全 文 ：福建农林大学学报(自然科学版) 第 39卷 第 3期
JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition) 2010年 5月
收稿日期:2009-11-06　　修回日期:2009-12-22
基金项目:福建省教育厅资助项目(JA07079).
作者简介:何碧珠(1960-),女 ,实验师.研究方向:园艺植物生物技术与遗传资源.通讯作者邹双全(1963-),男 , 教授级高级工程师.研究
方向:森林培育.Email:zou3789230@yahoo.com.cn.
圆齿野鸦椿叶片的植株再生及快速繁殖
何碧珠 1 , 何官榕 2 , 邹双全 3
(1.福建农林大学园艺学院;2.福建农林大学植保学院;3.福建农林大学科技开发总公司 ,福建 福州 350002)
摘要:以圆齿野鸦椿茎段继代繁殖或种子继代繁殖的幼嫩叶片为材料进行组培育苗试验 , 建立叶片植株再生和快速繁殖
的技术体系.结果表明:叶片外植体在 WPM+1.0 mg· L-1 N6-异戊烯基腺嘌呤(2ip)+1.0 mg· L-1 NAA+20 g· L-1蔗糖
+7.5g· L-1琼脂的培养基上形成黄绿色的愈伤组织 , 30 d后愈伤组织诱导率达 95.7%;丛生芽的增殖系数随 2ip和 NAA
含量的增加而加大 , 2ip含量为 1.5 mg· L-1 , NAA含量为 0.3 mg· L-1时 ,增殖系数达 3.5, WPM+2.0 mg· L-1 2ip+0.3 mg
· L-1 NAA+20 g· L-1蔗糖 +7.5 g· L-1琼脂是最适的增殖培养基;不定芽在 1/2WPM+0.5 mg· L-1 IBA+0.3 mg· L-1
NAA+20 g· L-1蔗糖 +7.5 g· L-1琼脂的培养基上生根效果较好 , 再生植株移栽的成活率达 90%以上.
关键词:圆齿野鸦椿;叶片;快速繁殖;植株再生
中图分类号:S686 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2010)03-0257-06
PlantletregenerationofEascaphiskonlshlileafandrapidpropagation
HEBi-zhu1 , HEGuan-rong2 , ZOUShuang-quan3
(1.ColegeofHorticulture;2.ColegeofPlantProtection;3.ScienceandTechnologyDevelopment
Corp.Company, FujianAgricultureandForestryUniversity, Fuzhou, Fujian350002, China)
Abstract:Thetissuecultureexperimentwasconductedwiththematerialofyoungleavesofstemsectsubcultureorseedsubculture
ofEascaphiskonlshliHayatatodeveloptechnicalsystemofE.konlshliplantletregenerationandrapidpropagation.Theresults
showedthatyelowgreencalicouldbeformedfrom95.7%leafexplantsculturedinvitrofor30 daysonWPMmediumcontaining1.
0 mg· L-1 2ipand1.0mg· L-1 NAA.Budmultiplicationcoeficientincreasedwiththeincreaseofconcentrationof2ipandNAA,
whentheyseparatelyreached1.5 mg· L-1 and0.3mg· L-1 , multiplicationcoefficientwas3.5.WPMmediumsupplementedwith
2.0 mg· L-1 2ipand0.3mg· L-1 NAAwasoptimumproliferationmedium.Adventitiousbudhasabeterrootingresultandformed
regeneratedplantson1/2WPMmediumsupplementedwith0.5mg· L-1 IBAand0.3mg· L-1 NAA.Thesurvivalratesofregener-
atedplantsweremorethan90%.
Keywords:Eascaphiskonlshli;leave;rapidpropagation;plantletregeneration
圆齿野鸦椿(EascaphiskonlshliHayata)属省沽油科野鸦椿属 ,别名花溴木 ,树高达 6 m,枝无毛 ,暗红
色 ,花期 4-5月份 ,果熟期 9-10月份 [ 1] ,树皮可制栲胶[ 2] ,根或根皮 、花和干果均可供药用 ,种子含脂肪
油 25%-30%,可制皂 ,是我国特有的乡土观赏树种.圆齿野鸦椿种皮坚硬致密 ,透水透气性差 ,种子还存
在着深度休眠 、发芽率低 、育苗时间长(需 2 a)、播种繁殖比较困难等问题 [ 3] .目前 ,圆齿野鸦椿利用扦插
繁殖取得了一定的成效 ,但最终成苗的不多 ,最多只有 22%生根成苗 ,且营养体 、刀具及土壤传递给后代
的病毒很难消除 ,而组织培养可以解决上述问题.但在试验过程中 ,圆齿野鸦椿的种子外壳坚硬 、细小 ,很
难获得完整的胚体;若以茎段为材料 ,由于茎段芽与茎之间有个分层 ,导致消毒很难进行 ,造成污染率高 ,
且取材受时间限制 ,培养过程中均不同程度地出现玻璃化 、褐化等现象.因此 ,本试验利用圆齿野鸦椿茎段
继代繁殖或种子继代繁殖的幼嫩叶片为材料进行组织培养 ,以获得再生植株.组织培养育苗时间短 ,不受
季节变化的影响 ,可在任何季节在较短的时间内培育出大量的苗木 ,为珍贵乡土树种的大面积种植和开发
利用提供参考.
DOI :10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2010.03.012
1　材料与方法
1.1　材料
以圆齿野鸦椿茎段繁殖或种子播种形成的繁殖材料在继代转接过程中去除的无菌幼嫩叶片为诱导材
料 ,由福建邵武市锦溪天成苗木有限公司提供.
1.2　方法
1.2.1　培养基的配制　基本培养基为 WPM或 1/2WPM,附加 20 g· L-1蔗糖 、7.5 g·L-1琼脂 , pH5.8;植
物生长调节剂为 N6-异戊烯基腺嘌呤(2ip)、NAA、IBA;附加物为活性炭.
1.2.2　培养条件　接种材料的培养条件:温度(25±2)℃,光照时间 12 h· d-1 ,光照度 1200-2000 lx.
1.2.3　生长调节剂的种类和含量对叶片诱导愈伤组织影响的试验　取大小切成 1.5 cm×1.5cm、无污染
的叶片进行诱导培养 ,以 WPM为基本培养基 ,配制一组含有 2ip和 NAA的培养基 ,配比的 2ip含量分别为
0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1 , NAA含量分别为 0.1、0.5、1.0 mg·L-1 ,每个处理接 10瓶 、重复 3次 ,每瓶接外
植体 3个.
1.2.4　生长调节剂的种类和含量对丛生芽诱导影响的试验　将萌发的诱导芽切成 0.5cm的小块 ,转接在
附加不同含量 2ip(0.5、1.0、1.5 mg· L-1)、NAA(0.1、0.3、0.5 mg·L-1)的 WPM培养基上.每个处理接 10
瓶 、重复 3次 ,每瓶接种 5个芽 ,培养 30 d后调查丛生芽的诱导情况.
1.2.5　生长调节剂的种类和含量对芽增殖影响的试验　为了选择适合叶片增殖培养的培养基 ,对 2ip
(0.5、1.0、2.0mg·L-1)、NAA(0.1、0.3、0.5 mg· L-1)的不同组合进行筛选.每个处理接 10瓶 、重复 3次 ,
每瓶接外植体 3个.
1.2.6　生长调节剂的种类和含量对根诱导影响的试验　当丛生芽长至 2 cm高时 ,将芽分割成单株 ,转接
到不同的生根培养基上.每种处理接 10瓶 、重复 3次 ,每瓶接 5株 , 40d后统计生根情况.
1.3　数据分析
所有处理均重复 3次 ,取平均值.采用 DPS软件对数据进行统计分析.
2　结果与分析
2.1　生长调节剂的种类和含量对叶片诱导愈伤组织的影响
用 2ip和 NAA配比的培养基培养 1周左右叶片开始卷曲 , 4周后叶片切口开始膨大 ,并逐渐形成黄绿
色的愈伤组织.愈伤组织在前期的生长速度缓慢 , 5周后愈伤组织的生长速度开始加快 ,部分开始分化出
小芽(表 1).
表 1　生长调节剂的种类和含量对叶片诱导愈伤组织的影响 1)
Table1　Theefectsofhormonekindsandlevelsonleafcallus
生长调节剂 /(mg· L-1)
2ip NAA 调查叶片数 形成的愈伤组织数
愈伤组织诱
导率 /% 不定芽状态
0.5 0.1 70 35 50.0 绿色健壮
0.5 0.5 70 40 57.1 绿色健壮
0.5 1.0 70 43 61.4 绿色健壮
1.0 0.1 70 65 92.8 绿色健壮
1.0 0.5 70 67 95.7 绿色健壮 ,有芽点
1.0 1.0 70 67 95.7 绿色健壮 ,有芽点
1.5 0.1 70 45 64.3 绿色健壮
1.5 0.5 70 48 68.6 绿色健壮
1.5 1.0 70 53 75.7 绿色健壮
2.0 0.1 70 32 45.7 淡绿色 ,不健壮
2.0 0.5 70 27 38.6 淡绿色 ,不健壮
2.0 1.0 70 30 42.9 淡绿色 ,不健壮
　　1)基本培养基为 WPM,添加 20g· L-1蔗糖 、7.5g· L-1琼脂 , pH 5.8.
258 福建农林大学学报(自然科学版) 第 39卷　
　　从表 1可以看出 ,在培养基中添加 2ip和 NAA,叶片愈伤组织的诱导率为 38.6%-95.7%,诱导率最
高时 ,不定芽绿色健壮 ,并有芽点.同一生长调节剂不同含量诱导的效果不同 ,在供试含量范围内诱导率与
生长调节剂的含量呈正比 ,但当生长调节剂的含量达到一定量时 ,诱导率变化不大 ,不定芽还可能出现芽
点或呈淡绿色.可见 ,叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为 WPM+1.0 mg·L-1 2ip+1.0mg·L-1 NAA+20
g· L-1蔗糖 +7.5 g·L-1琼脂 ,愈伤组织诱导效果好(图 1A、1B).
A:离体叶肉栅栏组织直接脱分化产生的不定芽;B:愈伤组织产生的不定芽;C:叶片表皮细胞脱分化后形成的胚状体;D:叶细胞
建立的植物体细胞快速无性繁殖体系;E:叶肉栅栏组织脱分化 、胚状体 、愈伤组织形成的丛生芽;F:长根后的芽苗.
图 1　圆齿野鸦椿芽的诱导 、增殖和生根效果
Fig.1　InductionproliferationandrootingofE.konlshli
从表 2可以看出 ,生长调节剂的种类和含量对叶片愈伤组织的诱导有显著影响.除 1.0mg· L-1 2ip+
0.5 mg· L-1 NAA组合与 1.0mg·L-1 2ip+1.0mg· L-1 NAA组合的差异不显著(P>0.05)外 ,其他组合
间的差异达极显著水平(P<0.01),而后者的诱导率高 ,成本更低 ,这也进一步证实了上述结果.
表 2　生长调节剂的种类和含量对叶片愈伤组织诱导效应的方差分析
Table2　Varianceanalysisoftheinducingsituationofhormonekindsandlevelsonleafcalus
变异来源 平方和 自由度 均方 F P
处理间 13913.908 11 1264.901 186.954 0.000
处理内 162.380 24 6.766
总变异 14076.288 35
2.2　生长调节剂的种类和含量对丛生芽诱导的影响
将愈伤组织块或丛生芽块分切后转接到添加不同含量 2ip和 NAA的固体培养基上进行继代培养 ,可
得到大量的不定芽(表 3).一般一个月可继代 1次 ,继代时间相隔太长(大于 5周),基部出现褐化 ,严重的
导致死亡 ,不利于进一步增殖.培养基单独使用生长激素 ,缺少细胞分裂素 ,不利于丛生芽的增殖.丛生芽
增殖系数随 2ip和 NAA含量的增加而加大 , 2ip含量为 1.5 mg·L-1 , NAA含量为 0.3 mg· L-1时 ,增殖系
数达 3.5.但随生长调节剂含量的增加 ,丛生芽分化增多开始变细显弱.可见 , 2ip的含量不宜太高 , 1.0 mg
· L-1 2ip+0.5 mg· L-1 NAA最为合适 , WPM+1.0 mg· L-1 2ip+0.5 mg· L-1 NAA+20 g· L-1蔗糖 +
7.5 g·L-1琼脂为最佳继代培养基 ,芽的生长情况较好(图 1C、1D).
在增殖培养的过程中 ,连续多代使用高含量的生长调节剂 ,容易引起分化芽的变异和玻璃化 ,不利于
分化芽下一步的壮苗和生根培养.多代培养达到 5代以后 ,最好使用低含量生长调节剂或不添加生长调节
剂与高含量生长调节剂隔代交替培养的办法 ,避免分化芽变异或常璃化.
从表 4可以看出 ,生长调节剂的种类和含量对丛生芽的诱导存在极显著差异(P<0.01).1.0mg· L-1
2ip+0.5 mg·L-1 NAA组合与 1.0mg· L-1 2ip+0.3mg· L-1 NAA、1.5mg· L-1 2ip+0.1mg· L-1 NAA、
259　第 3期 何碧珠等:圆齿野鸦椿叶片的植株再生及快速繁殖
1.5 mg· L-1 2ip+0.3 mg· L-1 NAA、1.5 mg·L-1 2ip+0.5 mg·L-1 NAA组合两两间的差异未达到显著
水平(P>0.05),但均与 0.5mg· L-1 2ip+0.1mg·L-1 NAA、0.5mg·L-1 2ip+0.3 mg·L-1 NAA、0.5 mg
· L-1 2ip+0.5 mg· L-1 NAA、1.0 mg· L-1 2ip+0.1 mg·L-1 NAA组合达显著水平(P<0.05).
表 3　生长调节剂的种类和含量对丛生芽诱导的影响 1)
Table3　Theefectofhormonekindsandlevelsoninducingmultipleshoots
生长调节剂 /(mg· L-1)
2ip NAA
调查的外植
体数
丛生芽增殖
倍数 芽的生长情况
0.5 0.1 50 1.5 芽短 ,生长慢 ,丛生芽少
0.5 0.3 50 1.7 芽长势一般 ,生长慢,丛生芽少
0.5 0.5 50 2.0 芽壮实 ,抽生快 ,丛生芽少
1.0 0.1 50 2.2 芽壮实 ,抽生快 ,丛生芽少
1.0 0.3 50 3.0 芽壮实 ,抽生快 ,丛生芽少
1.0 0.5 50 3.2 芽壮实 ,抽生快 ,丛生芽多
1.5 0.1 50 3.4 芽细弱 ,抽生快 ,丛生芽多
1.5 0.3 50 3.5 芽细弱 ,抽生快 ,丛生芽多
1.5 0.5 50 3.4 芽细弱 ,抽生快 ,丛生芽多
　　1)基本培养基为 WPM,添加 20g· L-1蔗糖 、7.5g· L-1琼脂 , pH 5.8.
表 4　生长调节剂的种类和含量对丛生芽诱导效应的方差分析
Table4　Varianceanalysisoftheefectofhormonekindsandlevelsoninducingmultipleshoots
变异来源 平方和 自由度 均方 F P
处理间 15.367 8 1.921 22.163 0.000
处理内 1.560 18 0.087
总变异 16.927 26
2.3　生长调节剂的种类和含量对芽增殖的影响
表 5表明:随着生长调节剂含量的增加 ,芽的增殖倍数也增大;但含量太低 ,芽的长势不好 ,影响分化
芽的正常生长.可见 , WPM+2.0 mg·L-1 2ip+0.3 mg·L-1 NAA+20 g·L-1蔗糖 +7.5 g·L-1琼脂是最
佳培养基 ,芽可得到最佳的增殖效果 ,生长状态好(图 1E).
表 5　生长调节剂的种类和含量对芽增殖的影响 1)
Table5　Theefectofhormonekindsandlevelsonbudmultiplication
生长调节剂 /(mg· L-1)
2ip NAA 增殖倍数 一个月后分化芽的生长势
0.5 0.1 0.5 大部分出现芽 ,长势弱
0.5 0.3 0.8 大部分出现芽 ,长势弱
0.5 0.5 1.3 少量出现芽 ,芽稍绿
1.0 0.1 1.6 少量出现芽 ,芽稍绿
1.0 0.3 2.0 芽健壮 ,浓绿 ,长势弱
1.0 0.5 2.3 芽健壮 ,浓绿 ,长势弱
2.0 0.1 2.6 芽健壮 ,浓绿 ,生长正常
2.0 0.3 3.0 芽健壮 ,浓绿 ,生长正常
2.0 0.5 2.8 芽健壮 ,浓绿 ,生长正常
　　1)基本培养基为 WPM,添加 20g· L-1蔗糖 、7.5g· L-1琼脂 , pH 5.8.
从表 6可以看出 ,生长调节剂的种类和含量对芽增殖的影响差异极显著.2.0 mg· L-1 2ip+0.3 mg·
L-1 NAA组合与 2.0mg· L-1 2ip+0.5mg·L-1 NAA组合的差异不显著(P>0.05),但与其他处理间的差
异达显著水平(P<0.05), 2.0 mg· L-1 2ip+0.3 mg·L-1 NAA组合的增殖倍数更高 ,这进一步证实了上
述结果.
2.4　生长调节剂的种类和含量对根诱导的影响
表 7表明:试管苗在 1/2WPM固体培养基中 ,生长调节剂配比含量不同 ,生根效果也不同;同一生长
调节剂不同含量 ,生根数和根长也不相同 ,基本上随着生长调节剂含量的增加 ,根数变多 ,但达到一定含量
260 福建农林大学学报(自然科学版) 第 39卷　
时则变化不大.0.5mg· L-1 IBA+0.1mg·L-1 NAA组合的生根数没有 0.5 mg· L-1 IBA+0.3 mg· L-1
NAA、0.5 mg· L-1 IBA+0.5 mg· L-1 NAA组合高 ,但根长得长.可见 , 1/2WPM+0.5 mg· L-1 IBA+0.1
mg·L-1 NAA+20g· L-1蔗糖 +7.5 g·L-1琼脂是最佳培养基 ,生根效果较理想(图 1F).
表 6　生长调节剂的种类和含量对芽增殖效应的方差分析
Table6　Varianceanalysisofeffectofhormonekindsandlevelsonbudmultiplication
变异来源 平方和 自由度 均方 F P
处理间 18.887 8 2.361 78.987 0.000
处理内 0.538 18 0.030
总变异 19.425 26
表 7　生长调节剂的种类和含量对试管苗生根的影响 1)
Table7　Theefectofhormonekindsandlevelsonshootrootingoftheplantlet
生长调节剂(mg· L-1)
IBA NAA 调查株数 生根数 根长 /cm
0.1 0.1 50 20 1.5
0.1 0.3 50 26 1.7
0.1 0.5 50 30 2.0
0.3 0.1 50 32 2.6
0.3 0.3 50 35 3.1
0.3 0.5 50 38 3.5
0.5 0.1 50 48 3.9
0.5 0.3 50 49 3.2
0.5 0.5 50 49 3.1
　　1)基本培养基为 1/2WPM,添加 20g· L-1蔗糖 、7.5g·L-1琼脂 , pH5.8.
由表 8可以看出 ,生长调节剂的种类和含量对根长和生根数均产生显著影响 ,差异达极显著水平.不
同培养基对根长的影响存在着差异 , 0.5mg·L-1 IBA+0.1 mg· L-1 NAA组合与其他组合间的差异显著
(P<0.05);不同培养基的生根数也不同 ,除 0.5 mg· L-1 IBA+0.1 mg· L-1 NAA组合与 0.5 mg· L-1
IBA+0.3mg· L-1 NAA和 0.5 mg·L-1 IBA+0.5 mg· L-1 NAA组合间的差异不显著外(P>0.05),与其
他组合间的差异均显著(P<0.05).
表 8　生长调节剂的种类和含量对试管苗生根效应的方差分析
Table8　Varianceanalysisofefectofhormonekindsandlevelsonshootrootingoftheplantlet
变异来源 平方和 自由度 均方 F P
根长　 处理间 16.740 8 2.093 116.754 0.000
处理内 0.323 18 0.018
总变异 17.063 26
生根数 处理间 2682.000 8 335.250 45.716 0.000
处理内 132.000 18 7.333
总变异 2814.000 26
2.5　试管苗的移栽
当圆齿野鸦椿试管苗长至 3-4cm高 ,叶片数 5-7片 ,根数 3-5条 ,长 2-3 cm时 ,就可进行移栽.
移栽前将培养物移放在自然条件下室内炼苗 3-5 d,将长好根的瓶盖打开炼苗 2-3d,让试管苗逐步适应
外界环境.试管苗从培养瓶中取出后洗去根部培养基 ,移入蛭石和腐殖土(1∶2)混合的基质中 ,保湿遮阴 ,
成活率可达 90%以上.
3　结论与讨论
(1)目前 ,对于圆齿野鸦椿的繁殖研究已取得了一定进展 ,但仍存在许多不足之处:扦插繁殖虽然可
以通过枝条扦插形成愈伤组织 ,但最终成苗的数量不多 ,最多只有 22%生根成苗 ,成活后的长势和干形与
实生苗不相上下 ,且通过营养体 、刀具及土壤传递给后代的病毒很难被消除 ,不断累积 ,导致病毒病越来越
严重.种子繁殖虽有可能排除病毒病 ,但存在深度休眠 ,发芽率低 ,育苗时间长且后代易产生分化 、无法保
261　第 3期 何碧珠等:圆齿野鸦椿叶片的植株再生及快速繁殖
持母本优良性状的缺点.利用种子或茎段进行组织培养可以解决上述问题 ,但成活率只有 20%,取材受时
间限制(只能在每年的 11月份至翌年的 1月份),种子外壳坚硬 、细小 ,要取得完整的胚很困难.茎段芽与
茎之间有个分层导致消毒很难进行 ,污染率高 ,玻璃化 、褐化现象也难以消除.而以茎段繁殖或种子播种形
成的叶片作为繁殖材料避免了根状茎内含微生物过多而不易消毒 、污染率高等缺点 ,消毒过程也不会直接
伤害外植体 ,因此在组织培养中非常合适作为外植体 [ 4] .目前对黄桐 [ 5] 、猕猴桃[ 6] 、芳樟 [ 7] 、曼地亚红豆
杉 [ 8]等植物的组织培养进行了不同程度的研究 ,但对圆齿野鸦椿叶片再生植株的研究尚未涉及.
(2)圆齿野鸦椿愈伤组织的形成和生长受多种因素的影响 ,生长调节剂的种类和含量配比是诱导愈
伤组织的主要因素.Chabaneetal[ 9]用海枣叶片原生质成功诱导出生长良好的愈伤组织.研究表明 ,从叶片
中诱导愈伤组织是进行植株再生的基本方法 [ 10] ,具有易于繁殖 、生长同步 、培养条件可以控制等优点.本
试验结果表明 , WPM+2.0 mg·L-1 2ip+0.3 mg· L-1 NAA+20 mg· L-1蔗糖 +7.5 mg· L-1琼脂是叶片
外植体增殖的最佳培养基 ,芽可得到最佳的增殖效果 ,生长状态好.
(3)不同生长调节剂的生根效果不同.同一生长调节剂不同含量 ,生根数和根长也不相同 ,基本上随
着含量的增加 ,根数变多 ,但达到一定量时则变化不大.1/2WPM+0.5mg· L-1 IBA+0.1 mg·L-1 NAA+
20 mg· L-1蔗糖 +7.5 mg· L-1琼脂是根诱导效果较佳的培养基 ,生根率达 96%.
(4)圆齿野鸦椿试管苗的移栽基质必须选用透水 、透气性强的材料 ,选用蛭石和腐殖土(1∶2)的混合
基质.移栽前先移放在自然条件下室内炼苗 3-5 d,将长好根的瓶盖打开炼苗 2-3 d,让试管苗逐步适应
外界环境 ,提高移栽的成活率.
参考文献
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(责任编辑:施晓棠)　　
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