全 文 ：!!#
罗兴武
（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 !!###）
摘$ 要：以鸭儿芹多酚氧化酶的基本性质为研究目标，考察了鸭儿芹多酚氧化酶的反应进程及温度、%&、底物浓度以及
酶浓度对其活性的影响。结果表明：鸭儿芹多酚氧化酶在反应过程中催化速率并不随时间的增加而增大，鸭儿芹多酚
氧化酶的最适活性温度为 !#’，%&为 ()!，酶反应底物浓度为 #)*+,·+- .*，酶浓度为 #)!,·+- .*。
关键词：鸭儿芹，多酚氧化酶
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中图分类号：95H)*$ $ $ $ 文献标识码：I$ $ $ $ 文 章 编 号：*##H.#J#(（H#*#）**.#**.#J
收稿日期：H##K.**.*J
作者简介：罗兴武（*KL.），男，硕士，讲师，主要从事天然产物开发与
利用方面的研究。
基金项目：湖北省自然科学基金项目（H##JI;I*HL）。
$ $ 鸭儿芹（!#$%&%’()*’ +’$&)*,’ -’../）是伞形科
（012(33*4(’(）多年生草本植物，又名水白芷、大鸭脚
板［*］等。鸭儿芹原产于日本和中国，在我国主要分布
于长江以南各省区，鸭儿芹抗逆性强，是一种有发展
前途的特色蔬菜［H］。鸭儿芹富含胡萝卜素、维生素
/*、维生素 /H、尼克酸、维生素 G、钙、铁、锌等多种维
生素及矿物质［J］，以鸭儿芹为原料，经护色、调味、杀
菌、包装等工艺，制成色泽好、营养丰富、口感好并具
有特殊风味的成品［!］，深受广大消费者的欢迎。多酚
氧化酶（MMN）广泛存在于许多植物组织、真菌和某
些动物中。对鸭儿芹的化学成分进行研究，发现其
中含有丰富的黄酮类物质，很多研究表明，抗氧化剂
对自由基有很强的清除作用，黄酮类化合物是具有
酚羟基的一类还原性化合物，在复杂反应体系中，由
于其自身被氧化而具有抗氧化作用［］。酶促褐变与
鸭儿芹衰老有密切关系，衰老过程中酶与底物的分
区定位遭到破坏是导致酶促褐变的主要原因。鸭儿
芹多酚氧化酶安全无毒，可以赋予食品鲜艳柔和的
色泽，还具有一定的抗氧化能力，值得进一步研究和
开发［(］。
89 材料与方法
8:89 材料与设备
鸭儿芹$ 于 H##O 年 J 月 *O 日采于恩施职业技
术学院后山，除去杂质、黄叶、老叶，洗净，用保鲜袋
装好，置于 !’的冰箱中，待用；邻苯二酚、丙酮、磷酸
氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙酸钠、冰醋酸、甘氨酸、
盐酸、9<0B等$ 均为国产分析纯。
9P-.-(P.I型高速冷冻离心机，紫外可见分光
光度系统，电热恒温水浴锅，电子天平，粉粹机，抽
滤机。
8:;9 实验方法
*)H)*$ 鸭儿芹 MMN提取条件的选择$ 采用不同的丙
酮浓度提取鸭儿芹 MMN，配制浓度分别为 *##Q、
#Q、JJ)JQ、HQ的丙酮，放置于 !’的冰箱中待用。
在吸光光度计下分别测定吸光度，比较后选出最好
效果的丙酮浓度。
*)H)H$ 鸭儿芹 MMN反应进程曲线的测定$ 取 L 支试
管，编号 # R(，分别加入 H+- %&()! 磷酸缓冲液和
H+- #)*+12 S -邻苯二酚，其中 # 号试管加入 #)+-蒸
馏水，*R( 号试管各加入 #)+- 鸭儿芹 MMN 粗酶液。
振荡，置于 !#’水浴箱中，其中 # 号试管为对照，精
确计时，在 #R*H+07中每隔 H+07 测定其在 !*#7+下
的吸光度。以时间作为横坐标，以吸光度 N;作为纵
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2010.11.040
!#$
坐标，做出反应进程曲线，并分析最适反应时间
范围。
!#$% 反应条件对鸭儿芹 &&’活性的影响
!#$!% 温度对鸭儿芹 &&’ 活性的影响% 反应体系
分别置于温度为 !(、#(、$(、)(、*(、+(,的水浴锅中
各反应 !(-./。
!#$#% 01条件对鸭儿芹 &&’活性的影响% 用甘氨
酸2 134 缓冲液、5678 2 178 缓冲液、56#1&’) 2
561#&’) 缓冲液及 9:.;2134 缓冲液调整体系的 01
分别为 #)、)#、+(、+#、+)、++、+<、=+、>(。
!#$$% 底物浓度对鸭儿芹 &&’ 活性的影响% 反应
液总体积 )*-?，加入 (*-?酶液，改变底物浓度，反
应 )-./，测定鸭儿芹 &&’的活性。
!#$)% 酶浓度对鸭儿芹 &&’ 活性的影响% 反应液
总体积维持在 )*-? 的前提下改变酶液添加量，分
别测定不同酶浓度下鸭儿芹 &&’的活性。
!#)% 蛋白质含量的测定 % 考马斯亮蓝 @2#*( 比
色法［=］。
!#*% 鸭儿芹 &&’活性的测定% &&’粗酶液的制备
参照文献［<］进行。&&’ 活性测定参照文献［>］进
行。酶活力单位定义为：在最适温度、最适 01 条件
下，每 --A4 B ?底物浓度每分钟增加 ((! 吸光度所需
要的酶量为 ! 个酶活力单位。
! 结果与分析
!#$ 鸭儿芹 %%&反应进程曲线
反应进程曲线上每一点的斜率就是该点相应时
刻的反应速度。由图 ! 可以看出，在初期，反应产物
的吸光度比较小，表示褐变程度并不十分明显。但
是，反应产物的吸光度随着时间的延长几乎呈线性
增长，说明鸭儿芹 &&’ 的活性始终维持在最初的水
平，并没有随着时间的延长而下降，当达到一定的时
间时，鸭儿芹制品的褐变问题就会显现出来。
图 !% 鸭儿芹 &&’反应进程曲线
!#! 温度对鸭儿芹 %%&活性的影响
由图 # 可以看出，鸭儿芹 &&’ 在 $(C*(,具有
较高的活性，其最适反应温度为 )(,，当温度达到
+(,以后，鸭儿芹 &&’几乎完全失活。
这是因为随着温度的升高，鸭儿芹 &&’ 变性，从
而使其活性减弱。由此可见，鸭儿芹 &&’ 不是耐热
的酶。因此，在较高的温度条件下处理即可使酶变
性失活，在一定程度上可以抑制其酶促褐变发生。
!#’ ()对鸭儿芹 %%&活性的影响
由图 $ 可见，鸭儿芹 &&’ 在中性条件下具有较
高的活性，其最适 01 为 +)。这是因为其酶的活性
部位含有组氨酸基团（0D E +(），所以在中性条件下
图 #% 温度对鸭儿芹 &&’活性的影响
表现出较高的酶活性。此外，在酸性条件下，对酶的
辅基铜离子的稳定性有利；在碱性条件下，铜离子以
3F（’1）# 的形式沉淀出来，酶的活性受到抑制。图
$ 中，01$C* 和 01 范围内出现 # 个小峰，可能是
由于存在同工酶产生的效应所致。
图 $% 01对鸭儿芹 &&’活性的影响
!#* 底物浓度对鸭儿芹 %%&活性的影响
由图 ) 可以看出，鸭儿芹多酚氧化酶活性在底
物浓度为 (!-G·-? 2!以内时，随着底物浓度的增
加，酶活性不断增加，且酶活性与底物浓度呈极显著
的正相关关系，相关系数 H E(>>*)==，回归方程 I E
>!$*J2((*<>（I 表示鸭儿芹多酚氧化酶活性，J 表
示底物浓度）。当底物浓度大于 (!-G·-? 2!时，酶
活性停止增大，保持平稳。因此最适的酶反应底物
浓度为 (!-G·-? 2!。
图 )% 底物浓度对鸭儿芹 &&’活性的影响
!#+ 酶浓度对鸭儿芹 %%&活性影响
图 *% 酶浓度对鸭儿芹 &&’活性的影响
（下转第 !=) 页）
由图 * 可以看出，在酶浓度较低的情况下，酶活
!#$
! 讨论
传统简并引物设计思路是对与目标基因亲缘关
系比较近的氨基酸序列进行对比后，根据其保守序
列和密码子的简并性设计出长度在 !#$%&’ 的引物
序列。由于传统引物很少考虑到物种的密码子偏好
性，简并度较高，同时传统简并引物的 () 值一般都
比较低，这些因素往往导致 *+,结果不理想，特异性
不高，假阳性率增加。本研究通过 +-./0-*策略来
设计简并引物，引物 %1端为核心简并区，21端为非简
并性夹板结构，21端夹板结构是根据不同物种密码子
偏好性设计的特异性序列［3］。它大大减少了引物的
简并度且不影响引物的有效性，与传统方法设计的
简并引物相比，具有扩增特异性高、*+, 反应条件易
摸索的优点。
常规筛选基因组文库的方法是通过菌落杂交或
将排列在微孔板中的单克隆复制到尼龙膜上筛选阳性
克隆［!45!!］，费时费力。67889［!$］首先提出了采用 *+,
方法筛选混合池快速定位阳性克隆子，为筛选单克隆
减少了很大的工作量，避免了人力和物力的浪费。
本研究采用 +-./0-* *+,结合 *+,筛选橙色
红曲菌 :;<)=> 文库的方法克隆了橙色红曲菌 !#6
基因全长，为红曲菌及其它真菌新基因的克隆提供
了一个有效的途径。该基因全长的获得为橙色红曲
菌同源转化系统的构建奠定了基础。
参考文献
［!］0?7@=9A@ D，E7@@879 F /，G8=HC + E I，8@ ?CJ.8B8C;’)89@
;K ? L;);C;A;M< @7?9
;9 @L8 !#6 A898［I］JE;C 689 6898@，!3O，$4P：O!5OPJ
［$］I;L?99? : 6，IM7A89 .，Q;@L?7 QJR<8 ;K ,-+.%/*% 8S@7?T@< ?<
?9 ?C@879?@=B8 @; 9=@7=@8 =9 )8?@ ’7;>MT@<［ I］J :C8=!33!，O!（!4）：!!V5!!PJ
［%］08&87 .，W=’ F，X;K ? ’7;’7=8@?7N +L=98<8 78>5N8?<@57=T8 >=8@?7N E I +L=9 YM87，!333，P3：$%!5$%PJ
［V］Z;9; F，0=)89; ZJX9@=)=T7;&=?C ?T@=B=@N ;K ,-+.%/*% !()-%*%
F:- V2$4 ?A?=9<@ T;9@?)=9?9@ ;K Z;H=［ I］J [=;[=;TL8)，!333，P%：!V3V5!V3PJ
［2］[C?9T * I，Q?M<);9?=9 X K7;) ,-+.%/*% ?< T=@7=9=9［ I］J F9@ I :;;>
E=T7;&=;C，!332，$O：$4!5$!%J
［P］+?)’;N ]，*^78\ :，E?7@_9 I :，8@ ?CJ]@?&C8 @7?9@L8 ?\?’L=C;98 ’=A)89@5 ’7;>MT=9A ,-+.%/*% !*#!*#&*% ;&@?=98>
&N ’7;@;’C?<@ @7?9 XA7;&?T@87=M)5 )8>=?@8> .YX
@7?9［O］,;<8 ( E，089=‘;KK I 6，089=‘;KK ]J+-./0-*（+;9<89.8A8987?@8 0N&7=> -C=A;9MTC8;@=>8 *7=)87）*+, ’7=)87 >8<=A9
［I］JYMTC8=T XT=>< ,8<8?7TL，$44%，%!：%OP%5%OPPJ
［］袁勇芳，许杨，李思光，等 J红曲霉 .YX 提取及其 ,X*.5
*+, 反应体系的建立［I］J生物技术，$442，!：35!VJ
［3］,;<8 ( E，]TLMC@\ / ,，089=‘;KK I 6，8@ ?CJ +;9<89>8A8987?@8 LN&7=> ;C=A;9MTC8;@=>8 ’7=)87< K;7 ?)’C=K=T?@=;9 ;K
>=<@?9@CN 78C?@8> <8aM89T8<［I］JYMTC8=T XT=>< ,8<8?7TL，!33，$P
（O）：!P$5!P%2J
［!4］ F;?99;M * X，X)8)=N? + (，6?798< I，8@ ?CJ X 98U
&?T@87=;’L?A8 *! 5 >87=B8> B8T@;7 K;7 @L8 ’7;’?A?@=;9 ;K C?7A8
LM)?9 .YX K7?A)89@<［I］JY?@M78 6898@，!33V（P）：V53J
［!!］GL?9A 0 [，+L;= ]，D;; ] ]，8@ ?CJ +;9<@7MT@=;9 ?9>
TL?7?T@87=\?@=;9 ;K @U; 7=T8 &?T@87=?C ?7@=K=T=?C TL7;);<;)8
C=&7?7=8< K7;) @L8 ’?789@< ;K ? ’87)?989@ 78T;)&=9?9@ =9&78>
)?’’=9A ’;’MC?@=;9［I］JE;C [788>，!33P（$）：!5!VJ
［!$］67889 / .，-C<;9 E bJ ]N<@8)?@=T ?7@=K=T=?C TL7;);<;)8 C=&7?7=8< &N M<8 ;K @L8 ’;CN)87?<8 TL?=9
78?T@=;9［I］J*7;T Y?@C XT?> ]T= R]X，!334，O：
###############################################
!$!%5!$!OJ
（上接第 !2$ 页）
性几乎随着酶浓度的增加而线性增加，当初酶浓度
达到 4J2!A·)Q 5!时，酶活性达到最大，且酶活性与
酶浓度呈极显著的正相关关系，相关系数 , c
4J332VOO，回归方程 N c $J3%VS d 4J!%V（ N 表示鸭儿
芹多酚氧化酶活性，S 表示酶浓度）。当初酶浓度超
过该值时，鸭儿芹多酚氧化酶活性的增加趋势变得
较为缓慢。因此，该酶促反应的最适酶浓度为
4J2!A·)Q 5!。
! 结论
多酚氧化酶是鸭儿芹组织内广泛存在的一种含
铜氧化酶，当鸭儿芹植株受到机械损伤和病菌侵染
后，鸭儿芹 **-催化酚与 -$ 氧化形成醌，使组织形
成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病
能力，所以对于 **- 的研究具有重要的意义。鸭儿
芹 **-不是很耐热的酶，其最适温度为 V4e，最适
’0为 PJV；当鸭儿芹 **-浓度较低时，酶促反应的初
速度随酶浓度的增加而线性增长，但是当鸭儿芹
**- 浓度增加到一定程度时，其反应速度的增长趋
势渐渐趋于平缓。
参考文献
［!］高敏，刘佳，俞红，等 J野生鸭儿芹毒性及致突变性研究
［I］J预防医学情报杂志，$442，$!（V）：24V5242J
［$］王章玮 J高山特色蔬菜鸭掌菜栽培技术［ I］J现代农业科
技，$44P（!!）：%4J
［%］张敏，唐克华，黄荣芳，等 J鸭儿芹及制品中矿质元素分析
［I］J中国野生植物资源，$442，$V（$）：V%5V2J
［V］郑剑 J鸭儿芹软包装的护绿工艺研究［ I］J食品研究与开
发，$44P，$O（P）：!%2J
［2］陈全斌，苏小建，沈钟苏 J罗汉果叶黄酮抗氧化能力研究
［I］J食品研究与开发，$44P，$O（!4）：!35!3!J
［P］马越，李东华，赵晓燕，等 J紫甘蓝色素抗氧化能力的研究
［I］J食品研究与开发，$44P，$O（!!）：235P$J
［O］李合生 J植物生理生化实验原理和技术［E］J北京：高等
教育出版社，$44!：!2VJ
［］陈学红，秦卫东，高卉，等 J莴苣中多酚氧化酶特性的研究
［I］J食品科学，$44%，$V（%）：$35%$J
［3］杨方琪，高福成 J广东芝麻香蕉加工中的酶褐变研究—多
酚氧化酶的提取、分离及其特性研究［ I］J无锡轻工业学院学
报，!33V，!%（!）：!45$4J