全 文 ：臭柏枝叶精油的体外抑菌活性
郭秀艳1 ,包丽华1 ,张国盛1＊ ,王林和1 ,王文明2
(1.内蒙古农业大学生态环境学院 , 内蒙古呼和浩特 010019;2.内蒙古乌审旗林业局,内蒙古察布达克 017300)
摘要　[目的 ]探讨臭柏精油在抑菌 、抗菌领域应用前景。 [方法]采用纸片扩散法、连续稀释法和自然沉降法对臭柏精油体外抗菌活性
进行了测定。 [结果]臭柏精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 、黑曲霉、酵母菌的抗菌圈直径分别为(16.2±2.3)、(8.4±
1.3)、(26.2±5.1)、(16.7±2.1)、(18.0±2.4)mm;最低抑菌浓度(MIC)分别为 0.50%、10.00%、0.25%、7.50%和 0.50%。对室内空气
中菌类的平均抑菌率达 43.3% 。臭柏精油对 5种菌的抑菌活性强度为枯草芽孢杆菌>大肠杆菌、酵母菌>黑曲霉>金黄色葡萄球菌。
[结论]臭柏精油有较强的抑菌活性 ,是一种很有价值和开发前景的芳香油植物资源。
关键词　臭柏;精油;抑菌活性
中图分类号　S794.9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)04-01607-04
InvitroAntibacterialActivityoftheEssentialOilofSabinavulgarisBranchLeaves
GUOXiu-yanetal　(InnerMongoliaAgriculturalUniversity, Huhhot, InnerMongolia010019)
Abstract　[ Objective] TheaimofthisstudywastoprovidethescientificbasisforapplicationofSabinavulgarisessentialoilintheantibacte-
rialarea.[ Method] Determiningtheantibacterialactivityoftheessentialoilofsabinavulgarisinvitrobyusingdiskdifusionmethod, serial
dilutionmethodandnaturalsedimentationmethod.[ Result] Itwasfoundthatthediametersofinhibitionzoneandthelowestinhibitorycon-
centration(MIC)were:Escherichiacoli(16.2±2.3)mm, 0.50%;Staphylococcusaureus(8.4±1.3)mm, 7.50%;Bacilussubtilis(26.2±
5.1)mm, 0.25%;Aspergilusniger(16.7±2.1)mm, 1.00%;Yeast(18.0±2.4)mm, 0.50%.Totheindoorbacteria, theaverageofinhibi-
toryratewas43.3%.Thestrengthofantibacterialactivity:Bacillussubtilis>Escherichiacoli, Yeast>Aspergillusniger>Staphylococcusau-
reus.[ Conclusion] Sabinavulgarisessentialoil, whichhasquitestrongantibacterialactivity, enjoysaprosperousmarketingprospect.
Keywords　Sabinavulgaris;Essentialoil;Antibacterialactivity
基金项目　内蒙古农业大学资助项目。
作者简介　郭秀艳(1967-),女 ,内蒙古赤峰人,博士研究生 ,研究方向:
沙地植物资源保护与利用。 ＊通讯作者:zgsemail@163.com。
收稿日期　 2008-11-4
　　臭柏(SabinavulgarisAnt.)又称沙地柏 、叉子圆柏 、新疆
圆柏及爬地柏等 [ 1] , 属柏科圆柏属常绿葡匐灌木。臭柏不
仅具有生态作用 [ 2-5] ,更重要的是其枝 、叶和种子等可以入
药 ,主治多种疾病 [ 6] 。 20世纪 90年代以来 ,国内外学者对臭
柏精油及提取物的化学成分进行了研究 ,已从中分离出多种
萜类 、木质素类 、酚类及烃类物质 ,并认为其中一些成分具有
抗癌活性 [ 7] 。西北农林科技大学无公害农药研究服务中心
的研究发现 ,臭柏的丙酮粗提物对赤拟谷盗和玉米象的种群
抑制率较高 ,臭柏种子石油醚粗提物对玉米象种群形成抑制
率可达到 100%[ 8-9] 。臭柏精油对多种害虫有很强的熏蒸毒
杀 、触杀 、拒食和抑制种群形成活性 [ 10] 。此外 ,祖丽皮亚 ·
玉努斯报道了新疆圆柏枝皮乙醇提物对致病菌的抑制及食
物的防腐性能 [ 11] 。可见 ,臭柏精油及其粗提物作为一种生
物防护剂具有广泛的开发前景。据报道 ,全球 41种主要传
染病中 ,经空气传播的有 14种之多 [ 12] ,因此 ,有效的空气消
毒及净化是预防疾病发生的重要措施之一 ,其中非人工合成
的植物精油越来越受人们重视 。利用臭柏枝叶提取的精油
用作空气清新剂进行开发和利用的报道较少 ,为此 ,笔者测
试了臭柏精油对条件致病菌大肠杆菌(Escherichiacoli)、病
源菌金黄色葡萄球菌 (Staphylicocusaureus)及枯草芽孢杆
菌(Bacilussubtilis)黑曲霉 (Aspergilusniger)和酵母菌
(Sacharomycescerevisiae)的抑菌活性 ,以及对室内空气微生
物的抑菌生物活性 ,探讨臭柏精油在抑菌 、抗菌以及食品防
腐领域的应用前景 ,旨在为臭柏精油的产业化开发提供科
学依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
(1)臭柏精油。 4月份于内蒙古农业大学科技园区采集
臭柏枝叶 ,利用水蒸汽蒸馏法提取其精油 ,将精油置于棕色
的玻璃瓶子中 ,于 4 ℃密封保存备用。
(2)试验菌种。试验所用的大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、
枯草芽孢杆菌 、黑曲霉和酵母菌皆由内蒙古农业大学生物工
程学院微生物实验室提供。
(3)固体培养基。①牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌)。
牛肉膏 3g,蛋白胨 5 g, NaCl5 g,蒸馏水 1 000 ml,琼脂 15 ～
20 g,调节 pH值至 7.4～ 7.6,然后 121℃蒸汽灭菌 30 min。②
马铃薯培养基(培养真菌)。取去皮马铃薯 200 g,切成小块 ,
在锅中加水 1 000 ml煮沸 30 min,用双层纱布过滤 ,取其滤
液 ,加入蔗糖(或葡萄糖)20 g,加琼脂 20 g,用蒸馏水定容到
1 000 ml, pH值自然 , 121℃蒸汽灭菌 30 min。③高氏一号培
养基(培养放线菌)。可溶性淀粉 20g, NaCl0.5g, KNO3 1 g,
K2 HPO4 · 3H2O0.5 g, MgSO4 · 7H2O0.5 g, FeSO4 · 7H2 O
0.01 g,琼脂 15 ～ 20 g,蒸馏水 1 000 ml, pH值 7.4 ～ 7.6,
121℃蒸汽灭菌 30min。
(4)液体培养基。在上述制备方法中 ,不加入琼脂就制
成相应的液体培养基。
1.2　方法
1.2.1　微生物生长曲线的测定。浊度法测定 [ 13]大肠杆菌培
养 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌 、酵母菌的生长曲线:将
大肠杆菌培养 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌在 37 ℃、酵
母菌在 28℃分别培养 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h,
利用 T6新世纪紫外可见光分光光度计在波长 760nm处测
定大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌的 OD值 ,在
600nm处测定酵母菌 OD值 ,绘制供试菌的生长曲线。黑曲
霉生长曲线的测定采用称重法 [ 14] 。将供试菌种 28℃分别培
安徽农业科学, JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(4):1607-1610 责任编辑　张杨林　责任校对　屈满义
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2009.04.054
养 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h后 ,收集菌体 ,烘
干至恒重 ,采用精度为 0.001 g电子天平称量菌体重量 ,绘制
生长曲线。
1.2.2　菌悬液的配备。根据大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、枯
草芽孢杆菌生长曲线 ,当其 OD值达 0.8时 ,抽取菌液
0.5 ml,加入无菌水倍比稀释到 105 ～ 106 CFU/ml;抽取 OD
值为 1.2时的酵母菌液 ,加入无菌水稀释到 105 CFU/ml,用
于抑菌活性测定。
黑曲霉菌悬液制备:用 10 ml无菌水将长有成熟孢子的
斜面上的孢子洗脱到三角瓶 ,加入 100ml液体培养基和玻璃
珠 ,在摇床(200r/min)上培养 18 h后 ,用经灭菌的脱脂棉过
滤 2次 ,将滤液放在振荡器上混匀 ,加入无菌水对倍稀释 ,镜
检制成 107 ～ 108 CFU/ml单孢悬液 ,用于抑菌活性测定。
1.2.3　体外抑菌活性的测定 。
(1)抑菌圈直径。采用纸片扩散法 [ 15] 。用打孔器将滤
纸制成直径为 6mm的小圆纸片 ,干热灭菌后 ,备用。在灭菌
的培养皿(D=90 mm)内加入相应菌种的固体培养基 15 ～
20 ml,制成营养平板 ,抽取供试菌悬液各 100μl到相应菌种
的培养平板上 ,涂抹均匀 。然后在每个营养平板中均匀 、平
展放入 3片滤纸片 ,其中在 2个上分别滴加臭柏精油 20 μl,
1个滤纸片加 20μl无菌水作对照(枯草芽孢杆菌采用精油
与对照各 1个滤纸片)。在 37℃培养箱恒温培养 24h后 ,测
定大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌抑菌圈直径 ,在
28 ℃培养箱内恒温培养 48 h后 ,测定黑曲霉 、酵母菌抑菌圈
直径。重复试验 3次。
(2)最小抑菌浓度(MIC)。采用连续稀释法 [ 16] 。以丙
酮为溶剂 ,配制一系列梯度浓度的精油溶液 ,将该梯度浓度
的精油溶液加入已融化好的培养基中 ,混合均匀 ,使培养基
中含精油的浓度为 10.000%、7.500%、5.000%、2.500%、
1.250%、1.000%、0.500%、0.250%、0.125%。待培养基冷
却凝固后 ,平板划线接种供试菌 ,按前述条件培养 ,观察结
果 ,每一精油浓度梯度作 3组平行试验 ,与对照组(菌落生长
正常)比较 ,有肉眼可见菌落生长者为无抑制作用 ,以完全没
有菌生长的最低精油浓度为其最低抑菌浓度(MIC, themini-
muminhibitoryconcentration),以丙酮 、无菌蒸馏水作对照 ,分
别测得臭柏精油对 5种试验菌的 MIC值。
(3)室内空气抑菌率 。采用自然沉降法测定 [ 17] 。将灭
菌的牛肉膏蛋白胨培养基 、马铃薯蔗糖培养基 、高氏一号培
养基(15～ 20ml)倾注在 9cm培养皿中冷却备用。将长 40 cm
宽 36 cm高 35 cm的测试箱在紫外光下灭菌 20min, 放置在
距地面 1.3 m的平台上。然后将上述制备好培养基的培养
皿放入测试箱的底部 ,打开培养皿上盖 ,盖好测试箱 ,通过特
制的喷洒口向测试箱内喷洒 100μl臭柏精油 ,使精油雾化均
匀 ,不要使精油直接喷在培养基上 ,然后迅速密闭喷洒口 ,
在室温(24℃左右)下 20 min后打开测试箱盖 ,盖上皿盖 ,贴
上标签 , 牛肉膏蛋白胨培养基置于 37℃恒温箱中培养 24h,
马铃薯蔗糖培养基置于 28 ℃恒温箱中培养 48 h,高氏一号
培养基于 28℃恒温箱中培养 72 h,记录各皿菌落 ,计算单位
体积抑菌率。以未加精油自然沉降菌落数为对照。
Y=[DS-CS] /DY×100%
式中 , Y为抑菌率;DS为对菌落数;CS为精油处理菌落数 。
2　结果与分析
2.1　几种菌种生长曲线　试验结果表明 ,大肠杆菌 、金黄色
葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌生长 、酵母菌生长曲线(图 1)和黑
曲霉生长曲线(图 2)均呈 “S”形。 3种细菌的对数生长期:金
黄色葡萄球菌为 4 ～ 16 h,大肠杆菌为 4 ～ 14 h;枯草芽孢杆
菌为 8～ 24 h。在生长速度上 ,金黄色葡萄球菌最快 ,大肠杆
菌居中 ,枯草芽孢杆菌最慢 。OD值达 0.8时 , 3种细菌所需
的时间也不一致 ,金黄色葡萄球菌需要培养 7 ～8 h;大肠杆菌
需要 8～ 9h;枯草芽孢杆菌需要 13 ～ 14h(图 1)。酵母菌 0～
14h为延滞期 , 14～ 26h为对数生长期 , 26h后生长开始衰退。
培养对数生长期中 ,当 OD值达 1.2时需要 22h(图 1)。黑曲
霉 0 ～ 8h为延滞期 , 16 ～ 36h为对数生长期 , 3 2h后生长开
始衰退(图 2)。以培养 20h时的菌液作为供试菌液。
注:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的为 OD760nm值;酵
母菌的为 OD600nm值。
Note:OD7 60nm forEscherichiacoli, Staphylococcuseureu.andBacilus
subtilis;OD600nm forYeasts.
图 1　几种菌种的生长曲线
Fig.1　Growthcurveoffourbacteria
2.2　臭柏精油的抑菌圈直径大小　臭柏精油对试验用的 5
种菌种均有很好的抑菌性 ,对大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、枯
草芽孢杆菌 、黑曲霉 、酵母菌的抑菌圈直径分别为(16.2 ±
2.3)、(8.4±1.3)、(26.2±5.1)、(16.7±2.1)、(18.0±2.4)mm,无
菌水对照均为 6 mm,其中对枯草芽孢杆菌的抗性最强 ,对金
黄色葡萄球菌的抗性最弱。对试验菌种形成的抑菌圈直径
(图 3)大小因菌而异。根据抑菌圈试验判定标准:即抑菌圈
图 2　黑曲霉生长曲线
Fig.2GrowthcurveofAspergilusniger
·1608· 　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
注:A为臭柏精油;B为对照。
Note:A.Sabinavulgaris;B.CK.
图 3　臭柏精油的抑菌作用
Fig.3　InhibitoryeffectofSabinavulgaris
直径大于 20 mm为极敏;15 ～ 20 mm为高敏;10 ～ 15 mm为
中敏;7 ～ 9mm为低敏 ,小于 7 mm为不敏感。臭柏精油对
大肠杆菌 、黑曲霉 、酵母菌的抑菌程度为高敏;对枯草芽孢杆
菌为极敏;对金黄色葡萄球菌为低敏。
2.3　臭柏枝叶精油对不同菌种的最小抑菌浓度　由表 1可
知 ,臭柏精油对于枯草芽孢杆菌的抗性最强 ,当达到 0.250%
时试管中已没有菌落被检测出来;其次是大肠杆菌 、酵母菌 ,
臭柏精油对它的最低抑制浓度为 0.500%;黑曲霉的最低抑
制浓度为 1.000%;对于金黄色葡萄球菌的抗菌性相对最弱 ,
最低抑制浓度为 10.000%。
表 1　臭柏精油对细菌的最低抑菌浓度
Table1　MICofessentialoilofSabinavulgarisonMycorrhizalspecies
供试菌种
Mycorrhizalspecies
对照 CK
无菌水 Asepticwater 丙酮 Acetone
精油浓度 Concentrationofessentialoil∥%
10.00 0 7.500 5.000 2.500 1.250 1.000 0.500 0.250 0.125
大肠杆菌EscherichiaColi +++ +++ - - - - - - - + ++
金黄色葡萄球 StaphylococusAureus +++ +++ - - + ++ ++ ++++++++++++
枯草芽孢杆菌 BacilusSubtilis +++ +++ - - - - - - - - +
黑曲霉 AspergilusNiger +++ +++ - - - - - - + ++ +++
酵母菌 Yeast +++ +++ - - - - - - + + ++
注;-为无菌生长;+为少量菌生长;++为较多菌生长但可计数;+++为菌落无法计数。
Note:-meansnomicroorganisms;+meansonlyafewmicroorganisms;++meansmanymicroorganismsbutcountable;+++meansalotofmicroorganisms
anduncountable.
2.4　臭柏枝叶精油对空气中微生物的抑制能力　精油作用
20min, 90cm平皿上自然沉降的落数和对照菌落数 ,测定
结果见表 2。由表 2可知 , 100 μl臭柏精油作用于长 40 cm
宽 36cm高 35cm的测试箱中 ,经 20min后 ,将平皿 37℃
表 2　臭柏精油对空气中细菌数量的影响
Table2　EfectsofSabinavulgarisessentialoilon
bacterialnumberintheair
培养基
Medium
对照菌落数
CFU
CK
处理 20min
菌落数∥CFU
Treatment
20min
抑菌率∥%
Inhibitory
rate
牛肉膏蛋白胨培养基
Beef-proteinmedium 56.0 33.3 40.7
马铃薯蔗糖培养基
Potatosucrosemedium
30.0 15.7 47.7
高氏一号培养基
Gause1medium
19.3 11.0 43.0
合计 Total 105.3 44.3 43.3
注:为 3次平行试验结果。
Note:Abovewasthreeparalelresults.
24 h和 28 ℃48 h培养。牛肉膏蛋白胨培养基上沉降的对照
菌落数为 56.0 CFU,处理菌落数 33.2 CFU,抑菌率为
40.7 %。马铃薯培养基的真菌对照菌落数为 30 CFU,处理
菌落数 15.7 CFU,抑菌率为 49%。高氏一号培养基上的放
线菌菌落数对照为 19.3 CFU,处理菌落数 11.0CFU,抑菌率
为 45.5%。 100 μl精油作用于 0.05 m3体积的室内空气中 ,
使沉降在平皿上的总菌落数由 150.3 CFU减少到 59.7 CFU,
抑菌率为 43.3%(表 2,图 3)。
3　结论与讨论
(1)采用内蒙古地区种植的臭柏 ,提取其精油对几种空
气 、水及食品中常见菌及常见致病菌进行了定性抗菌性研
究。定性试验采用纸片扩散法测定了臭柏精油对供试菌对
数生长期的抗菌圈直径 ,其中对枯草杆菌抑制作用极敏。对
大肠杆菌 、酵母菌和黑曲霉抑制作用表现为高敏。对金黄色
葡萄球菌的抑制作用表现为低敏。
(2)臭柏精油具有较好的挥发性 ,其挥发性成分对一般
·1609·37卷 4期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　郭秀艳等　臭柏枝叶精油的体外抑菌活性
环境常见枯草芽孢杆菌作用最强 ,最小抑菌浓度为 0.25%;
对大肠杆菌 、酿酒酵母菌的最小抑制浓度都是 0.50%;对黑
曲霉的最小抑制浓度 1.00 %;对金黄色葡萄球菌的抑制作
用最弱 ,其最小抑菌浓度为 10.00%。
(3)对室内空气细菌的抑制作用 , 100 μl臭柏精油在
0.05 m3空间内作用 20 min, 90mm培养皿中沉降的细菌 、真
菌 、放线菌的抑菌率分别为 40.7%、47.7%和 43.0%。总抑
菌率为 43.3%。
(4)臭柏枝叶精油对供试菌的最小抑菌浓度与祖丽皮
亚 ·玉努斯新疆圆柏枝皮醇提物抗菌活性 [ 11]最小抑菌浓
度有差异 。分析其原因可能是取材的地点 、提取方法不同导
致的。
(5)臭柏精油具有一定的抑菌活性 ,对 5种供试菌中的
4种菌均有较强的抑制作用 ,只有对金黄色葡萄球菌的抑制
作用相对较弱 。精油中的主要抑菌成分及其抗菌机理有待
深入研究。臭柏精油是一种很有研究价值和开发前景的芳
香油植物资源 ,在抗菌领域上将会有很好的应用前景 。
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-124.
(上接第 1605页)
显的差异 ,川乌头根中 Cu含量最高 ,茎中 K、Ni、Zn含量最
高;叶中 Mn、Fe含量最高;黑顺片中 Mo、Sr含量最高 ,黄附
片中 Cr含量最高。
2.2　试验方法的准确度和精密度　为了考察试验方法的
可行性 ,以黑顺片为试样进行加标回收试验 ,每个样品中各
元素平行测定 5次 ,加标浓度及回收率见表 2。结果表明 ,
各元素加样回收率均在 92.00%～ 109.40%之间 ,相对标准
偏差为 0.29% ～ 3.42%。这说明该试验方法测定准确度
较好。
表 2　元素回收率测定结果
Table2　Resultsofrecoverytest (n=5)
元素
Element
试样测定值
∥(mg/L)
Measuredvalue
ofsample
加入量
∥(mg/L)
Dosage
测得总量
∥(mg/L)
Totalmeasured
amount
回收率
∥%
Recovery
RSD
∥%
K 153.900 100.00 263.300 109.40 1.10Mn 0.468 0.50 0.964 99.20 1.02
Ni 0.060 0.05 0.113 106.00 1.22
Cr 2.496 1.00 3.467 97.10 0.29
Ba 2.344 1.00 3.273 92.90 3.42
Cd 0.020 0.01 0.029 92.00 2.16
Pb 0.072 0.05 0.119 94.00 1.50
Cu 0.516 0.50 1.018 100.40 1.27
Fe 416.100 100.00 514.600 98.50 0.59
Zn 15.720 10.00 25.460 97.40 0.82
Mo 0.048 0.05 0.095 94.00 0.93
Sr 79.24 10.00 88.453 92.13 1.59
3　结论与讨论
(1)所测样品中含有丰富的人体所必须的微量元素
Mn、Ni、Cr、Cu、Fe、Zn、Mo和 Sr,有害痕量重金属元素 Pb和
Cd,以及微量元素 Ba。其中 K、Fe和 Zn含量最为丰富 ,该
类元素为植物生长发育所必需;乌头不同器官和附子不同
炮制品中的矿质元素含量有明显差异 ,这可能与附子的炮
制工艺有较大关系。
(2)该研究采用硝酸 -高温灰化对乌头不同器官和附
子炮制品中矿质元素进行消解 ,应用电感耦合等离子原子
发射光谱法测定样品中 12种矿质元素的含量。试验样品
加标回收率在 92.00% ～ 109.40%之间 ,相对标准偏差为
0.29% ～ 3.42%,说明该法简便 、可靠 ,具有良好的精密度
和准确度 ,可用于测定川产道地中药材乌头不同器官和附
子不同炮制品中矿质元素含量 ,也可作为道地药材乌头及
其加工中质量检测与控制的方法 。
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·1610· 　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年