全 文 ：基金项目：国家公益性行业科技(No.20093018)、十二五国家科技支撑计划项目(No.2012BAD02B00; No.2011BAD35B07;
No.2012BAD50G01)、北京市科委育种平台三期(No.D111100001311002)和北京市常规育种财政专项 (No.2013-509)
收稿日期：2013-07-22 接受日期：2013-09-13
洋葱花青素合成相关基因(AcPAL1)的克隆和表达分析
梁 毅 1 刘小义 2 张洪伟 1* 谭武平 1
1北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京京研益农科技发展中心，北京 100097；2
中国质量认证中心，北京 100070
通讯作者，zhwwawzjcx@163.com
摘 要 苯丙氨酸解氨酶(PAL)作为植物苯丙烷类代谢途径中的关键酶，在其生长发育、抗病抗逆等多
种生命进程中起重要作用，是花青素生物合成途径中的第一个酶。为了研究洋葱(Allium cepa L.) PAL基
因的生物学功能及其与花青素合成之间的关系，利用不同植物PAL基因设计简并引物，通过RT-PCR和
RACE技术克隆洋葱PAL基因全长cDNA序列(GenBank登录号: KF421110)，并对该基因进行序列分析和
Real-time PCR表达分析。结果表明，该序列全长 2 363 bp，编码包含 708个氨基酸残基的蛋白质多肽；
Blast分析和系统进化分析表明，该多肽与大蒜(Allium. sativum)、石蒜(Lycoris radiate)PAL蛋白相似性很
高，因此被命名为AcPAL1。Real-time PCR表达分析结果表明，AcPAL1基因在白皮、黄皮和红皮洋葱中表
达量依次增加；而随着鳞茎的不断膨大，其表达量却不断降低。本实验初步证实了所克隆的洋葱AcPAL1
基因与花青素合成相关联，为研究洋葱PAL基因同花青素合成积累之间的关系提供了依据。
关键词 洋葱，花青素，AcPAL1
Cloning and Expression Analysis of an Anthocyanin Bio-synthesis-related
Gene(AcPAL1) in Onion(Allium cepa L.)
LIANG Yi1 LIU Xiao-Yi2 ZHANG Hong-Wei1* TAN Wu-Ping1
1 Beijing Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Key Laboratory of Biology and Genetic
Improvement of Horticultural Crops in North China, Ministry of Agriculture, Beijing Jingyanyinong Sci- Tech Development Center, Beijing
100097, China; 2 China Quality Certification Center, Beijing 100070, China
Corresponding author, zhwwawzjcx@163.com
Abstract As a key enzyme of the plant phenylpropanoid pathway, phenylalanine ammonia- lyase (PAL),
which plays an important role in the life processes such as growth and development, and disease resistance, is
the first enzyme in the anthocyanin synthesis pathway. In order to study the biological function for PAL in
onion(Allium cepa L.) and its relationship with anthocyanin synthesis, the full length cDNA of PAL gene
(GenBank accession no. KF421110) in onion bulb was cloned by RT- PCR and RACE technology using
degenerate primers designed according to PAL genes in different plants. The sequence analysis and expression
analysis using Real-time PCR were performed either. The results showed that the cloned sequence designated
AcPAL1 had full length of 2 363 bp, which encoded a protein polypeptide of 708 amino acids. Blast and
phylogenetic analysis indicated that the polypeptide shared a very high similarity with Allium sativum and
Lycoris radiate. Expression analysis using Real- time PCR demonstrated that the transcription of AcPAL1
increase by degrees in white, yellow and red onions, and the expression was down-regulated by the continuous
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(1): 47~54
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.01.006
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
0 引言
洋葱(Allium cepa L.)是葱科葱属二年生草本植
物，有白黄红等多种不同皮色种类。作为重要的类
黄酮物质，决定红皮种类的关键色素花青素需在一
系列结构基因和调节基因参与下，经历苯丙烷类代
谢途径、类黄酮途径及各种花青素合成三个阶段而
合成，并在植物抗逆、生长发育、人类保健、农产品品
质提高等过程中起重要作用(宫硖等, 2011;白海娜
和王振宇, 2011; 包满珠, 1997)。苯丙氨酸解氨酶
(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)催化苯丙烷类
代谢途径中的第一步反应，以L-苯丙氨酸为底物生
成反式肉桂酸，是该途径的关键酶和限速酶(徐晓梅
和杨署光, 2009)。这种酶通常是4个相同亚基构成
的220~330 kD的酸性寡聚体蛋白质，其维持活性的
最适 pH为 8.0~9.5。PAL是一种诱导酶，可以被各
类因素如低温、机械损伤、光、病原菌感染等诱导而
表达，且这种诱导是转录水平上的(高东尧, 2006)。
作为自然界广泛存在的水溶性色素，植物花青
素代谢途径研究已较为透彻，PAL基因同花青素合
成之间关系研究亦有所进展。Nakazawa等(2001)
研究牵牛花PAL基因结构和表达模式，发现PAL活
性和转录水平均与花青素积累有关：在花蕾中，
PAL转录水平增加，PAL活性增高，花青素的含量
也增加；Ozeki等(2000)发现，在缺乏2,4-D(2,4-二氯
苯氧乙酸)的培养基中，胡萝卜悬浮培养细胞PAL
活性被缓慢诱导，并开始花青素的合成过程；史宝
胜等(2007)认为光照可以显著增加PAL酶的活性，
增加叶片中类黄酮、多酚等物质的含量，促进花青
素合成，使紫叶李叶片迅速着色，呈现红色。目前，
通过调节PAL基因的表达，改变了矮牵牛、烟草和
菊花的颜色，但是对于洋葱PAL基因同花青素合成
关系的研究还未见报道。本实验利用RT-PCR技
术和RACE技术分离并获得了一条洋葱PAL基因
全长 cDNA序列，并通过对该基因初步的序列鉴
定，及基于Real-time PCR的mRNA水平的表达分
析，为研究洋葱PAL基因同花青素合成积累之间的
关系提供了依据，为进一步研究洋葱花青素合成途
径奠定了一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料及试剂
开始膨大后 30 d的红、黄、白 3种皮色洋葱
(Allium cepa L.)，以及开始膨大后 10、20、30和 40 d
的红皮洋葱，由本课题组保存。
TotalRNAExtractor(Trizol)购自生工生物工程
(上海)股份有限公司；用于荧光定量 PCR的 96孔
PCR板和专用封板膜购自北京凯诺德科贸有限责
任公司；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis
Kit、 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA
Extraction Kit Ver. 3.0、pMD18- T Vector、5- Full
RACE Kit、RealMasterMix(SYBR Green)等试剂购
自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 AcPAL1全长基因的克隆
利用已公布的洋葱近缘植物(大蒜，玉米，小果
野蕉，毛竹，石蒜)PAL基因设计简并引物(表 1)，以
开始膨大后 30 d的红皮洋葱鳞茎为材料克隆PAL
基 因 中 间 序 列 ，其 中 RNA 的 提 取 使 用
TotalRNAExtractor(Trizol)试剂；cDNA第一链的合
成使用 PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis
Kit；以合成的 cDNA第一链为模板，PAL-de-F和
PAL-de-R为引物，进行PCR扩增，反应体系为：10×
LA PCR BufferⅡ(Mg2 + Plus) 5.0 μL，dNTP Mixture
(各 2.5 mmol/L)8.0 μL，PAL- de- F(50 μmol/L)3.0
μL，PAL- de- R(50 μmol/L)3.0 μL，模板 cDNA 2.0
μL，TaKaRa LA Taq(5 U/μL)0.5 μL，加水补足 50
μL；反应条件为：预变性 94 ℃ 3 min，然后 94 ℃
40 s、53 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，进行35个循环，最后
72 ℃延伸10 min。PCR扩增获得基因片段的回收
纯化使用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA
Extraction Kit Ver. 3.0，回收片段的连接及转化使用
pMD18-T Vector试剂盒，挑取合适的重组质粒菌株
经 PCR鉴定、酶切鉴定后送北京奥科鼎盛生物科
技有限公司测序。
expansion of the bulb. In this study it is demonstrated that the expression of AcPAL1 is somewhat related to the
onion anthocyanin biosynthesis and provided the basis for their relationship study between the onion PAL gene
and accumulation of anthocyanin synthesis.
Keywords Onion, Anthocyanin, AcPAL1
48
表1 实验中所涉及到的引物及其核苷酸序列
Table 1 Nucleotide sequences of the primers used in the study
引物名称
Primer name
RT-Primer-RT
RT-Primer-PCR
PAL-de-F
PAL-de-R
P4F-1
P4R-1
P4R-2
AcActin-S
AcActin-A
P4-S
P4-A
核苷酸序列(5~3)
Nucleotide sequence(5~3)
GACTCGAGTGCACATCGT17
GACTCGAGTGCACATCG
GGHATYCGVTTYGARATCCT
GTTGTCCATGGANACVCCRAT
CACCCTGCCTACCTCTTCGTG
ATGGGTTGTCGTTCACAGAGTTTAT
TTTCATAAAGGACAATGGAGGC
ACACGGCCTGGATAGCAACAT
AGAGCAGTATTCCCAAGCATT
GCGATTGGGTGATGGATAGTATGT
GCAGCACGGGTAGTGGTTGA
用途
Purpose
3-RACE中合成第一链cDNA
First-strand cDNA synthesis in 3-RACE
克隆基因3-末端序列
Gene 3-ends sequence cloning
扩增PAL基因部分cDNA片段
PAL partial cDNA fragment amplification
扩增PAL基因部分cDNA片段
PAL partial cDNA fragment amplification
扩增AcPAL1基因3-末端序列
AcPAL1 3-ends sequence amplification
扩增AcPAL1基因5-末端序列
AcPAL1 5-ends sequence amplification
扩增AcPAL1基因5-末端序列
AcPAL1 5-ends sequence amplification
实时荧光定量 PCR Actin引物
Actin primer for Real-time PCR
实时荧光定量PCR Actin引物
Actin primer for Real-time PCR
实时荧光定量PCR AcPAL1特异引物
AcPAL1 specific primer for Real-time PCR
实时荧光定量PCR AcPAL1特异引物
AcPAL1 specific primer for Real-time PCR
H=A/T/C; V=G/A/C; R=A/G; Y=C/T; N=A/T/C/G
利用测序获得的部分基因序列设计引物(表
1)，通过RACE方法扩增获得基因的 3端和 5端序
列。其中3-RACE方法同基因片段的克隆，区别在
cDNA第一链的合成使用引物RT-Primer-RT，基因
片段的扩增使用RT-Primer-PCR和P4F-1；5-RACE
使用 5-Full RACE Kit，操作步骤按照试剂盒说明
进行。PCR产物的纯化回收、连接、转化及后续鉴
定同基因片段的克隆。
1.3 AcPAL1基因序列的生物信息学分析及系统
树构建
将上述克隆的基因中间序列、3ʹ-端序列及 5ʹ-
端序列进行拼接，得到该基因的全长 cDNA片段。
氨基酸的理化性质的分析使用ProtParam；N-端信
号肽序列预测使用Signal3.0；序列的同源比对和多
重比对分别使用BLAST program和Clustal W；用
Mega4.1软件，以N-J算法，重复抽样 1 000次来构
建系统进化树。使用到的程序及对应网址见表2。
1.4 基于Real-time PCR的AcPAL1基因表达分析
分别取开始膨大后30 d的红、黄和白3种皮色
洋葱鳞茎，提取RNA，并反转录合成cDNA第一链，
用以分析不同皮色洋葱鳞茎AcPAL1基因的表达情
况；取开始膨大后 10、20、30和 40 d的红皮洋葱鳞
茎提取总RNA，反转录成cDNA第一链以分析洋葱
不同生长时期的AcPAL1基因表达情况。设计特异
性引物 P4-S和 P4-A，以洋葱β-actin基因(引物为
AcActin- S 和 AcActin- A) 为 内 参 基 因 ，利 用
RealMasterMix(SYBR Green)试剂，在 Light Cycler
system(Roche LightCycler480实时荧光定量 PCR
仪)上进行 Real- time PCR，扩增体系均为：SYBR
Premix Ex Taq(2×) 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)
各 0.4 μL，模板 cDNA 1 μL，加水补足 20 μL；扩增
条件为：预变性 94 ℃ 5 min，然后 94 ℃ 30 s、60 ℃
洋葱花青素合成相关基因(AcPAL1)的克隆和表达分析
Cloning and Expression Analysis of an Anthocyanin Bio-synthesis-related Gene(AcPAL1) in Onion(Allium cepa L.) 49
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
表2 基因生物信息学分析网址
Table 2 URL of the bioinformatics analysis in gene
分析项目
Analysis item
氨基酸理化性质分析
Amino acid physicochemical property analysis
序列同源比对
Sequence homology analysis
信号肽序列预测
Signal peptide prediction
多重序列比对
Multiple sequence alignment
使用软件
Software used
ProtParam
BLAST program
Signal3.0
Clustal W
网址
URLs
http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam
http://www.ncbi.nlm.nib.gov/blast
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
www.ebi.ac.uk/clustalw/
30 s、72 ℃ 30 s，进行40个循环，最后进行溶解曲线
分析。采用 2-ΔΔCt 法(Livak, Schmittgen, 2001)分析
该基因的相对表达情况。
2 结果与分析
2.1 AcPAL1基因序列的分析
利用已公布的洋葱近缘植物PAL基因序列设计
简并引物，以开始膨大后30 d的红皮洋葱鳞茎为材
料，克隆获得了一个 717 bp的 cDNA片段(图 1A)，
Blast分析表明，该片段为洋葱PAL基因部分片段，故
命名为 AcPAL1。利用该片段序列设计引物，通过
RACE技术获得其3-端及5-端序列(图1B，C)，将上
述3段序列拼接即获得AcPAL1基因的全长cDNA序
列(GenBank登录号: KF421110)。该序列全长2 363
bp，包含的开放阅读框大小为2 124 bp，编码由708个
氨基酸残基组成的蛋白质多肽，同时该序列还包含
97 bp 的 5’- UTR序列及 142 bp的 3’- UTR序列
(polyA尾序列长12 bp)。对该多肽的氨基酸序列的
Blast 分析发现，AcPAL1 与大蒜的 PAL 序列
(Accession No.ADO24189)相似性为 94%，与石蒜
PAL序列(Accession No.ACM61988)相似性为81%。
该序列包含保守结构域PAL-HAL和PLN02457，以
及苯丙氨酸解氨酶的酶活性中心特征序列
(GTITASGDLVPLSYIA)，是 Lyase_I_like家族成员
之一(图2)。N-端信号肽序列分析发现该序列不含信
号肽序列，是一种非分泌蛋白；而氨基酸的性质分析
表明，该多肽的分子量为76.98 kD，理论pI值为5.83。
2.2 AcPAL1蛋白的系统进化分析
为了进一步明确AcPAL1与其他植物的 PAL
蛋白之间的进化关系，选取部分植物PAL蛋白，与
AcPAL1构建了系统进化树，本实验克隆得到的
AcPAL1以加粗字体显示(图 3)。系统进化分析表
明，同一科的植物趋于分在相同分支，如大豆、豌
豆、红车轴草等豆科植物被分在了同一支，牵牛花、
红薯等旋花科植物被分在同一支，而禾本科植物同
样处于同一分支下。本实验克隆得到的AcPAL1
与大蒜的PAL蛋白质处于进化树的同一分支，与其
植物的亲缘关系相符(二者同属葱科葱属)。
2.3 AcPAL1基因基于Real-time PCR的表达分析
为了分析 AcPAL1在洋葱鳞茎中的表达情况，
进行了Real-time PCR检测实验(图 4)，其中以开始
膨大后 30 d的红、黄、白 3种皮色洋葱鳞茎为材料
研究不同皮色洋葱AcPAL1的表达情况，以开始膨
图1 AcPAL1 cDNA的扩增
Figure 1 Amplification of AcPAL1 cDNA
A、B和 C：AcPAL1 cDNA片段扩增、3- RACE扩增及 5-
RACE扩增的电泳图。P：AcPAL1 cDNA片段扩增条带，3：
3-RACE扩增条带，5：5-RACE扩增条带，M：DNA marker
DL2000
A, B and C: Amplification of AcPAL1 cDNA fragments(A), 3-
RACE fragments(B), and 5-RACE fragments(C), respective-
ly. P: AcPAL1 cDNA fragments; 3: 3-RACE fragments; 5: 5-
RACE fragments; M：DNA marker DL2000
717
bp P M
A
1647
bp 3 M
B
933
bp 5 M
C
50
图2 AcPAL1基因序列及其推导的氨基酸序列
Figure 2 AcPAL1 and its deduced amino acid sequence
起始密码子ATG和终止密码纸TAA以阴影标注；下划线部分表示酶活性中心特征序列
The start codon and stop codon are marked in shadow; Feature sequence of active center is marked underlined
洋葱花青素合成相关基因(AcPAL1)的克隆和表达分析
Cloning and Expression Analysis of an Anthocyanin Bio-synthesis-related Gene(AcPAL1) in Onion(Allium cepa L.) 51
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
大后10、20、30和40 d的红皮洋葱为材料研究洋葱
不同膨大时期AcPAL1的表达情况。不同皮色洋葱
鳞茎Real-time PCR结果发现，AcPAL1在 3种皮色
的洋葱鳞茎中均有表达，且在红皮洋葱中表达量最
大，黄皮洋葱次之，白皮洋葱表达量很低，表明了
AcPAL1的表达量可能随洋葱鳞茎颜色的加深而增
加。对不同膨大时期的洋葱鳞茎的Real-time PCR
分析发现，鳞茎刚开始膨大时，AcPAL1的表达量最
大，随后在鳞茎不断的膨大过程中，表达量迅速减
少，直到鳞茎膨大完成时，其表达量维持在一个很
微弱的水平。
3 讨论
自从Koukol和Conn(1961)首次从绿色植物分
图3 洋葱及其他植物PAL蛋白质所构建的无根系统进化树
Figure 3 Unrooted phylogenetic tree constructed by AcPAL1 and PAL in other plants
0
1
2
3
4
5
6
7
r y w A
相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
1 2 3 4
0
5
10
15
20
25
30
35
40
相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
B
b
c
a
b
b
a
c
图4 AcPAL1基因在鳞茎不同皮色(A)和膨大时期(B)的Real-time PCR分析
Figure 4 Expression analysis of AcPAL1 in different skin color(A) and different bulb swelling stage(B) in onion by Real-
time PCR
r：红色；y：黄色；w：白色洋葱。1~4：从洋葱鳞茎开始膨大后第10、20、30和40天的4个时期；内参基因：β-actin，n=3，不同字
母表示差异显著，P＜0.05
r: Red; y: Yellow; w: White. 1~4: The 4 stages when bulb swelling at the 10, 20, 30 and 40 d in onion; Reference gene: β-actin，n=
3, Significant difference was showed by different letters, P＜0.05
52
离到 PAL，该酶研究受到国内外广泛关注。目前
PAL酶已被证明存在于所有绿色植物，细菌、真菌
和藻类中亦有发现；在亚细胞水平上，该酶被定位
于细胞质及叶绿体、白色体、线粒体、过氧化酶体、
乙醛酸体等细胞器中(徐晓梅, 杨署光, 2009)。现
在，拟南芥(Cochrane et al., 2004)、茶树(Matsumoto
et al., 1994)等多种植物PAL基因已被克隆。研究
发现，该基因普遍由小的多基因家族组成，1组染
色体可含不同 PAL基因 2~6个，且因植物不同而
异，如菜豆有3个，欧芹4个，番茄5个，松树只报道
了1个，而马铃薯至少有40个。PAL基因编码区长
度变化一般不大，为2 100 bp左右，包含2个外显子
和 1个位置保守但长度变化很大的内含子。本实
验以红皮洋葱鳞茎为材料，克隆获得了一个PAL基
因AcPAL1，该基因蛋白产物与大蒜、石蒜的PAL蛋
白同源性分别为94%和81%，进化分析发现该基因
的进化关系与各植物间亲缘关系相符合。
在PAL基因表达与花青苷积累关系方面，不同
研究者研究结果差异较大。Kataoka、Given、
Faragher等分别对葡萄、草莓和苹果的研究发现，
PAL的活性与花青苷的合成在 0.05的水平上呈正
相关(冯守千, 2011)。但也有人认为PAL不是花青
苷合成的关键酶，因为通过该途径不仅可以合成花
青苷，还可以合成木质素、单宁等其他产物。Ju等
(1995)发现，苹果中花青苷的积累存在着两个高
峰，一个在幼果期，一个在果实成熟期，幼果期花青
苷的积累伴随着PAL活性的增加而提高，而成熟期
却没有；Boss等(1996)发现葡萄PAL基因可以在大
部分组织中表达，但只有果皮中存在花青苷的积
累；另外，Sparvoli等(1994)认为，光照影响葡萄花
青素合成的原因是影响了后面基因表达而非PAL
基因。本实验通过Real-time PCR技术对不同皮色
和不同膨大时期洋葱鳞茎进行了表达分析，结果表
明，随着洋葱皮色的加深(由白皮到黄皮到红皮)，
PAL基因表达量大量增加；而随着洋葱鳞茎膨大的
过程，该基因表达量却是不断下降，表明在洋葱鳞
茎中PAL基因表达同花青素积累有一定的关系。
PAL基因表达具有组织特异性，同一PAL基因
家族中不同成员的表达模式不尽相同。菜豆有 3
个 PAL基因在根中均大量表达，在叶中却仅有
PAL1表达，花瓣中PAL2表达量最高，PAL1表达量
相对较少，而 PAL3则不表达 (江昌俊, 余有本,
2001)；PAL酶可催化苯丙氨酸反应进入苯丙烷类
代谢途径，进一步生成各种次生代谢产物，参与植
物的生长发育、抗逆抗病等多种生理过程(Neish,
1960)。Nakashima等(1997)发现在百日草细胞分
化的过程中，木质素合成和管状分子形成均与PAL
活性增加呈正相关；Pellegrini等(1994)的研究表
明，在正常的生理条件下，烟草PAL基因的表达很
弱，而机械损伤可以诱导其短暂的中度表达。Hu
等(2009)发现，被蛾子幼虫取食之后，杨树该叶片
及附近叶片的PAL活性均显著升高，并引起系统性
的防御反应；在许多植物受病原菌侵染后，PAL活
性也会有所增加，并迅速升至顶点后再次下降(江
昌俊,余有本, 2001)。PAL基因作为一个表达模式
各异、功能众多的基因，必然会为其研究带来一定
的困难。
4 结论
本实验利用不同植物PAL基因设计简并引物，
通过RT-PCR和RACE技术分离并克隆了一条洋葱
PAL 基因全长 cDNA AcPAL1(GenBank 登录号:
KF421110)。序列分析表明该基因序列全长 2 363
bp，编码包含 708个氨基酸残基的蛋白质多肽，且
与大蒜(A. sativum)、石蒜(Lycoris radiate)PAL蛋白相
似性很高；Real-time PCR分析表明，AcPAL1基因在
白皮、黄皮和红皮洋葱中表达量依次增加，而随着
鳞茎的不断膨大，其表达量却不断降低。本实验初
步证明了该基因与花青素的合成有关系，为研究该
基因同花青素合成积累之间的关系提供了部分依
据，为进一步研究洋葱花青素合成途径提供了基础
资料。
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(责任编辑 王雅兰)
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