全 文 ：收稿日期:2014 － 05 － 28 修回日期:2014 － 07 － 08
基金项目:国家科技支撑计划(2007BAD07B01);福建省农业科技平台建设项目(2008N2001)。
作者简介:赖瑞联(1990 －) ，男，硕士研究生，从事果树生物技术研究。通讯作者赖钟雄(1966 －) ，男，研究员，博士生导师，从事园艺植物生
物技术研究。
DOI:10． 13324 / j． cnki． jfcf． 2015． 01． 009
山枇杷基因组 DNA的提取及自然群体内
ISSＲ遗传多样性分析
赖瑞联，徐 洋，赖恭梯，钟春水，林玉玲，赖钟雄
(福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)
摘要:为探究山枇杷基因组 DNA 提取方法及群体内个体之间的遗传多样性，以采自福建省戴云山脉九仙山山枇杷
(Garcinia multiflora)自然群体的 41 份叶片样品为材料，比较 2 种改良十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)对其基因组 DNA
的提取效果，并通过简单序列重复区间—聚合酶链式反应(ISSＲ-PCＲ)扩增反应体系分析其群体内遗传多样性。结果表明，
CTAB-2 法通过适当提高 CTAB浓度，添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和酚—氯仿—异戊醇，获得的基因组 DNA 纯度和质量较
好;筛选的 11 条 ISSＲ引物共扩增 85 个条带，其中多态性条带 61 条，占 71．76%;NTSYS 2．10e软件设定阈值(GS)为 0．78，
该山枇杷样品归为 4 个类群，样品遗传相似系数介于 0． 588 － 0． 929，平均为 0． 779，说明该群体的遗传基础较宽;利用
STＲUCTUＲE 2．2 软件将样品分为 4 个类群，结合后验概率(Q值)分布表表明部分个体之间存在较丰富的遗传信息交流。
关键词:山枇杷;自然群体;改良十六烷基三甲基溴化铵法;简单序列重复区间;聚类分析
中图分类号:S667．9 文献标识码:A 文章编号:2096 － 0018(2015)01 － 0053 － 07
Extraction of genomic DNA and analysis of genetic diversity of the
natural population by ISSＲ in Garcinia multiflora
LAI Ｒui-lian，XU Yang，LAI Gong-ti，ZHONG Chun-shui，LIN Yu-ling，LAI Zhong-xiong
(Institute of Horticultural Biotechnology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:The leaves of 41 samples collected from Jiuxianshan Mountain of Daiyunshan Mountains were used to compare the effects
of genomic DNA extraction between 2 different CTAB methods，and then the genetic diversity of the natural population was analysed
by ISSＲ in Garcinia multiflora． The results showed the CTAB-2 method with high concentration of CTAB，adding PVP and
hydroxybenzene-chloroform-Isoamyl alcohol was more effective than the CTAB-1 method for improving the purity and quality of
genomic DNA． Based on the 11 selected ISSＲ primers，85 clear bands were amplified，61 of which were polymorphic bands and the
polymorphism frequency was 71．76% ． The analysis with NTSYS showed that all the samples were classified into 4 taxa when the
threshold (GS)was 0．78，and the genetic similarity coefficient ranged from 0．588 to 0．929 with an average of 0．779，all of which
indicated a wide gene pool． The results of STＲUCTUＲE analysis indicated that 41 samples could be clustered into 4 groups，and the
Q-value showed there were abundant exchanges of the genetic information among some individuals．
Key words:Garcinia multiflora;natural population;hexadecyltrimethyl ammonium bromide;inter-simple sequence repeat;cluster analysis
山枇杷(Garcinia multiflora Champ． ex Benth．)别名山桔子、木竹子、多花山竹子、白树仔等，是藤黄科
藤黄属(Garcinieae)的一种常绿野生木本果树。山枇杷并不是蔷薇科枇杷属(Eriobotrya)的野生种，因其果
实形似枇杷，故民间取名山枇杷，其树体富含黄色汁液，通常生长于海拔400 － 1 200 m土壤肥沃湿润的山
谷中，主要分布在台湾、福建、广西、广东、贵州等地。山枇杷具较高药用价值，已有研究表明山枇杷含多种
有效成分和活性物质［1 － 8］，可消炎止痛、收敛生肌、抗癌抑癌等［9 － 10］。山枇杷果实富含维生素 C 和多种氨
基酸，但酸度含量较高，不易鲜食，可加工保健品或天然饮品［11］。此外，山枇杷种子含油量高，可用于机械
润滑和制造肥皂，且木材坚硬，色泽较好，是家具、工艺雕刻等的优良选择［12 － 13］。可见，山枇杷具有重要的
研究价值和应用价值。然而，现阶段人们对这一野生种质缺乏全面的认识，对其遗传结构和遗传背景的研
究也处于空白，制约了山枇杷应用价值的开发和利用。
森林与环境学报 2015，35(1) :53 － 59 第 35 卷 第 1 期
Journal of Forest and Environment 2015 年 1 月
简单重复序列区间 (inter-simple sequence repeat，ISSＲ)是植物种质资源进行遗传结构和遗传多样性
分析的一种有效手段。ISSＲ技术首先由 Zietkiewicz et al［14］在简单重复序列(simple sequence repeat，SSＲ)
基础上提出，其基本原理就是在 SSＲ的 3或 5端锚定 1 － 4 个碱基作引物，对两侧具有反向排列 SSＲ序列
进行扩增，具有成本低、重复性高和操作简易等优点。这些优势使得 ISSＲ 在牡丹(Paeonia suffruticosa
Andr．)［15］、香蕉(Musa． spp)［16 － 17］、苦瓜(Monodrama charantia L．)［18］等众多园艺植物种质资源研究中广
泛应用，也为山枇杷相关试验提供了较为理想的选择。然而，ISSＲ 分子标记结果可靠度很大程度上取决
于所提取基因组 DNA的质量，而山枇杷树体中富含有的多种化学成分和活性物质并不利于高质量基因组
DNA的获得，对山枇杷基因组 DNA抽提方法的改进也是研究顺利开展的关键。
本课题组对比了 2 种 CTAB 法对山枇杷基因组 DNA 的提取效果，同时利用 ISSＲ 技术结合
STＲUCTUＲE 2．2 和 NTSYS 2．10e软件在分子水平上分析了山枇杷自然群体的遗传结构和遗传多样性，旨
在填补山枇杷遗传背景研究的空白，以利于山枇杷这一野生种质资源的开发和应用。
1 材料与方法
1．1 材料
福建省戴云山脉九仙山的山枇杷自然群体分布于德化县九仙山山坡疏林地带，群体分布范围约
5 km2，采用全球定位系统(global positioning system，GPS)测得其地理位置为北纬 25°44、东经 118°06附
近，海拔高度约 960 m。随机选取间隔 10 m以上的不同单株，采集正常生长无病虫害的鲜叶 41 份(编号
1 － 41) ，用液氮速冻，置于 － 80 ℃超低温冰箱中保存备用。
1．2 方法
1．2．1 DNA的提取 通过 CTAB-1 法和 CTAB-2 法提取山枇杷基因组 DNA，CTAB-1 法参照章城［19］的方
法稍作改良，CTAB-2 法参照安泽伟等［20］的方法稍作改良，2 种 DNA提取方法具体操作如下。
CTAB-1 法:(1)取预先处理的样本，液氮研磨成粉状，转移到 1． 5 mL 离心管中，加入 65 ℃预热的
CTAB-1 DNA 裂解液 750 μL，65 ℃水浴 40 min，水浴期间多次振荡;(2)裂解完成后加入等体积的氯仿异
戊醇(24∶ 1) ，颠倒数次，4 ℃条件下 10 000 × g 离心 5 min，吸取上清液，重复氯仿异戊醇抽提步骤 3 次;
(3)所吸取的上清液中加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀数次，室温静置 5 min后 4 ℃条件下 12 000 × g
离心 1 min，然后弃上清液;(4)用预冷的 75%乙醇清洗沉淀 2 次，待沉淀风干后，加入 35 μLTris盐酸缓冲
液(Tris-EDTA buffer，TE)和 0．5 μL核糖核酸酶 A(ribomuclease A，ＲNase A) ，37 ℃条件下水浴 30 min，
4 ℃冰箱中保存。
CTAB-2 法:(1)取预先处理的样本，液氮研磨成粉状，转移到 1．5 mL 离心管中，加入含 2%(V /V)聚
乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)经预冷的 DNA提取缓冲液 750 μL，颠倒混匀数次，冰浴 20 min
后，4 ℃条件下 4 000 × g离心 10 min，弃上清液;(2)沉淀中加入 65 ℃预热的 CTAB-2 DNA裂解液750 μL，
振荡混匀后 65 ℃ 水浴 40 min，水浴期间多次振荡; (3)裂解完成后加入等体积的酚氯仿异戊醇
(25∶ 24∶ 1) ，颠倒数次，11 000 × g离心 5 min，吸取上清液，重复酚氯仿异戊醇抽提步骤 3 次;其后试验操
作与 CTAB-1 法中(3) (4)一致。
DNA提取完成后，吸取稀释 5 倍的 DNA样品 4 μL，用含有 0．5% Gelred核酸染料(购自 Transgene 公
司)的 1．0%琼脂糖凝胶电泳，检测 DNA的纯度，并用超微量紫外光分光光度计测定 A260 /A280的值。
1．2．2 ISSＲ-PCＲ扩增 根据测得的 DNA浓度将 41 份样本各稀释成 50 ng·μL －1，吸取 5 μL稀释后的样
品进行等体积混合，以混合样为模板参考赖恭梯等［21］的 ISSＲ-PCＲ反应体系进行 PCＲ扩增，重复 3 次，从
47 条 ISSＲ随机引物中筛选条带清晰、多态性好、反应稳定的引物，再利用筛选的引物对 41 份样本进行
PCＲ扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增谱带。
1．2．3 数据统计与分析 将电泳图谱中出现条带的有或无用 1、0 进行量化，并将获得的 1，0 矩阵图输入
Excel 2003 中，统计总条带数、特异性条带数，并根据 NTSYS 2．10e 所计算的遗传相似系数进行聚类。同
时参照 Evanno et al［22］的方法，依次设定类群数(K)2 － 13，利用 STＲUTUＲE 2．2 软件通过△K 值预测来确
定合适的 K 值，△K 为 L″(K)的平均数除以 L(K)的标准差，L(K) = L(K)－ L(K － 1) ，
·45· 森 林 与 环 境 学 报 第 35 卷
L″(K) = L(K + 1)－ L(K) ，L(K)为 STＲUCTUＲE 2．2 运行结果 lnP(D)。
2 结果与分析
2．1 DNA质量检测
超微量紫外光分光光度计测得 CTAB-1 法和 CTAB-2 法所提取山枇杷 DNA 的 A260 /A280值分别介于:
1．55 － 1．92 和 1． 73 － 1． 89，初步判断 CTAB-2 法更适用于山枇杷基因组 DNA 的提取。提取过程中，
CTAB-1法提取的溶液易变为黄褐色，获得的 DNA样品含有不溶于 TE 的乳白色胶状物，电泳后发现点样
孔处有白色亮斑，因此蛋白质等杂质污染较为严重［图 1(a) ］，而 CTAB-2 法的上清液始终保持鲜绿色，提
取获得的 DNA沉淀为白色透明状，并能迅速溶于 TE，电泳结果条带清晰，并未发现杂质污染［图 1(b)］。
试验结果也进一步说明适当提高 CTAB 浓度，添加 PVP 和使用酚—氯仿—异戊醇，获得的山枇杷基因组
DNA纯度和质量更好。
注:M为 D2 000 DNA ladder;1 － 10 为 10 份山枇杷 DNA样品。
图 1 CTAB法提取 DNA电泳图谱
Figure 1 The DNA electrophoresis maps of 2 kinds of CTAB
2．2 引物筛选及 ISSＲ多样性分析
从 47 条随机引物中筛选得到 11 条适合山枇杷 ISSＲ分析的引物，占所有引物的23．40%，其编号依次
为:UBC807、UBC810、UBC823、UBC825、UBC835、UBC840、UBC841、UBC842、UBC857、UBC872、UBC873。
所筛选的引物中，UBC872、UBC873 为四核苷酸重复序列，其余均为二核苷酸重复序列，说明该样品山枇杷
基因组的 SSＲ组成主要是二核苷酸重复序列，其中腺嘌呤(adenine，A)含量最高，鸟嘌呤(guanine，G)、
胸腺嘧啶(thymine，T)的含量最少，由此，可以初步判断山枇杷中简单重复序列中核苷酸的组成。
11 条引物共扩增 85 个条带(表 1)，平均每条引物扩增条带 7．73 条，其中 UBC810 和 UBC873 最多，为
10 个条带，而 UBC807 最少，只有 5 条，部分引物的电泳图谱如图 2 所示。85 个条带中多态性条带总共有
61 条，占总条带数的 71． 76%，引物 UBC807、UBC841、UBC872 扩增结果多态性最好，均为 100%，而
UBC842 只有 25．0%，多态性最弱。
2．3 基于模型的聚类分析
对 41 份山枇杷样本采用 STＲUCTUＲE 2．2 软件进行分析，设置类群数(K)2 － 13，进行 8 次重复，分析
结果对数似然函数值［lnp(K)］如图 3 所示，曲线先上升后下降，在 K = 4、K = 7 和 K = 11 时均出现拐点，在
此基础上计算△K结果发现(图 4)，当△K = 4 时出现最大峰值，而△K = 7 和 11 时峰值较小，由此可估算
出类群数为 4，即通过 STＲUCTUＲE 2．2 将 41 份山枇杷划分为 4 个类群(A － D) ，划分结果以 4 种不同的颜
色体现，每种颜色代表一个类群(图 5) ，各类群的样本数分别为 14、10、7、10，类群 A中样本数最多，类群 C
最少，且不同类群之间的样品个数差异较大。在 41 个山枇杷样本中，后验概率(Q 值)大于 0．75 的有 24
个，其中 16 个大于 0．9，说明这 24 份样本类群划分依据较充分。Q 值介于 0．5 － 0．75 的为 14 个，而第 25
号样本在类群 A、B、C的 Q值分别是 0．258、0．344、0．370，类群划分准确度较弱。
·55·第 1 期 赖瑞联等:山枇杷基因组 DNA的提取及自然群体内 ISSＲ遗传多样性分析
表 1 11 条引物序列及 ISSＲ-PCＲ扩增多态性分析
Table 1 Sequences of 11 primers and their diversity analysis of ISSＲ-PCＲ
引物名称 引物序列(5 － 3) 退火温度 /℃ 扩增总条带数 /条 多态性条带数 /条 多态百分率 /%
UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 50 5 5 100．0
UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 50 10 7 70．0
UBC823 TCTCTCTCTCTCTCTCC 52 7 3 43．9
UBC825 ACACACACACACACACT 50 8 5 62．5
UBC835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 54 10 9 90．0
UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 51 6 4 66．7
UBC841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 54 7 7 100．0
UBC842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 54 8 2 25．0
UBC857 ACACACACACACACACYG 54 7 4 57．1
UBC872 GATAGATAGATAGATA 39 7 7 100．0
UBC873 GACAGACAGACAGACA 50 10 8 80．0
合计 － － 85 61 71．76
平均值 － － 7．64 5．36 －
注:M为 D2000 DNA Ladder，1 － 41 为 41 份山枇杷样品。
图 2 引物 UBC840 ISSＲ扩增结果
Figure 2 The profiles of ISSＲ amplification using primer UBC840
2．4 基于遗传距离的聚类分析
利用 NTSYS 2．10e软件计算遗传相似系数并对 41 份山枇杷进行距离聚类分析(图 6) ，其遗传相似系
数区间为 0．588 － 0．929，平均相似系数为 0．779，表明这些样本之间的遗传相似性较大，亲缘关系较强。在
这些材料中，样本 8 和样本 9、样本 17 和样本 10 之间的相似性最大，均为 0．929，样本 14 和样本 28 之间的
相似性最小，仅为 0．588。设定阀值(genetic similarity，GS)为 0．78 时，群体可分为 4 个类群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、
Ⅳ) ，其中类群Ⅰ有 31 个样本，类群Ⅱ有 3 个样本，类群Ⅲ有 6 个样本，而 28 号样本单独归为一个类群。
当 GS取 0．82 时，则有 13 个类群，其差异可多达 9 个。
·65· 森 林 与 环 境 学 报 第 35 卷
图 3 对数似然函数值随类群数的变化
Figure 3 Plot of the log-likelihood function value on the number of subgroups
图 4 △K值随类群数的变化
Figure 4 Plot of the △K value on the number of subgroups
注:红色为类群 A;绿色为类群 B;蓝色为类群 C;黄色为类群 D。
图 5 41 份山枇杷的 structure聚类结果
Figure 5 The clustering result of 41 G． multiflora samples by structure
图 6 41 份山枇杷样本的系统树状图
Figure 6 Dendrogram of 41 G． multiflora samples
·75·第 1 期 赖瑞联等:山枇杷基因组 DNA的提取及自然群体内 ISSＲ遗传多样性分析
3 讨论
多糖、多酚、单宁和色素等物质的去除是植物 DNA提取的关键步骤。山枇杷树体中富含有黄色的胶
状汁液，大量的多酚、多糖以及色素等，在用常规 CTAB 法提取 DNA时 TE 溶解后发现有白色胶状物质包
裹 DNA，不仅影响 DNA的纯度，也不利于 DNA 的溶解。这种现象在橡胶［23］、甘薯［24］中也曾有发现，因
此，有必要对抽提方法作出改良。借鉴安泽伟等［20］的方法，在细胞裂解前用添加除酚剂、抗氧化剂和渗透
压稳定剂的预冷缓冲液进行预处理，使其中一部分杂质溶解在缓冲液中，同时保持细胞正常生理状态，以
减少提取过程中这些杂质的干扰。而在裂解时，也通过更高浓度的去垢剂 CTAB 和添加酚的手段进一步
去除杂质，虽然步骤较普通提取方法复杂，但获得的山枇杷 DNA 样品的结果也显然更好。野生龙眼［25］、
野生桃［26］等多种野生植物资源的开发研究中，常规 CTAB 法难以提取获得高质量 DNA，在植物某些已知
特性的基础上对本试验中的 CATB －2 法稍作改良则可以提供一种高效、便捷的途径。
在对戴云山脉九仙山地区山枇杷进行自然群体内 ISSＲ 分析时，筛选的 11 条引物扩增的条带 5 － 10
条不等，共 85 条，其中多态性条带为 61 条，占总条带数的 71．76%，可见，该地区的山枇杷多态性丰富，具
有较高的遗传多样性。而利用 NTSYS 2．10e计算发现 41 份样本的遗传相似系数介于 0．588 － 0．929，平均
值为 0．779，说明了该群体中个体之间较高的遗传相似性，亲缘关系较为密切。这 41 份样本中同时具备较
高的遗传多样性和遗传相似性可能源于不同个体之间的遗传信息交流，而利用 STＲUCTUＲE 2．2 软件分析
恰恰可以对这一现象进行解释，STＲUCTUＲE 2．2 软件基于模型聚类将这 41 份样本划分为 4 个类群，结合
聚类的效果图和 Q值来分析，可以发现，大部分样本之间基本能保持自身基因型的差异，但也有部分存在
较强的基因交流，例如样本 9 属于 A类群和 B类群的概率分别是 0．514 和 0．475，而样品 25 属于 A类群、
B类群和 C类群的概率分别是 0．258、0．344 和 0．370，皆存在较为严重的遗传信息交流，而这种现象对于
进一步丰富该地区山枇杷的遗传多样性有较好的推动作用，为该山枇杷种质资源在育种和药用研究等方
面的开发利用提供了更为广阔的遗传背景，且与单一遗传背景的种质资源相比，更有利于物种保护。
目前，对山枇杷的开发利用尚处于早期阶段，其果实的药用成分、食用特性、种子的高含油量以及树干
的耐用性等等使用价值方面的巨大潜力还有待开发，而开发较少主要存在以下几方面原因。首先，和其他
野生种质资源一样，山枇杷通常地处海拔较高的偏僻山区地带，交通不便，且寻找不易;其次，山枇杷相关
研究的投入极少，人们的对其认识不足。因此可以通过借鉴魏开炬等［27］的方法对山枇杷种质资源分布情
况开展调查，对部分资源进行栽培化、品种化试验，对山枇杷的有效成分进一步鉴定，加大科研投入。本研
究对戴云山脉九仙山地区山枇杷自然群体的遗传多样性和遗传结构分析为这一野生资源的育种工作和后
期的相关研究奠定了基础。
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［27］魏开炬，陈锡桓，詹祖仁，等．福建九阜山野生芳香植物资源及其开发利用［J］．亚热带植物科学，2012，41(3) :38 － 46．
(责任编辑:温凤英)
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《福建林学院学报》荣获第五届中国高校优秀科技期刊奖
根据教育部科技司(教技司〔2014〕288 号)———
关于公布“第五届中国高校精品·优秀·特色科技
期刊”评比结果的通知，《福建林学院学报》荣获第
五届中国高校优秀科技期刊奖。在全国 108 种获奖
学报中，福建省高校学报仅《福建林学院学报》《福
建农林大学学报(自然科学版)》《厦门大学学报(自
然科学版)》《福建师范大学学报(自然科学版)》获
得此奖项。
本刊编辑部
·95·第 1 期 赖瑞联等:山枇杷基因组 DNA的提取及自然群体内 ISSＲ遗传多样性分析