全 文 ：哈茨木霉发酵产物对豇豆立枯病的抗生作用
魏　林1＊ ,梁志怀1 ,罗赫荣1 , 2 ,成燕清1
(1.湖南省植物保护研究所 , 中国 长沙　410125;2.湖南农业大学生物安全科技学院 ,中国 长沙　410128)
摘　要　为探明木霉发酵产物对植物病害的拮抗机制 , 用哈茨木霉 T2-16菌株发酵产物对豇豆苗期立枯病菌进
行了离体抑菌 、田间浸种防病试验.结果表明 ,该发酵产物对病原菌具有抗菌作用 , 使病菌菌丝原生质浓缩 、外渗 ,
菌丝体断裂 、消解;经发酵液浸种处理的豇豆幼苗在人工接种立枯病菌后 , 叶片中过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶
(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性均增强 ,立枯病发病率也低于对照 ,对该病的防效可达 75.66%.
关键词　哈茨木霉 T2-16;发酵产物;豇豆;立枯病
中图分类号　Q936　　　　文献标识码　A　　　　文章编号　1000-2537(2006)04-0077-04
Study On the Antagonism of the Fermentation Product of
Trichoderma harzianum T2-16 Against Rhizoctonia solani in Cowpea Plant
WEI Lin
1 ,LIANG Zhi-huai 1 , LUO He-rong1 , 2 , Cheng Yan-qing1
(1.Hunan Plant Protection Research Institute , Changsha 410125 , China;
2.College of Biological Safety Science and Technology , Changsha 410128 , China)
Abstract　The fermentation product of Trichoderma harzianum T2-16 has shown the strong antagonistic action against
the pathogens of Rhizoctonia solani in solid culture medium.The pathogen hyphal plasma contracted , vacuolated and dis-
rupted .The fermentation product is also applied in cowpea by seed soaking.In fild tests , the treated cowpea seedlings is
inoculated with Rhizoctonia solani.The defensive enzyme activities of peroxidase(POD), polyphenol oxidase(PPO)and
phenylalanine ammonia-lyase(PAL)in cowpea seedling leaf pretreated with the T2-16 strain are increased by various level
after inoculation with the pathogen.The results also show T2-16 treated cowpea seeds reduce the rates of diseased and dis-
ease index.The efficiency of resistance to the pathogen is 75.66%.
Key words　 Trichoderma harzianum T2-16;fermentation product;cowpea;Rhizoctonia solani
随着人们对无公害蔬菜的生产以及病原菌抗药性等问题的日益关注 ,生物防治蔬菜病害的重要性愈发
突出.目前 ,在利用有益微生物防治蔬菜病害方面已有许多积极的探索[ 1] ,其中哈茨木霉(Trichoderma harzia-
num)由于其抗菌谱广 、可应用于多种作物 ,而倍受青睐[ 2] .但关于其发酵和抗生代谢产物对豇豆苗期立枯病
菌的作用机理尚未见详细报道 ,笔者利用哈茨木霉 T2-16发酵代谢产物对豇豆种子浸种处理 ,初步研究了其对
豇豆苗期立枯病 Rhizoctonia solani 的抗生作用.
收稿日期:2006-06-18
基金项目:湖南省自然科学基金项目资助(03JJY4013 和 04JJ3075);湖南农科院院长基金项目资助
＊通讯作者.Email:weilincn@163.com
2006 年 12月
第 29 卷 第 4期　　　　　　　　 　
湖南师范大学自然科学学报
Journal of Natural Science of Hunan Normal University
　　　　　　　　 　Vol.29　No.4
Dec., 2006
1　实验部分
1.1　材料
豇豆品种为“特选28-2” ,系江西省丰城市津南区种子公司生产.哈茨木霉T2-16菌株由湖南省植物保护研
究所生防研究室从土壤中分离得到 ,并在PDA平板固体培养基上于 26 ℃培养 7 d待用;立枯病菌分离自田
间豇豆立枯病病株 ,置于 PDA平板固体培养基上于 26 ℃培养直至其大量产生菌核 ,收集菌核.
1.2　方法
1.2.1　哈茨木霉T2-16发酵产物的制备　用适量灭菌的 0.1%吐温 80将固体培养 7 d的 T2-16菌株平板表面孢
子洗脱 ,孢子悬浮液通过两层无菌纱布过滤后 ,将其浓度调节为1×108 个孢子 mL.对哈茨木霉T2-16采用三级
发酵和固液两相发酵相结合的培养方法培养.其中三级发酵培养的培养基为改良的 GPF 培养基(主要成分
为葡萄糖 、酒石酸氨 、KH2PO4 和少量的维生素 ,pH=6.2).将培养 7 d的发酵液用G3 耐酸漏斗经 0.22 μm滤
膜真空过滤 ,得到的无菌滤液高压灭菌后即为供试的木霉发酵原液 ,于室温下储存备用.
1.2.2　T2-16发酵产物对立枯病菌室内毒力的测定　将 20 mLPDA平板打一个直径为 4 mm 的小孔 ,在小孔中
加入 50μL发酵液的无菌滤液 ,1 h以后 ,将生长一致的 2日龄(直径为 8 mm)的供试病原菌菌丝圆块分别置
于孔上 ,28 ℃下培养 3 d ,测量菌落直径 ,计算抑菌率[ 3] ,并挑取病原菌的菌丝体制片 ,在显微镜下观察菌丝
生长 、变化的情况.以灭菌水为对照 ,每处理重复 5次.
1.2.3　T2-16发酵产物的浸种处理与播种方法　将表面消毒的豇豆种子数百粒 ,分别在木霉发酵原液稀释 10
倍液和无菌水中浸泡 6 h后 ,播种在肥水等耕作条件基本一致的田土中.每处理重复 3个小区 ,每小区播 300
粒左右种子 ,各小区随机排列.
1.2.4　病原菌的接种处理　在豇豆出苗 20 d后 ,在每小区选择长势一致 、健壮的植株进行立枯病病原菌的
人工接种 ,接种方法为表施菌核 ,每株幼苗根部接种含 3粒菌核的菌丝块 ,每小区接种 40株.7 d后观察记载
病害发病株数.
1.2.5　T2-16发酵产物处理后豇豆体内防御酶活性的测定　分别在接种后1 ,3 ,5 ,7 ,12 d随机剪取不同浸种处
理 、并接种病原菌的植株叶片 ,进行过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)活性的测
定.3种酶的酶液提取和测定均参考李玉泉[ 4] 、朱广廉[ 5] 等的方法 ,并略作改进.
2　结果与分析
2.1　T2-16发酵产物对立枯病菌的生长抑制效果
在含 T2-16发酵产物的平板培养基上 ,病原菌菌丝生长均受到显著抑制.对照菌落直径为 7.63 cm ,而在
T2-16发酵滤液处理的培养基上 ,供试病原菌生长缓慢 ,菌落直径仅为 1.90 cm.T2-16发酵滤液对该病原菌表现
出较强的抑制作用 ,抑菌率达到了 75.10%.观察在含 T2-16发酵产物的平板培养基上生长的病原菌菌丝 ,可发
现其营养菌丝逐渐失活;气生菌丝生长混乱 、变黄.显微镜观察病原菌菌丝 ,其原生质出现了浓缩 、液泡化 ,菌
丝出现了从隔膜处断裂 、解体的现象 ,有些菌丝还发生自溶现象.并且菌丝顶部变细 ,内容物减少 ,出现许多
病原菌碎段 ,还可观察到明显的原生质体外渗的现象(图 1 A-F).说明哈茨木霉发酵产物中存在一些重要的
生理活性物质 ,对供试病原菌具有强抗生作用 ,这与国外文献报道相符[ 6] .
2.2　T2-16发酵产物对豇豆立枯病的防治效果
木霉 T2-16发酵产物浸种处理后 ,豇豆幼苗立枯病的发病率为 13.6%,低于清水浸种处理的发病率(为
57.4%).即使在人工接种病原菌的情况下 ,对立枯病的相对防效仍然达到 75.66%,表明该发酵产物通过种
子处理对立枯病具有较好的防治效果.
2.3　T2-16处理对豇豆苗防御酶活性的影响
在接种立枯病菌后 ,经木霉T2-16发酵产物浸种处理的豇豆幼苗叶片中 PAL ,PPO和 POD 3种酶活性在接
种病原菌后的前 7 d逐渐增强 ,并在接种后 7 ～ 8 d达到活性的最高峰值 ,之后又呈逐渐下降的趋势 ,在最高
78 　　　　　　　　　　　　　　　　湖南师范大学自然科学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　第 29卷
峰值时 ,除 PPO酶外 ,都显著高于对照.对照的 3种酶活性峰值较小 ,且下降的趋势快于木霉发酵液浸种处
理(见图 2).
A:立枯丝核菌正常菌丝(×600);B:T2-16发酵液作用下菌丝高度液泡化 , 顶端菌丝萎缩成
细线(×600);C:T2-16发酵液作用下菌丝成为空腔(×600);D:T2-16发酵液作用下出现大量
厚垣孢子(×600);E:T2-16发酵液作用下原生质体外渗 , 菌丝缢缩(×600);F:T2-16发酵液作
用下菌丝原生质浓缩 、菌丝断裂(×150)
图 1　T2-16发酵产物对立枯病菌生长的抑制效果
图2　不同处理的豇豆幼苗接种 R.solani 后酶活性变化
79第 4期　　　　　　　　　　　　魏　林等:哈茨木霉发酵产物对豇豆立枯病抗生作用的研究　　　　　　　　　　　　　　
3　讨论
经研究表明 ,当植株处于逆境下 ,细胞内将积累大量O-2 ,O2 ,H2O2 等活性氧 ,从而伤害植物细胞膜系统 ,
造成色素的丧失 、膜透性的扩大 、离子的外渗甚至导致植株的死亡.而过氧化物酶(POD)是细胞抵御活性氧
伤害的保护酶系统的主要组成部分 ,在清除活性氧 、阻止活性氧的形成和延缓植物衰老等方面起着重要作
用 ,并与植物的抗病性反应密切相关;多酚氧化酶(PPO),苯丙氨酸解氨酶(PAL)则是植物抗病物质酚类化合
物合成的关键酶.因此 ,这些酶的活性高低与植物抵抗包括病害在内的逆境的能力有着十分密切的关系 ,提
高它们的活性对增强植物的抗病性是十分有利的[ 7-12] .
在本试验中 ,哈茨木霉T2-16发酵产物处理豇豆种子 ,在接种病原菌前 3种酶活性就高于对照.而经哈茨
木霉 T2-16发酵产物浸种处理的豇豆幼苗 ,在接种立枯病病菌后的 24 h内 PAL , POD和 PPO 活性就较清水浸
种处理的对照有了较大的提高 ,从而较早地诱导了豇豆幼苗对病原菌的抗性 ,最终有效地降低了病害的发
生.目前国内外关于木霉防病机制的研究 ,都集中于木霉菌本身 ,本研究通过哈茨木霉 T2-16发酵代谢产物对
豇豆立枯病拮抗性及对豇豆体内防御系统主要防御酶影响的研究 ,表明该类发酵产物不但对病原菌本身具
抑制作用 ,而且还能增强豇豆幼苗防御酶的活性 ,说明其防病机制是多方面的 ,防病效果是各种机制综合作
用的结果.激发植物的防卫反应是一个复杂的生理生化过程 ,其中诱导抗性的特点和分子机制 ,以及哈茨木
霉T2-16发酵产物中起诱导作用的活性物质等方面都有待于进一步的研究.
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