全 文 ：84 环球中医药 2012 年 2 月第 5 卷第 2 期 Global Traditional Chinese Medicine，February 2012，Vol. 5，No. 2
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(收稿日期:2011-11-21)
(本文编辑:刘群)
基金项目:国家自然科学基金(U0732004)
作者单位:510405 广州中医药大学中药学院
作者简介:李耿(1983 － ) ，博士，讲师。研究方向:教学及抗病毒研究。E-mail:lg@ gzhtcm． edu． cn
通讯作者:赖小平(1960 － ) ，研究员，博士生导师。研究方向:中药新药研究与开发。E-mail:lxp88@ gzhtcm． edu． cn
岗梅根水提物在小鼠体内抗 H9N2 亚型
禽流感病毒实验研究
李耿 汪天呈 姚海燕 陈建新 吴依娜 林吉 赖小平
【摘要】 目的 观察岗梅根水提物对滴鼻感染 H9N2 亚型禽流感病毒小鼠的保护作用。方法
以磷酸奥司他韦为阳性药，通过 H9N2 亚型禽流感病毒滴鼻感染小鼠，分别建立小鼠病毒性肺炎
动物模型和病毒感染致小鼠死亡的动物模型，观察小鼠肺部病变和死亡情况，以肺指数及小鼠死亡
率作为观测指标，评价岗梅根水提物对感染 H9N2 亚型禽流感病毒小鼠的保护效果。结果 岗梅根
水提物中、低剂量组可显著降低禽流感病毒感染小鼠的肺指数(P ＜ 0． 01) ;降低禽流感病毒感染小
鼠死亡率，延长其存活时间(P ＜ 0． 01)。结论 岗梅根水提物对滴鼻感染 H9N2 亚型禽流感病毒小
鼠具有良好的保护作用。
【关键词】 岗梅根水提物; 小鼠; H9N2 亚型禽流感病毒; 体内; 肺指数; 死亡保护率
【中图分类号】 R285． 5 【文献标识码】 A doi:10． 3969 / j． issn． 1674-1749． 2012． 02． 002
Experimental study of anti-influenza virus H9N2 effects of the water extract of Radix et Caulis Ilicis
Asprellae in vivo LI Geng，WANG Tian-cheng，YAO Hai-yan ，et al． Herbal Medicine Research College
in Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China
Corresponding author:LAI Xiao-ping，E-mail:lxp88@ gzhtcm． edu． cn
【Abstract】 Objective To study the inhibitory effects of the water extract of Radix et Caulis Ilicis
Asprellae on aiv influenza virus H9N2 in vivo． Methods The model mice were infected by nasal dripping
of H9N2 subtype avian influenza virus． Oseltamivir was selcted as the positive control． The inhibitory effects
of Radix et Caulis Ilicis Asprellae on influenza viral pneumonia were observed． The lung index and motality
rate were selected as indicators of protective effect． Results Compared with the viral control group，low-
dose and middle-dose water extract of Radix et Caulis Ilicis Asprellae can obviously ease lung inflammation
of mice infected by aiv influenza virus H9N2，reduce the lung index，decrease the motality rate of the mice
infected by H9N2 subtype avian influenza virus，and extend the survival time． Conclusion Radix et
Caulis Ilicis Asprellae has strong inhibitory effects on aiv influenza virus H9N2．
【Key words】 The water extract of Radix et Caulis Ilicis Asprellae; Mice; H9N2 subtype avian
influenza virus; In vivo; Lung index; Death-protection rate
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禽流感(avian influenza，AI)是一种禽类急性高
度致死性传染病，其病原微生物为 A 型流感病
毒［1］，在许多欧亚国家家禽中流行［2］。1997 年，香
港有 6 人因感染 H5N1 亚型禽流感病毒导致死
亡［3］，是人类首次发现禽流感病毒突破种属间障碍
直接感染人类。之后，人们又陆续在猪和人的病例
中分离得到 H9N2 亚型禽流感病毒［4-6］。为了阻止
灾变再度来袭，各国学者都致力于研究抗击禽流感
的有效手段，因而诞生了不少抗流感新药。磷酸奥
司他韦(达菲)是全球公认的抗禽流感药物，但随着
2007 年 WHO在埃及两名禽流感致死的患者体内发
现对达菲出现抗药性的新毒株，达菲抗禽流感的神
话亦被打破，于是，学者们又把抗禽流感的研究思
路延伸到了中药［7］。
中医防治流感已经有 2000 多年的历史，中药及
其组方对流感的疗效也是有目共睹，且中药独特的
多靶点优势可以有效抑制流感病毒表面抗原的漂
移［8］，从中药中筛选有效抗流感的药物也是国内外
学者研究的热点之一。中药岗梅 Radix et Caulis Ili-
cis Asprellae 是冬青科植物梅叶冬青 Ilex asprella
(Hook． et Arn．)champ． ex Benth．的根，味苦性寒，具
有清热解毒、生津止渴、利咽消肿、散瘀止痛等功
效，临床常用于感冒、高热烦渴、扁桃体炎、咽喉炎
等呼吸道感染疾病的治疗［9，10］，且疗效确切。因此，
本实验建立了禽源 H9N2 亚型流感病毒小鼠感染模
型，以肺指数、死亡保护率为主要指标，评价岗梅根
水提物对感染小鼠的保护作用。
1 材料与方法
1． 1 药物与试剂
岗梅根水提物，由广州中医药大学新药开发研
究中心提取制备，方法如下:取适量岗梅，每次用 8
倍量水煎煮 1 小时，共 2 次，合并 2 次水煎煮液，浓
缩待用。
阳性药奥司他韦(Tamiflu，达菲，罗氏有限公司
生产，批号:B1212) ;乙醚(天津化学试剂有限公
司) ;生理盐水(开缘生物制药有限公司)。
1． 2 实验动物
SPF级 NIH小鼠，雌雄各半，体重 13 ～ 15 g，由
广东省医学实验动物中心提供。实验动物质量合
格证号:粤监证字 SCXK(粤)2008 － 0002。饲养环
境:室温(23 !2)℃，相对湿度为 75% !10%。
1． 3 毒种
H9N2 禽流感病毒，由华南农业大学兽医科技
中心提供;由广州中医药大学新药开发中心 PⅡ实
验室经昆明小鼠传代 5 次获得，经 SPF 鸡胚传代扩
增，测定其半数致死量，分装冻存于 － 80℃，试验前，
取毒种用流水冲浸融化。
1． 4 H9N2 亚型禽流感病毒对小鼠的半数致死量
测定［10］
取小鼠 50 只，雌雄各半，按体重随机分为 5 组，
每组 10 只。用灭菌肉汤将 H9N2 亚型禽流感病毒
稀释成 10 －1、10 －2、10 －3、10 －4、10 －5浓度的病毒液。
将小鼠用乙醚轻度麻醉，滴鼻感染各个稀释浓度的
病毒，每鼠 4 滴，合约 0． 05 ml，记录小鼠死亡情况。
数据处理后用 Reed-Muench 两氏法［11］计算得到病
毒对小鼠的半数致死量(LD50) ，求得 LD50 = 10
－2． 90。
1． 5 岗梅根水提物对小鼠 H9N2 亚型禽流感病毒
性肺炎的治疗试验［10-13］
将小鼠随机分成六组:空白对照组，奥司他韦
组，病毒对照组，岗梅根水提物高、中、低剂量组，每
组 12 只。将小鼠用乙醚轻度麻醉，用 H9N2 亚型禽
流感病毒鼠肺适应株 15 个 LD50病毒浓度，滴鼻感
染，每鼠 4 滴，约 0． 05 ml。在攻毒后 2 小时开始给
药。共给药 4 天，每天 1 次，0． 2 ml /10 g 体重灌胃
给药，病毒对照组及空白组以等体积生理盐水灌
胃。感染后 4 天，称小鼠体重，杀剖小鼠(杀剖前禁
食禁水 12 小时) ，观察肺组织的病变程度，并取肺
称重。按以下公式计算肺指数与肺指数抑制率:
肺指数% = 肺重
小鼠体重
× 100%
肺指数抑制率% =(病毒对照组平均肺指数 －药物组平均肺指数)
病毒对照组肺指数
×100%
1． 6 岗梅根水提物对感染 H9N2 亚型禽流感病毒
小鼠的死亡保护实验［14，15］
如 1． 5 项下所示将小鼠随机分为六组，每组 12
只。乙醚麻醉后，以 2 个 LD50浓度的 H9N2 亚型禽
流感病毒滴鼻感染，每鼠 4 滴。病毒攻击 6 小时后
连续给药 10 天，0． 2 ml /10 g 体重每天灌胃给药一
次，病毒对照组及空白组以等体积蒸馏水灌胃。逐
日观察动物发病情况并记录死亡数，共观察 15 天，
按公式计算死亡保护率和生命延长率。
死亡保护率% =(药物组平均存活天数 －病毒对照组平均存活天数)
病毒对照组平均存活天数
× 100%
1． 7 统计学分析
以上实验结果用 x ± s表示，所有实验数据均采
用 SPSS 17． 0 统计软件进行单因素方差分析，组间
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差异显著性采用单因素方差分析中的最小显著差
别(Least Significant Difference，LSD)方法进行多重
比较检验。
2 结果
2． 1 岗梅根水提物对小鼠 H9N2 亚型禽流感病毒
性肺炎的治疗结果
解剖小鼠肺组织时发现，空白对照组小鼠肺组
织红白色，无肿大，无瘀斑;病毒对照组小鼠肺组织
颜色黯红，肿大，有瘀斑;与病毒对照组比较，岗梅
根水提物各个剂量组小鼠肺组织颜色变浅，肿大减
小，瘀斑减少，说明炎症均有一定程度减轻。
各组小鼠肺指数和肺指数抑制率结果见表 1。
统计结果显示，与空白对照组比较，病毒对照组的
肺指数显著升高(P ＜ 0． 01) ，提示成功复制小鼠病
毒性肺炎模型;与病毒对照组比较，奥司他韦组肺
指数显著降低，提示造模成功。与病毒对照组比
较，岗梅根水提物中剂量和低剂量可显著抑制
H9N2 禽流感病毒所致小鼠肺部炎症(P ＜ 0． 01) ，高
剂量有降低肺指数的趋势(P ＞ 0． 05)。
2． 2 岗梅根水提物对感染 H9N2 亚型禽流感病毒
小鼠的死亡保护作用
攻毒后每天观察各组小鼠活动状态，发现空白
对照组小鼠体重增加，行为敏捷，毛发有光泽，呼吸
正常;病毒对照组，在感染后第 3 天开始，小鼠食欲
明显下降，随后逐渐出现耸毛、甩头，呼吸短促现
象，并伴随腹式呼吸，行动迟缓无力，弓背，消瘦，体
重减轻，第 5 天开始出现死亡，部分小鼠死前出现明
显的神经症状，如打转等。与病毒对照组比较，各
给药组动物多数症状减轻。
各组死亡率、平均存活时间和生命延长率结果
见表 2。统计结果显示:病毒对照组的小鼠在攻毒 5
天后全部死亡，与空白对照组比较，病毒对照组小
鼠死亡数明显增加，平均生存时间显著减少(P ＜
0. 01) ，提示成功复制小鼠死亡保护模型;与病毒对
照组比较，岗梅根水提物中、低剂量组小鼠存活时
间显著延长(P ＜ 0． 01) ，存活率也显著提高(P ＜
0. 01) ，高剂量组与病毒对照组比较虽无显著差异
(P ＞ 0． 05) ，数据显示其有提高感染小鼠存活率和
延长感染小鼠存活时间的趋势。
3 讨论
3． 1 岗梅抗病毒前景分析
岭南地区被历代医家称为“障疫之地”，温病频
发，流感疫情严重，岗梅是岭南地区的地产药材，被
岭南医家广泛用于温病防治，临床常用于感冒、高
热烦渴、扁桃体炎、咽喉炎、气管炎、百日咳、肠炎、
痢疾、传染性肝炎等，说明其对病原微生物有很好
的抑制作用。朱伟群等［15］曾报道其水提液对 H1N1
型流感病毒有确切的抑制作用，但对禽流感病毒的
相关作用及其机制研究较少。本实验的结果表明
岗梅根水提物对 H9N2 亚型禽流感病毒感染小鼠的
肺指数有抑制作用，并能延长感染小鼠的存活时
间，降低死亡率，且疗效显著，为进一步开展岗梅抗
流感病毒药效物质基础研究提供依据。
3． 2 对实验方法及结果的相关分析
肺指数实验滴鼻所用病毒液为 15 倍的 LD50浓
度，死亡保护率实验造模采用 2 倍的 LD50浓度，是
前期查阅大量学者的研究文献［13-15］，进行了预实验
摸索后确定的，采用 15 倍的 LD50是确保肺炎模型造
模成功，亦便于鼠肺形态特征的观察比较。预实验
表明，小鼠在感染后第 6 天才开始死亡，因此选择感
染后第 4 天进行小鼠的剖杀取肺，此时模型组小鼠
均表现出典型的肺炎症状且尚未出现死亡。
表 1 岗梅根水提物对病毒性肺炎小鼠肺指数的影响(x ± s)
组别 给药剂量 /生药(g·kg －1·d －1) 动物数(只) 平均肺指数 肺指数抑制率(%)
空白对照组 － 12 0． 82 ± 0． 05 －
病毒对照组 － 12 1． 70 ± 0． 10a －
奥司他韦组 0． 075 12 1． 11 ± 0． 16ab 34． 32
高剂量组 20 12 1． 56 ± 0． 25a 8． 05
中剂量组 10 12 1． 40 ± 0． 20ab 13． 70
低剂量组 5 12 1． 28 ± 0． 18ab 20． 30
注:与空白对照组比较，aP ＜ 0． 01;与病毒对照组比较，bP ＜ 0． 01;“ －”表示无该项。
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表 2 岗梅根水提物提取物对病毒感染小鼠的死亡保护结果(x ± s)
组别 给药剂量 / 生药(g·kg －1·d －1)动物数(只)死亡数(只)死亡保护率(%) 平均存活时间(/d) 生命延长率(%)
空白对照组 － 12 0 － 15 ± 0． 00 －
病毒对照组 － 12 12 － 4． 67 ± 0． 65 a －
奥司他韦组 0． 075 12 4 66． 67 11． 83 ± 4． 69b 153． 32
高剂量组 20 12 12 0 6． 67 ± 0． 65a 42． 83
中剂量组 10 12 8 33． 33 9． 83 ± 3． 95ab 110． 49
低剂量组 5 12 9 25 8． 17 ± 0． 75ab 74． 95
注:与空白对照组比较，aP ＜ 0． 01;与病毒对照组比较，bP ＜ 0． 01;“ －”表示无该项。
实验结果显示岗梅水提液中、低剂量组能显著
降低感染小鼠肺指数，降低小鼠死亡率并延长其存
活时间，而高剂量组对 H9N2 亚型禽流感病毒感染
的小鼠只有一定的治疗趋势，推测原因是岗梅根药
效成分过于复杂，含有多种皂苷和生物碱［9］，各组
分之间的反应机制亦不明确，给药浓度和治疗效果
之间量效关系不明显，拟在之后的实验中做进一步
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(本文编辑:刘群)
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