内生真菌的优势种群［34］;从元宝枫
(Acer truncatum Bunge)中分离得到的该属真菌 P．
brasiliense 能够产生 pinthunamide 和新三萜化合物
brasilamides A-D［35］。Colletotrichum 属真菌也是一类
常见的病原菌，在可可、积雪草〔Centella asiatica (L．)
Urban〕、蒲葵和马铃薯(Solanum tuberosum L．)等多种
植物的内生真菌中均发现有该属真菌［36－38］。Phoma
属真菌在山胡椒各部位均有分布，在积雪草和棕榈
〔Trachycarpus fortunei (Hook．)H． Wendl．〕等多种植
物的内生真菌中也曾分离获得［39］。Diaporthe 属真菌
是常见内生真菌，在可可和茶〔Camellia sinensis (L．)
O． Kuntze〕中都曾有发现。镰刀菌(Fusarium sp．)是
一类分布广泛的真菌，是防治较为困难的植物病原菌
之一，存在于山胡椒体内的 F． solani也曾有学者从南
方红豆杉中获得 1 株并能够产生紫杉醇［40］。
从山胡椒体内获得的内生真菌大部分是植物病
原菌，会引发植物的各种病变，但是供试样株均为健
康植株，没有出现病害感染的症状，也即没有为病原
菌提供生长环境;加之表面消毒比较彻底，也可以排
除植物的表生菌和腐生菌，因而从健康宿主分离到病
原菌的原因与宿主本身的特性有关。山胡椒体内含
有具有抗菌作用的化学成分［3－5］，这些化学成分抑制
了病原菌对植株的侵害或者抑制了有害症状的表现，
使宿主与真菌的相互作用处于平衡状态，能够使真菌
在宿主体内存活但不表现出有害症状。因此，从山胡
椒体内得到的这些真菌是内生的且不引起植物病害，
这与内生真菌的定义是相符的。在本研究过程中分
离获得的内生真菌大都作为植物内生真菌被广泛报
道，可能与实验过程中运用的分离培养基为通用培养
基有关，而采用不同的培养基内生真菌的分离效果是
不同的［41］，不同真菌各自的最适培养基也不同，因
111第 2 期 吴晓菡，等:天目山山胡椒不同部位内生真菌组成及多样性分析
此，可采用不同的培养基或培养基组合进行进一步分
离，以获得更多的内生真菌菌株。
研究结果表明:在山胡椒体内内生真菌的分布部
位均有差异性和专一性，部分真菌具有组织偏好性。
茎中内生真菌的菌株数多但种类比较少，而树皮中内
生真菌的种类最多，叶中内生真菌的种类数介于前二
者之间，各部位间内生真菌的相似性很低。其原因除
与各部位的化学组成有差异、造成内环境的差异而影
响内生真菌菌群组成外，可能与各部位的形态和生态
特征有关。树皮的外表层比较薄，与外界环境接触面
积大，而且腐烂较多且易被侵染，腐生菌和表生菌较
多，因此，真菌侵染树皮的几率比较大。而山胡椒为
半常绿灌木，叶片每年更新 1 次，茎部的内生真菌会
侵染新叶，且叶片表面积也较大，增加了真菌侵染的
几率。茎的表面积和体积均较小，为内生真菌提供的
生存空间小，而且冬季温度低，数量多的真菌存活几
率大，加之茎的内环境比较稳定，所以虽然内生真菌
种类少但菌株数量多。影响植物内生真菌分布的因
素和作用机制是多方面和复杂的，因此，有关山胡椒
内生真菌的分布特征还需要更全面的研究。
李海波［42］等认为:真菌的 ITS序列具有种内相对
一致、种间差异比较明显的特点，使真菌 ITS 序列不
仅适合于属内物种间或种内差异较明显的类群间的
系统发育关系分析，而且非常适合于真菌物种的分子
鉴定。因此，作者采用分子生物学方法、通过 ITS 序
列的比较对山胡椒不同部位内生真菌进行分类鉴定，
该方法具有方便、快捷且信息量大的特点，能弥补传
统形态学方法不能鉴定不产孢菌株的缺憾，但鉴定方
法较为单一，有些分类单元只能鉴定到属或科水平，
因而，对其中的有些分类单元还有待结合真菌的形态
特征进行进一步的分类鉴定。
从植物的内生真菌中能分离到与宿主相同或相
似的活性成分，且药用植物的内生真菌也具有抗菌或
者抗肿瘤的活性［40，43－45］，因而，山胡椒不同部位内生
真菌是否也有此特性则有待深入探讨。
参考文献:
［1］ 王玉兰，高贤明，余孝平． 我国山胡椒资源及其开发利用的研
究［J］． 湖南科学，1994，12(4) :331－334．
［2］ 杨得坡，王发松，任三香． 山胡椒果挥发油的化学成分和抗真
菌活性［J］． 中药材，1999，22(6) :295－298．
［3］ 刘立鼎，顾静文，陈京达． 山胡椒叶子化学成分及其应用［J］．
江西科学，1992，10(1) :38－44．
［4］ 张小云，覃庆文，喻连香． 山胡椒挥发油的提取及其抑菌活性
研究［J］． 现代生物医学进展，2010，10(1) :133－136．
［5］ 余德贵． 山胡椒的药理作用［J］． 基层中药杂志，1996，10(4) :
41．
［6］ 庞 蕾，严铸云，梁俊玉，等． 内生真菌在中药中的应用前景
［J］． 时珍国医国药，2005，16:242－243．
［7］ 黎万奎，胡之璧． 内生菌与天然药物［J］． 中国天然药物，2005，
3:193－199．
［8］ PETRINI O，STONE J，CARROLL F E． Endophytic fungi in ever-
green shrubs in western Oregon:a preliminary study［J］． Canadian
Journal of Botany，1982，60:789－796．
［9］ JOHNSON J A，WHITNEY N J． Isolation of fungal endophytes from
black spruce (Picea mariana)dormant buds and needles from New
Brunswick，Canada［J］． Canadian Journal of Botany，1992，70:
1754－1757．
［10］ FISHER P J， PETRINI O， PETRINI L E， et al． Fungal
endophytes from the leaves and twigs of Quercus ilex L． from
England，Majorca and Switzerland［J］． New Phytologist，1994，
127:133－137．
［11］ FISHER P J，PETRINI L E，SUTTON B C，et al． A study of
fungal endophytes in leaves，stems and roots of Gynoxis oleifolia
Muchler (Compositae)from Ecuador［J］． Nova Hedwigia，1995，
60:589－594．
［12］ GUO L D，HUANG G R，WANG Y． Seasonal and tissue age
influences on endophytic fungi of Pinus tabulaeformis (Pinaceae)
in Dongling Mountain，Beijing［J］． Journal of Integrative Plant
Biology，2008，50:997－1003．
［13］ CANNON P F，SIMMONS C M． Diversity and host preference of
leaf endophytic fungi in the Iwokrama Forest Reserve，Guyana［J］．
Mycologia，2002，94:210－220．
［14］ WANG Y，GUO L D，HYDE K D． Taxonomic placement of sterile
morphotypes of endophytic fungi from Pinus tabulaeformis
(Pinaceae) in northeast China based on rDNA sequences［J］．
Fungal Diversity，2005，20:235－260．
［15］ SHANKAR N B，SHASHIKALA J，KRISHNAMURTHY Y L．
Diversity of fungal endophytes in shrub by medicinal plants of
Malnad region，Western Ghats， Southern India［J］． Fungal
Ecology，2008，8:89－93．
［16］ 姚旭丽，李钧敏，付 俊，等． 山胡椒次生代谢产物抑菌活性
大小分析［J］． 福建林业科技，2008，35(3) :174－176，180．
［17］ HUANG W Y，CAI Y Z，XING J，et al． Potential antioxidant
resource: endophytic fungi isolated from traditional Chinese
medicinal plants［J］． Economic Botany Quarterly，2007，61:14．
［18］ GUO L D，HYDE K D，LIEW E C Y． Detection and taxonomic
placement of endophytic fungi within frond tissues of Livistona
chinensis based on rDNA sequences［J］． Molecular Phylogenetics
and Evolution，2001，20:1－13．
［19］ THOMPSON J D，GILBSON T J，PLEWNIAK F，et al． The
Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple
sequence alignment aided by quality analysis tools［J］． Nucleic
211 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 21 卷
Acid Research，1997，24:4876－4882．
［20］ 马克平． 生物群落多样性的测度方法［M］∥中国科学院生物多
样性委员会． 生物多样性研究的原理与方法． 北京:中国科学
技术出版社，1994:141－165．
［21］ 孙剑秋，郭良栋，臧 威，等． 药用植物内生真菌多样性及生
态分布［J］． 中国科学 C 辑:生命科学，2008，38(5) :475 －
484．
［22］ WANG Y，GUO L D． A comparative study of endophytic fungi in
needles，bark，and xylem of Pinus tabulaeformis［J］． Canadian
Journal of Botany，2007，85:911－917．
［23］ KUMAR D S，HYDE K D． Biodiversity and tissue-recurrence of
endophytic fungi in Tripterygium wilfordii［J］． Fungal Diversity，
2004，17:69－90．
［24］ PETRINI O，CARROLL G． Endophytic fungi in foliage of some
Cupressaceae in Oregon［J］． Canadian Journal of Botany，1981，
59:629－636．
［25］ ZHENG R Y，JIANG H． Rhizomucor endophytics sp． nov．，an
endophytic zygomycete from higher plants［J］． Mycotaxon，1995，
56:455－466．
［26］ SINCLAIR J B， CERKAUSKAS R F． Latent infection vs．
endophytic colonization by fungi［M］∥REDLIN S C，CARRIS L
M． Endophytic Fungi in Grasses and Woody Plants:Systematics，
Ecology，and Evolution． Minnesota:the American Phytopatholo-
gical Society Press，1996:3－29．
［27］ HYDE K D，ALIAS S A． Biodiversity and distribution of fungi
associated with decomposing Nypa fruticans［J］． Biodiversity and
Conservation，2000，9:393－402．
［28］ LIM Y W，KIM J J，CHEDGY R，et al． Fungal diversity from
western red cedar fences and their resistance to β-thujaplicin［J］．
Antonie van Leeuwenhoek，2005，87:109－117．
［29］ COLLADO J，PLATAS G，GONZLEZ I，et al． Geographical and
seasonal influences on the distribution of fungal endophytes in
Quercus ilex［J］． New Phytologist，1999，144:525－532．
［30］ GUO L D，HYDE K D，LIEW E C Y． Identification of endophytic
fungi from Livistona chinensis based on morphology and rDNA
sequences［J］． New Phytologist，2000，147:617－630．
［31］ VERMA V C，GOND S K，KUMAR A，et al． The endophytic
mycoflora of bark，leaf，and stem tissues of Azadirachta indica A．
Juss (Neem) from Varanasi (India) ［J］． Microbial Ecology，
2007，54:119－125．
［32］ GAO X X，ZHOU H，XU D Y，et al． High diversity of endophytic
fungi from the pharmaceutical plant，Heterosmilax japonica Kunth
revealed by cultivation-independent approach［J］． FEMS Micro-
biology Letters，2005，249:255－266．
［33］ VERKLEY G J M， SILVA M， WICKLOW D T， et al．
Paraconiothyrium，a new genus to accommodate themycoparasite
Coniothyrium minitans，anamorphs of Paraphaeosphaeria，and four
new species［J］． Studies in Mycology，2004，50:323－335．
［34］ GRE M E，BUCAK C． Geographical and seasonal influences on
the distribution of fungal endophytes in Laurus nobilis［J］． Forest
Pathology，2007，37:281－288．
［35］ LIU L，GAO H，CHEN X L，et al． Brasilamides A-D:sesquiter-
penoids from the plant endophytic fungus Paraconiothyrium
brasiliense［J］． European Journal of Organic Chemistry，2010，17:
3302－3306．
［36］ RUBINI M R，SILVA-RIBEIRO R T，POMELLA A W V，et al．
Diversity of endophytic fungi community of cacao (Theobroma cacao
L．)and biological control of Crinipellis perniciosa，causal agent of
Witches’broom disease［J］． International Journal of Biological
Sciences，2005，1:24－33．
［37］ RAKOTONIRIANA E F，MUNAUT F，DECOCK C，et al． Endo-
phytic fungi from leaves of Centella asiatica: occurrence and
potential interactions within leaves［J］． Antonie van Leeuwenhoek，
2008，93:27－36．
［38］ GTZ M，NIRENBERG H，KRAUSE S，et al． Fungal endophytes
in potato roots studied by traditional isolation and cultivation-
independent DNA-based methods［J］． FEMS Microbiology Ecology，
2006，58:404－413．
［39］ TAYLOR J E，HYDE K D，JONES E B G． Endophytic fungi
associated with the temperate palm，Trachycarpus fortunei，within
and outside its natural geographic range［J］． New Phytologist，
1999，142:335－346．
［40］ DENG B W，LIU K H，CHEN W Q，et al． Fusarium solani，Tax-
3，a new endophytic taxol-producing fungus from Taxus chinensis
［J］． World Journal of Microbiology Biotechnology， 2009，25:
139－143．
［41］ 柯海丽，宋希强，谭志琼，等． 野生五唇兰根部内生真菌多样
性研究［J］． 生物多样性，2007，15(5) :456－462．
［42］ 李海波，吴学谦，魏海龙，等． 基于形态特征和 ITS序列对7 个
鹅膏菌属菌株的分类鉴定［J］． 菌物研究，2007，5(1) :14 －
19，50．
［43］ NOBLE H M，LANGLEY D，SIDEBOTTOM P J，et al． An
echinocandin from an endophytic Cryptosporiopsis sp． and Pezicula
sp． in Pinus sylvestris and Fagus sylvatica［J］． Mycological
Research，1991，95:1439－1440．
［44］ STIERLE A，STROBEL G A，STIERLE D． Taxol and taxane
production by Taxomyces andreanae［J］． Science，1993，260:
214－216．
［45］ STROBEL G A，MILLER R V，MARTINEZ-MILLER C，et al．
Cryptocandin，a potent antimycotic from the endophytic fungus
Cryptosporiopsis cf． quercina［J］． Microbiology，1999，145:1919－
1926．
(责任编辑:惠 红)
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