全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-07
基金项目:国家“863”重点项目资助(2007AA021506);教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-07-0380)
作者简介:敖宗华(1971-),男,四川泸州人,副研究员,研究方向:从事天然药物制备及其合成的生物技术研究
通讯作者:许正宏,Tel:(0510)85918206,E-mail:zhenghxu@163.com
亮菌(Armilarielatabescens(Scop.exFr.)Sing),英文名 RinglesHoneyMushroom,又名发光小蜜环菌、易
逝杯伞,属于蘑菇目,口蘑科,小蜜环菌属[1]。亮菌是我国首次发现并拥有自主知识产权的一种真菌,具有
治疗肝炎、胆囊炎、阑尾炎、中耳炎、肿瘤以及治疗放疗、化疗引起的白细胞减少症等功效[2,3]。亮菌中含有
多种生物活性成分,如亮菌甲、乙、丙素,亮菌多糖、多肽及氨基酸等。自从亮菌于 20世纪 70年代被发现以
来,就一直用于治疗肝炎,胃病及胆囊炎,具有很好的疗效。现在市场上已经有亮菌口服液出售,其产品是
由固体发酵生产所得,亮菌固体培养存在生产周期长,劳动强度较大,容易污染等不利因素,而采用液体发
酵生产可以快速、可控的生产出大量亮菌原料,适合工业化大规模生产,可大大降低生产成本。为了比较两
种方法生产的亮菌菌粉的品质,以亮菌甲素和亮菌多糖、多肽的含量为指标,将固体培养得到的亮菌糖浆
和用液体发酵得到的亮菌菌粉作一质量比较。
1 材料与方法
1.1 实验材料
亮菌糖浆由安徽杰明生物制剂有限公司生产,批号:020705。亮菌菌粉由本实验室按专利方法制备[4]。
亮菌菌粉和亮菌糖浆品质分析比较
敖宗华 1,2 陆震鸣 2 孙军恩 1 许泓瑜 1 许正宏 1,2
(1江南大学医药学院制药工程研究室,无锡 214122;2江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122)
摘 要: 以多糖、多肽和亮菌甲素含量以及多糖分子量分布分析为指标,对液体发酵生产的亮菌菌粉和固体发酵
生产的亮菌糖浆进行质量比较。亮菌菌粉中多糖,多肽含量分别为5.86%和4.62%。亮菌菌粉和亮菌糖浆中多糖/多肽的
含量比值分别为1.27和1.29。亮菌糖浆主要由小分子量多糖组成,菌粉中亮菌甲素较多。液体发酵所得的亮菌菌粉是一
种有潜力的制剂新原料。
关键词: 亮菌 发酵菌粉 糖浆 多糖 多肽 亮菌甲素
QualityComparisonBetweendryMaterofCultureBrothand
SyrupofSolidFermentofArmilarielatabescens
AoZonghua1,2 LuZhenming2 SunJunen1 XuHongyu1 XuZhenghong1,2
(1LaboratoryofPharmaceuticalEngineering,SchoolofMedicineandPharmaceutics,JiangnanUniversity,Wuxi214122;2The
KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122)
Abstract: Thequalitiesofdrymaterofculturebroth(DMCB)ofArmilarielatabescens(AT)andsyrupofsolid
fermentofATwerecompared.ThecontentsofpolysaccharidesandpolypeptidesinDMCBofATwere5.86%,4.62%
respectively.Theratioofpolysaccharides/polypeptideswas1.27and1.29inDMCB andsyruprespectively.The
polysaccharideofinsyrupwasmostlycomposedoflowweightsmolecular.ThecontentofArmilarisinAwashigherin
DMCBthanthatofinsyrup.TheDMCBofATistobeapotentialmaterialformedicine.
Keywords: Armilarielatabescens(AT) Drymaterofculturebroth(DMCB) Syrup Polysaccharides
Polypeptide ArmilarisinA
2008年第4期
薄层层析硅胶 G为青岛海洋化工厂生产,亮菌甲素对照品由安徽杰明生物制剂有限公司提供。其他所用
药品与试剂均为分析纯。
1.2 亮菌多糖的分析
1.2.1 亮菌菌粉多糖的提取 称取 5.00g亮菌菌粉,加入 50ml水,90℃回流提取两次,每次 0.5h,2次水提
取液合并后 8000r/min离心 10min,分离得上清液。上清液浓缩至 15ml后,滴加 45ml无水乙醇,4℃静置过
夜后离心分离,所得沉淀即为亮菌粗多糖。上清液用于测定亮菌甲素。
1.2.2 亮菌糖浆多糖的提取 精确量取亮菌糖浆 50ml,浓缩 5倍左右,滴加入乙醇至乙醇终浓度为 75%,
4℃静置过夜后离心分离多糖,上清液用于测定亮菌甲素。
1.2.3 葡萄糖标准曲线的测定 取经 105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量,精密称定,加水制成每
1ml含无水葡萄糖 0.1mg的溶液。精密量取对照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8和 1.0ml,分别置于具塞试管中,
各加水至 1ml,再加 3%苯酚溶液 1.0ml,摇匀,迅速加入硫酸 4.5ml,摇匀,放冷至室温。以 0管为空白,在
490nm波长处测定吸光度。以吸光度 (A)对葡萄糖浓度 (C)作回归处理。经计算所得回归方程为:Y=
10.503X+0.0182,R2=0.9980。
1.2.4 亮菌菌粉多糖含量的测定 将 1.2.1中制备所得的菌粉多糖用 30ml水溶解,取 10μl多糖溶液,用
水稀释至 1.0ml,按照 2.1.3项下自“再加 3%苯酚溶液 1.0ml”起,依法操作,代入回归方程计算多糖含量。
1.2.5 亮菌菌粉和糖浆多糖的分子组成分析 亮菌多糖分析采用 SephadexG-100凝胶色谱(10×100mm),
亮菌菌粉和糖浆多糖水溶液上样后用 0.1mol/LNaCl洗脱,流速 3ml/10min,洗脱液按每管 3ml收集,并采用
硫酸-苯酚法进行多糖含量分析。
1.3 亮菌菌粉和亮菌糖浆多糖中多肽含量的测定
1.3.1 多糖样品的提取方法(同 1.2.1和 1.2.2中方法)。
1.3.2 多肽标准曲线的测定 取牛血清白蛋白对照品适量,精密称定,加水制成每 1ml含 0.3mg的溶液。
精密量取对照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8和 1.0ml,分别置于 10ml具塞试管中,各加水至 1ml,再加福林酚
试剂甲液 1.0ml,摇匀,室温放置 10min后,加入福林酚试剂乙液 4.0ml,摇匀,于 55℃水浴中保温 5min,取
出,放冷至室温。以 0管为空白,在 650nm波长处测定吸光度。以吸光度(A)对牛血清白蛋白浓度(C)作回
归处理。经计算所得回归方程为:Y=2.3662X+0.0286,R2=0.9946。
1.3.3 多糖中多肽含量的测定 将制备所得的多糖用 30ml水溶解,取 20μl多糖溶液,用水稀释至 1.0ml,
按照标准曲线制备项下自“再加福林酚试剂甲液 1.0ml”起,依法操作,带入回归方程计算多肽含量。
1.4 亮菌甲素的薄层层析(TLC)分析
亮菌菌粉和糖浆分别按照 1.2.1和 1.2.2中的方法进行醇沉后,所得上清液采用薄层层析色谱(TLC)
测定亮菌甲素。TLC所用吸附剂为薄层层析硅胶 G,以 0.5%CMC-Na制板,阴干,使用前 105℃活化 1h。展
开剂为氯仿:甲醇=8:2,用碘蒸气进行显色。
2 结果
2.1 多糖和多肽含量分析结果
亮菌菌粉和亮菌糖浆中的多糖和多肽含量测定如图 1。亮菌糖浆质量标准中规定多糖的含量应!
9.0mg/ml,多肽的含量!7.0mg/ml。经测定,亮菌菌
粉中多糖含量为 5.86%,多肽含量为 4.62%。亮菌
糖浆中多糖含量为 9.26%,多肽含量为 7.18%。亮菌
菌粉和亮菌糖浆中多糖/多肽的含量比值分别为
1.27和 1.29。
敖宗华等:亮菌菌粉和亮菌糖浆品质分析比较 189
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
2.2 多糖分子组成分析结果
亮菌糖浆和菌粉多糖凝胶分析结果如图 1,图 2所示。由图 1中可以看出,亮菌糖浆中多糖的分子量
分布较为单一,小分子量多糖含量较高。亮菌菌粉多糖的分子量分布与治疗肝炎的云芝多糖分布相似[5]。
图 1 亮菌糖浆中多糖的分子量分布 图 2 亮菌菌粉中多糖的分子量分布
2.3 亮菌甲素分析结果
亮菌甲素临床上用于治疗肝炎,胃病及胆囊炎,具有很好的疗效。亮菌菌粉和糖浆中亮菌甲素的 TLC
分析结果如图 3所示。从图 3中可看出,亮菌甲素的比移
值(Rf)为 0.62。亮菌菌粉和亮菌糖浆中的成分基本一致,
但是菌粉中含有较多的亮菌甲素,糖浆中的亮菌甲素含量
则偏低。
3 讨论
亮菌液体发酵得到的菌丝体菌粉中多糖和多肽含量
比值符合亮菌口服液的生产要求,且亮菌多糖在亮菌菌粉
中的纯度比固体发酵的糖浆要高,分子量分布与云芝相似,云芝菌丝体提取物抑瘤活性与分子量大小有
关,一般活性较强的成分,分子量在 5kD～300kD间[6],本实验所用发酵菌粉的主峰分子量亦在此范围内。亮
菌糖浆中多糖的分子量分布较为单一,这可能与固体培养中未完全降解的培养基中多糖,如淀粉等的存在
有关。亮菌菌丝体和糖浆中都含有亮菌甲素,但是糖浆中的含量没有菌粉中的高,可能是由于亮菌甲素在
亮菌糖浆中不稳定的原因。亮菌甲素分子结构中含有酚羟基和内酯结构,遇金属离子、光、氧气极易氧化变
质,遇水、酸、碱和湿气容易开环水解。
综上所述,液体发酵所得的菌粉是一非常有前途的制剂新原料,可用作生产亮菌口服液的原料。同时
考虑到亮菌甲素在溶液中不稳定,建议今后开发固体制剂。
参考 文献
1 卯晓岚.中国大型真菌.郑州:河南科学技术出版社,2000.
2 江苏新医学院.中药大辞典.上海:上海科学技术出版社,1979.
3 KihoT,ShioseY,NagaiK,etal.ChemPharmBul,1992,40(8):2110～2114.
4 敖宗华,符慧子,邹锡良.大规模液体深层发酵生产亮菌菌丝体菌粉及其多糖工艺.CN:1596585,2005-3-23.
5 杨晓彤,糜可,等.中国医药工业杂志,2000,31(12):545～548.
6 MatsunagaK,OguchiY,OharaM.Aglycoproteinligandforplatelet-derivedgrowthfactorandtransforminggrowthfactorβ fromCoriolus.EP:
702028,1996-03-20.
图 3 亮菌菌粉和糖浆中亮菌甲素的 TLC分析结果
A:亮菌菌粉 B:亮菌糖浆 C:亮菌甲素对照品
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