全 文 ：硅胶表面亮菌甲素分子印迹聚合物的制备及其性能研究
苏立强 　张晓林 　梁云凯
(齐齐哈尔大学化学与化学工程学院　齐齐哈尔　161006)
黑龙江省教育厅项目(11511435)和齐齐哈尔市工业攻关项目(GG06-19)资助
2008-10-15收稿 , 2008-12-24接受
摘　要　采用光接枝印迹方法 ,在硅胶微球表面制备了以亮菌甲素为模板分子 、2-乙烯基吡啶为功能单
体的分子印迹聚合物 ,采用荧光法优选了功能单体及比例 ,进一步用荧光法对印迹聚合物的吸附特性和印迹
效率进行评价。结果表明 ,该印迹聚合物对模板分子具有特异吸附性能 ,印迹效率为 48.6%。
关键词　表面分子印迹　亮菌甲素　荧光光谱分析
Synthesis and Evaluation of Armillarisin A-Imprinted Polymer on Silica Surface
Su Liqiang ,Zhang Xiaolin ,Liang Yunkai
(College of Chemistry and Chemical Engineering , Qiqihar University , Qiqihar 161006)
Abstract　Armillarisin A molecularly imprinted polymer(MIP)based on photografting surface-modified polystyrene
beads as matrices and 2-vinylpyridine as the functional monomer and Armillarisin A as the template was prepared.The
functional monomer and the ratio between the template and the functional monomer were selected by the optimum from
fluorescent spectra methods.The adsorption nature and the imprinting efficiency were studied by fluorescent method.The
results showed that the MIP has specific adsorption nature to the template molecule and the apparent imprinting efficiency E ia
was 48.6%.
Keywords　Surfacemolecular impringting , Armillarisin A , Fluorescent spectrum
亮菌甲素是一种新的香豆类化合物 ,系从亮菌中提取的有效成分之一 ,临床上主要用于急 、慢性肝
炎及胆道疾病的治疗 ,是临床治疗胆道感染值得推广的良药[ 1] 。为准确测定其含量并与共存的多种香
豆素类成分分离 ,现有方法的背景干扰大 ,前处理方法复杂 。
分子印迹材料凭借其预定选择性 、高度稳定性和使用寿命长等优点 ,在分子识别 、富集 、分离和检测
等方面具有良好的应用前景。硅胶表面分子印迹聚合物与传统的本体印迹聚合物相比 ,可极大降低非
特异吸附对选择性的影响 ,减少包埋现象 ,利于模板分子的洗脱和识别 ,提高了模板分子的利用率 。功
能单体的选择等聚合物制备条件的优化 ,以及聚合物性能评价 ,常采用高效液相色谱法[ 2 ～ 5] ,也有用红
外光谱[ 6 ～ 7]及紫外光谱法[ 8] 。
本文在硅胶微球表面 ,制备了以亮菌甲素为模板分子 、2-乙烯基吡啶为功能单体的印迹聚合物 ,利
用亮菌甲素具有荧光这一特性 ,采用荧光法优选了功能单体及其比例 ,进一步用荧光法对印迹聚合物的
吸附特性和印迹效率进行评价 。结果表明 ,该印迹聚合物对模板分子具有特异吸附性能 ,印迹效率为
48.6%。这些结果为从亮菌中富集高纯度的亮菌甲素提供了新材料 ,也为印迹聚合物的制备及评价提
供理论与实验参考。
1　实验部分
1.1　试剂与仪器
RF-5301分子荧光分析仪(Shimazu , Japan);UV-Ⅱ三用紫外灯(北京智源通生物技术研究所);R-201
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DOI :10.14159/j.cnki.0441-3776.2009.08.007
旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司)。
亮菌甲素(分析纯 ,南京制药厂);丙烯酸乙二醇二甲酯(EDMA 分析纯 ,东京化成工业株式会社);2-
乙烯基吡啶(2-VP ,优级纯 ,美国 Acors 有机试剂);甲基丙烯酸(MAA ,分析纯 ,北京化工厂);丙烯酰胺
(AA ,分析纯 ,天津市凯通化学试剂有限公司);硅胶(300 ～ 400目 ,青岛海洋化工有限公司);γ-甲基丙烯
酸酰氧基三甲氧基硅烷(DB-570分析纯 ,武汉德邦化工新材料有限公司);其余试剂均为分析纯或色谱
纯。
1.2　荧光光谱分析功能单体与模板分子之间的相互作用
固定亮菌甲素的浓度为 0.5mmol L ,分别加入不同量的 MAA 、AA 、2-VP 功能单体溶液 ,振荡后放置
12h ,检测亮菌甲素荧光光谱的变化 。
1.3　硅胶的活化和硅烷化
硅胶先用 10%的盐酸回流 12h ,以除去硅胶中的少量无机杂质并增加硅胶表面的羟基数目 。用蒸
馏水洗至 pH 为中性后真空干燥备用 。
取8.6g活化硅胶和 100mL甲苯放入 250mL圆底烧瓶中 ,加入 3.2g DB-570 、1mL 三乙胺 ,加热回流
24h ,将反应后的硅胶过滤 ,经甲醇 、氯仿洗净后 ,在 50℃真空干燥。经红外光谱表征 ,在 1720cm-1出现
酯羰基的振动吸收峰 ,2980cm-1出现 —CH2 —伸缩振动峰 ,表明 DB-570被成功接枝到硅胶上。
1.4　硅胶表面印迹聚合物的制备
把1mmol模板分子(亮菌甲素)和 4mmol功能单体2-VP复合8h后 ,取上述硅胶10g 加入250mL 圆底
烧瓶中 ,加入 100mL 甲苯 ,20mmol交联剂 EDMA ,超声振荡 ,通氮气除氧 ,密封后将圆底烧瓶接在旋转蒸
发仪上于紫外光照射下反应 48h ,反应瓶与紫外灯的距离 10cm ,以恒温水浴控制反应温度(反应温度为
20℃)。空白聚合物(non imprinting polymer ,NMIP)的制备除不加模板分子外其它相同 。
将接枝了聚合物的硅胶进行抽滤 ,用 V(N , N-二甲基甲酰胺(DMF))∶V(冰醋酸)=90∶10的混合溶
剂对聚合物进行索氏提取 ,24h后抽滤 ,室温下干燥 。
1.5　亮菌甲素的荧光测定
采用荧光光谱法测定溶液中亮菌甲素的浓度 。经实验测定 ,亮菌甲素的最大荧光激发波长 λex ,max
=281nm ,最大荧光发射波长 λem ,max =462nm。亮菌甲素的浓度在 0.0 ～ 6.0mg L范围内与荧光强度呈良
好的线性关系 ,标准工作曲线回归方程为 y =83.925x+13.956 ,相关系数>0.99。
1.6　印迹聚合物的吸附性能测试
配制一系列的亮菌甲素甲醇溶液 ,加入 5.0mg 的分子印迹聚合物 ,静置 12h。然后 ,用荧光光谱检
测浓度变化。
2　结果与讨论
2.1　亮菌甲素与功能单体之间的荧光作用分析
在合成分子印迹聚合物中 ,模板分子和功能单体在聚合前能否通过氢键或离子键等形成稳定的复
合物 ,是获得高选择性分子印迹聚合物(MIP)的关键。因此 ,探讨模板分子和功能单体的相互作用 ,对
进一步完善分子印迹的理论具有重要意义。
采用荧光光谱法对聚合前的模板分子和功能单体的相互作用进行研究。亮菌甲素有荧光 ,三种单
体2-VP 、MAA及AA均没有荧光 。亮菌甲素与 3种功能单体以不同比例(模板分子∶功能单体=1∶0 ,1∶
2 ,1∶4 ,1∶6)复合的溶液的荧光光谱见图 1。从图 1中可以看出 ,亮菌甲素和 3种功能单体作用后 ,荧光
强度均下降了 ,发射峰的位置和峰形不变 ,表明单体对亮菌甲素的荧光有猝灭作用。其中使得荧光猝灭
最大的为 2-VP。现以 2-VP 为例对其猝灭作用进行描述。
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图 1　亮菌甲素和不同浓度的功能单体的荧光光谱
Fig.1　Fluorescent spectra of Armillarisin A with different concentration of monomers
(a)MAA;(b)2-VP;(c)AA
　　荧光猝灭因猝灭机制不同 ,可分为动态猝灭和静态猝灭 。动态猝灭过程是指荧光体与荧光猝灭剂
分子间因相互碰撞而导致的荧光猝灭过程 ,其规律遵从 Stern-Volmer方程[ 9] :
F0 F =1+K SVC q =1 +K qτ0Cq (1)
　　静态荧光猝灭作用是指荧光供体分子与荧光猝灭剂分子之间借助分子间力彼此结合 ,形成了具有
一定结构的不发荧光的基态复合物 ,从而导致荧光强度减弱的现象 ,可用 Lineweaver-Burk双倒数方程[ 10]
进行描述:
(F0 -F)-1 =F-10 +K-1 F-10 C-1q (2)
式中 ,F 0为不加入猝灭剂时的荧光强度 , F 为加入猝灭剂 2-VP 后的荧光强度;K SV为动态猝灭常数;K
为静态荧光猝灭过程中复合物的形成常数 , Cq 为荧光猝灭剂的浓度 ,K q 为荧光猝灭速率常数 , τ0 为不
存在猝灭剂时的荧光物质的平均寿命。
图 2　亮菌甲素与 2-VP体系的 Lineweaver-Burk双倒数曲线
Fig.2　The Lineweaver-Burk double-reciprocal curves
of Armillarisin A and 2-VP system
荧光猝灭速率常数 K q值 ,常用于判断猝灭类型 ,各类猝灭剂经验最大值为 2.0×1010L mol·s ,把实
验数据代入方程中 ,计算得K q为 1.2×1012L mol·s ,远大于经验值 ,表明 2-VP 对亮菌甲素分子荧光的猝
灭不是由动态碰撞引起的 。
把实验数据代入静态方程中 ,可得到如图 2的 Lineweaver-Burk双倒数曲线 ,对图中曲线进行线性拟
合 ,得到线性回归方程(F0-F)-1=1.4684C-1q +0.4757 ,相关系数为 0.9969 ,结果符合静态猝灭规律。
研究表明 ,亮菌甲素与单体之间为静态猝灭过程 ,即与单体形成了不发荧光的复合物 ,使得亮菌甲素浓
度降低 ,亮菌甲素的浓度在一定范围内与荧光强度有良好的线性关系 ,因而导致了亮菌甲素的荧光猝
灭。
2.2　亮菌甲素与功能单体之间的浓度选择
从图 1中可以看出 ,加入功能单体后 ,与模板分子亮菌甲素相比 ,荧光强度降低了 ,说明模板分子与
功能单体间有作用。比较三种功能单体的加入所导致的荧光强度变化 ,以加入 2-VP的体系的荧光强度
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降低更为明显 ,表明 2-VP与模板分子亮菌甲素的相互作用更强。这是由于 2-VP 环上的氮与亮菌甲素
上的羟基通过氢键形成了较稳定的复合物 。当亮菌甲素与 2-VP 的摩尔比大于 1∶4时 ,该变化不再明
显 ,这说明虽然适当增加功能单体的量可使模板分子与功能单体的作用更充分 ,但不是功能单体的用量
越多越好 ,一方面 ,大大过量的功能单体可能导致存在没有发生相互作用的功能单体的残基 ,从而使得
非选择的结合位点增加;另一方面 ,功能单体的浓度过大可能会发生自身缔合 ,也会导致选择性结合位
点的降低 。
综合各方面因素 ,本文选择2-VP 为功能单体 ,模板分子与功能单体的摩尔比为1∶4。
2.3　印迹聚合物的吸附等温线
为了研究印迹聚合物的结合特性 ,用平衡实验方法测定了MIP 、NMIP 与模板分子的结合量对溶液
浓度的变化曲线(图 3)。由图3可见 ,MIP 的吸附量显著大于NMIP的吸附量 ,且二者的吸附量之差随溶
液浓度的增加而增大 ,说明组成相同的两种聚合物的空间结构存在明显的差异。在MIP中含有预聚合
阶段形成的三维空穴和聚合完成移去模板分子后形成的结合位点 ,故MIP 对模板分子有较高的吸附容
量;而对于 NMIP 来说 ,由于其不含“印迹孔穴” ,尽管在其上也含有大量可与底物产生结合作用的官能
团 ,但官能团的排列是无规则的 ,因而对模板分子不具有特异性分子吸附性能。
图 3　聚合物与模板分子
的结合量随浓度变化曲线
Fig.3　Binding isotherm of Armillarisin
A imprinted ploymer
图 4　评价亮菌甲素结合性能的 Scatchard图
Fig.4　Scatchard plot to estimate the
binding nature of Armillarisin A
2.4　Scatchard分析
在分子印迹研究中 ,常常使用源于生物化学受体动力学中配体与受体的结合的 Scatchard模型来评
价分子印迹聚合物的结合特性 。
将Langmuir吸附数据进行线性转化 ,即 Scatchard 分析[ 11] ,得到图 4。由图 4可以看出 ,Scatchard曲
线呈非线性关系 ,但可看作由 2条直线组成 ,对图中的两段线性部分进行拟合 ,可以分别得到拟合线性
方程:高亲和力位点 Q C=11.427-0.5723Q ,R 2=0.9941;低亲和力位点 Q C=4.4427-0.0902Q , R2=
0.9480。这表明印迹聚合物对印迹分子的作用不是完全等价的 ,存在常见的两种方式 。究其原因是功
能单体与印迹分子之间存在多种相互作用 ,可以形成多种不同组成的复合物 ,它们在聚合反应的不同时
期均能进入空腔中 。通过 Scatchard公式 B F =(Bmax -B) K d 计算得出 ,解离常数 K d =5.70μmol L ,最
大表观结合常数 Bmax=110.86μmol g 。由此可知 ,该MIPs的印迹空腔与模板分子的结合是相当牢固的 ,
而且可结合的位点很多 ,MIP 中之所以会产生两类不同吸附量 ,可能是由于模板分子亮菌甲素结构中存
在着酚羟基与羟基这两类不同类型的功能基 ,因而 ,模板分子与功能单体预组装时存在着两种方式 。
表观印迹效率 E ia(=B max Qmax)为模板分子在 MIP 中印迹成功的比例 ,其大小可以评价一个印迹过
程效率的高低。在本实验中 , Qmax =228.1μmol g ,因此 E ia为 48.6%。
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3　结论
　　结果表明 ,制备的印迹聚合物对模板分子具有较强的吸附性能 ,模板分子与功能单体预组装时存在
着两种组织方式 ,印迹效率为 48.6%。与本体聚合[ 12]相比 ,表观印迹效率为其 1.5倍 ,饱和吸附量为其
1.6倍 ,并且不需研磨 、筛分等过程 ,实验更加简单。
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苏立强
1962年 1月生于黑龙江
1982年毕业于齐齐哈尔轻工学院本科
现为齐齐哈尔大学教授
从事色谱理论与应用研究
Email:slq202@163.com
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