全 文 ：臭牡丹总黄酮对人肝癌 HepG2 细胞增殖作用的实验研究
胡 琦1，朱克俭2，谭小宁2，李勇敏2
(1. 湖南中医药大学，湖南 长沙，410208;
2. 湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙，410006)
［摘要］ 目的:研究臭牡丹总黄酮体外对培养的人肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法:提取中药臭牡丹的有效成分臭牡丹
总黄酮，采用不同浓度分别作用于培养的 HepG2细胞，通过细胞形态学和 MTT法检测臭牡丹总黄酮对 HepG2 细胞增殖的影响。
结果:臭牡丹总黄酮药物浓度在 0. 025、0. 25、2. 5、25、250μg /mL时的抑制率分别为 5. 55%、12. 73%、14. 84%、62. 44%、76. 81%，
与对照组比较差异均有统计学意义(P ＜0. 05)。结论 臭牡丹总黄酮体外对人肝癌 HepG2细胞的增殖有明显抑制作用。
［关键词］ 臭牡丹总黄酮;人肝癌细胞;MTT法;细胞形态学
［中图分类号］Ｒ285. 5 ［文献标识码］A ［文章编号］1003 － 7705(2015)04 － 0166 － 02
基金项目:湖南省教育厅科学研究资助项目(编号:14C0871)
第一作者:胡琦，女，医师，研究方向:恶性肿瘤的中医辨证论治
通讯作者:朱克俭，男，研究员，博士研究生导师，研究方向:内科疑难病辨治方法学研究，E － mail:zkjo0731@263. net
Experimental study of Total Flavonoids Isolated from Clerodendrum Bungei on
human hepatoma HepG2 cells proliferative effect
HU Qi1，ZHU Ke － jian2，Tan Xiao － ning2，LI Yong － min2
(1. Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，410208，Hunan China;
2. Hunan Academy of traditional Chinese Medicine，Changsha，410006，Hunan China)
Abstract:Objective:To study the clerodendrum flavonoids on cultured in vitro proliferation of human hepatoma
HepG2 cells. Methods:traditional Chinese medicine active ingredients of clerodendron clerodendrum flavonoids，re-
spectively for using different concentrations of HepG2 cells and establishment of the blank control and the positive
control group，by cell morphology and MTT assay for detection of clerodendrum effects of flavonoids on the growth of
HepG2 cells. Ｒesults:concentrations of total flavonoids from clerodendron 0. 025，0. 25，2. 5，25，250μg /mL，re-
spectively，5. 55%，12. 73%，14. 84%，62. 44%，76. 81%，has significant difference compared with the placebo
group(P ＜ 0. 05). Conclusion:clerodendrum total flavone on the proliferation of human hepatoma HepG2 cells in
vitro significantly inhibited.
Key words:clerodendrum total flavonoids;human hepatoma;MTT method;cell morphology
臭牡丹是著名中医药学家欧阳锜研究员发掘且临床习
用的防治恶性肿瘤的药物。其性平，味辛、苦，具有健脾养
血、解毒散瘀之效。有研究表明，中药黄酮类化合物具有明
显的抗肿瘤活性［1 － 2］，但有关臭牡丹总黄酮对肝癌活性作用
尚未见报道。为此，笔者采用细胞形态学、MTT 法等方法，
对其抗人肝癌 HepG2 细胞增殖作用进行了研究。
1 实验材料
1. 1 细胞株 人肝癌细胞株 HepG2，由湖南省湘雅医院细
胞研究所提供，于湖南中医药大学附属中西医结合医院中
心实验室传代培养。
1. 2 药物 臭牡丹饮片由湖南中医药大学附属中西医结
合医院中药房提供，经湖南省中医药研究院中药研究所鉴
定、提取。方法:采用溶剂萃取法，取臭牡丹地上部分，加入
10 倍量蒸馏水煮沸 20min 后过滤，剩余残渣再用蒸馏水加
热提取，将两次滤过液合并，浓缩后用 3 倍量 95%乙醇静置
48h后，减压过滤并回收滤液中乙醇至无醇味。溶液依次使
用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯提取液浓缩、干
燥。干膏粉黄酮总含量 51%，1g相当于生药 30g。
1. 3 主要试剂及仪器 1640 培养液:美国 Gibco公司产品;
0. 25%胰蛋白酶:美国 Amresco 公司产品;胎牛血清:美国
HyClone公司产品;MTT:德国 biomol 公司产品;二甲基亚
砜:德国 biomol公司产品;PBS缓冲液:长沙维尔生物试剂公
司;青链霉素混合液(100 ×):长沙维尔生物试剂公司。
超净工作台:上海净化设备厂;二氧化碳孵箱:德国
Heraeus公司;倒置显微镜:上海光学仪器产;22Ｒ 型低温高
速离心机:知信仪器;Modle500 酶联免疫检测仪:美国 Bio －
Ｒad公司;普通冰箱:荣事达产品;PowerShot A75 型数码相
机:日本 sony公司。
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第 31 卷第 4 期
2015 年 4 月 HUNAN JOUＲNAL OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol. 31 No. 4
Apr 2015
2 实验方法
2. 1 药物配制 称取 50mg 臭牡丹总黄酮，溶于 2mL 二甲
基亚砜(DMSO)溶液中，滤器过滤，得储液为 25mg /mL。用
完全培养基稀释成工作浓度:10μg /mL，25μg /mL，40μg /mL。
2. 2 细胞培养 取出冻存于液氮中的 HepG2 肝癌细胞株，
接种于 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中。37℃，5%
CO2 孵育箱培养。根据细胞生长情况，每 1 ～ 2d左右更换培
养液，细胞汇合率达 70% ～ 80%，待细胞生长达饱和状态
时，进行消化传代，选择对数生长期细胞进行实验。
2. 3 臭牡丹总黄酮对人肝癌细胞株 HepG2 形态的影响
选取人肝癌细胞株 HepG2 复苏，传代，待细胞生长稳定后，
取指数生长期细胞，用 0. 25%胰蛋白酶消化，吹打均匀后加
含有 10%胎牛血清的 ＲPMI － 1640 培养液悬浮细胞，将细胞
数量调整为 5 × 104 /mL接种于六孔板中，每孔 3ml，培养 24h
后见细胞贴壁状态良好，弃培养液，分别加入含 10% 10μg /
mL臭牡丹总黄酮(低剂量)、25μg /mL 臭牡丹总黄酮(中剂
量)、40μg /mL臭牡丹总黄酮(高剂量)的 ＲPMI － 1640 培养
液，并设立空白对照组和阳性对照组(终浓度为 2ng /mL)，
CO2 培养箱继续培养 48h后，在倒置显微镜下观察细胞的形
态学变化并拍照记录。
2. 4 臭牡丹总黄酮对人肝癌细胞株 HepG2 增殖的影响
采用四氮唑盐还原法(MTT 法)。通过预试，初步确定臭牡
丹总黄酮的浓度范围。复苏 HepG2 细胞株，传代，待细胞生
长稳定后，取指数生长期细胞，以 1 × 105 /mL，接种于96 孔
培养板中，每孔体积为 100μL，常规培养 24h细胞贴壁后，吸
弃上清，分别加入浓度为 0. 025、0. 25、2. 5、25、250μg /mL 的
臭牡丹总黄酮培养液处理细胞，另设培养液对照。继续培
养，于 48h后，取出培养板，于倒置显微镜下对细胞的生长状
态进行观察，和空白对照组进行比较观察有无差别。轻轻
吸弃上清，每孔加入 500μg /ml MTT 100μL，37℃静止避光培
养 4h后，吸弃上清，每孔加入 150μL DMSO。于恒温摇床中
震荡 10min，使沉淀结晶完全溶解，设置酶标仪 492nm波长，
检测每孔的吸光度 OD 值。根据吸光度计算不同浓度的臭
牡丹总黄酮对肝癌细胞的增殖抑制率。并用中效分析软件
计算臭牡丹总黄酮对肝癌细胞 48h 的半数抑制浓度
(IC50)。实验重复 3 次。增殖抑制率 IＲ(%)= ［(对照组
OD值 －药物处理组 OD 值)/(对照组 OD 值 －本底对照组
OD值)］× 100%。
2. 5 统计学方法 采用 SPSS 19. 0 统计软件。计量样本采
用 t检验比较，不符合正态分布的样本采用秩和检验;计数
样本采用秩和检验，构成比之间比较，用 2 检验，检验水平
P ＜ 0. 05。
3 实验结果
3. 1 臭牡丹总黄酮对肝癌细胞 HepG2 形态的影响 加药
培养 48h 后，倒置显微镜下观察可见，正常对照组细胞呈梭
形，贴壁生长良好，密集生长，成集落性，仅少许细胞脱落，
胞浆清澈，浆内无透明颗粒，细胞核大，隐约可见核仁。用
药后，随臭牡丹总黄酮剂量的增加，细胞形态发生改变，部
分细胞变小变圆，胞浆量减少，浆内可见大量透明颗粒，细胞
呈单个生长状态，贴壁能力下降，脱落增多，部分细胞呈悬
浮生长。(见图 1)
A. 空白对照组 B. 低剂量臭牡丹总黄酮
C. 中剂量臭牡丹总黄酮 D. 高剂量臭牡丹总黄酮
E. 阳性对照组
图 1 不同剂量臭牡丹总黄酮对 HepG2 细胞形态的影响
3. 2 臭牡丹总黄酮抑制肝癌细胞 HepG2 增殖作用 MTT
实验结果显示，药物臭牡丹总黄酮加药培养干预 48h 后，不
同剂量的臭牡丹总黄酮对 HepG2 细胞生长均有一定的抑制
作用，且随药物剂量的增加，抑制作用逐渐增强，呈药物剂
量依赖性，而对照组细胞生长良好。各剂量臭牡丹总黄酮
与对照组比较差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05)，提示臭牡丹
总黄酮有抑制肝癌细胞 HepG2 增殖的作用。当臭牡丹总黄
酮浓度为 20μg /mL，作用时间为 48h时，对 HepG2 细胞的抑
制接近半数抑制率。(见表 1、图 2 )
表 1 臭牡丹总黄酮对肝癌 HepG2
细胞生长抑制率的影响(x ± s)
组别 浓度(μg /mL) OD值 细胞生长抑制率(%)
空白对照 － 0. 428 ± 0. 031 －
总黄酮浓度 0. 025 0. 404 ± 0. 089 5. 55 ± 2. 12
0. 25 0. 374 ± 0. 017a 12. 73 ± 3. 19a
25 0. 365 ± 0. 019a 14. 84 ± 4. 12a
25 0. 161 ± 0. 015b 62. 44 ± 7. 32b
250 0. 099 ± 0. 010b 76. 81 ± 2. 06b
注:与空白对照组比较，ap ＜ 0. 05，bP ＜ 0. 01。
·761·第 4 期 胡 琦，朱克俭，谭小宁，等:臭牡丹总黄酮对人肝癌 HepG2 细胞增殖作用的实验研究
书蒿白伤湿气雾剂对大鼠佐剂性关节炎的效果观察
翦林宏，肖梅英，李勇敏
(湖南省中医药研究院，湖南 长沙，410006)
［摘要］ 目的:观察蒿白伤湿气雾剂治疗大鼠佐剂性关节炎的效果。方法:将 60 只 SD 雄性大鼠随机分为空白对照组，
模型对照组，风湿跌打组及蒿白伤湿气雾剂低、中、高剂量组，对除空白组外的其余组大鼠左、右后趾皮下注射弗氏完全佐剂
致炎，致炎后分别将治疗药物涂于足部与腹部，连续 27d，观察各组大鼠继发性炎症，测肿胀率。结果:蒿白伤湿气雾剂能明显
改善佐剂性关节炎大鼠耳部红斑、尾部结节发生率及严重程度，对佐剂性关节炎大鼠继发性病变有一定的改善作用;能降低
佐剂性关节炎大鼠左右后足趾肿胀率，对佐剂性关节炎大鼠关节病变有较好的治疗作用。结论:蒿白伤湿气雾剂对大鼠佐剂
性关节炎有较好的防治作用。
［关键词］ 蒿白伤湿气雾剂;佐剂性关节炎;继发性炎症;肿胀率;实验研究
［中图分类号］Ｒ285. 5 ［文献标识码］A ［文章编号］1003 － 7705(2015)04 － 0168 － 03
第一作者:翦林宏，男，高级实验师，研究方向:动物实验研究
Efficacy of Artemisia stelleriana Bess. dampness damage aerosol in rats with adjuvant arthritis
JIAN Lin － hong，XIAO Mei － ying，LI Yong － min
(Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410006，Hunan，China)
Abstract:Objective:To observe the efficacy of Artemisia stelleriana Bess. dampness damage aerosol in rats
with adjuvant arthritis. Methods:Sixty male Sprague － Dawley rats were randomly divided into blank control group，
model control group，wind － damp dieda group，and low －，medium －，and high － dose Artemisia stelleriana
Bess. dampness damage aerosol groups. Ｒats in all groups except the blank control group were subcutaneously injec-
ted with Freund＇s complete adjuvant into the right and left hind paws to induce inflammation. Afterwards，
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿
therapeutic
图 2 不同浓度臭牡丹总黄酮对 HepG2 细胞的抑制率
4 讨 论
肝癌的发病率居全球恶性肿瘤的第 5 位，病死率居第
3 位，严重威胁人类的健康［3 － 4］，其发生发展及转移与肝癌
细胞的异常增殖及分化密切相关，因而成为近年国内外抗
肿瘤科研攻关的重中之重，单味中药抗肿瘤的成分研究是
研究的热点之一。黄酮类化合物来源广泛，其抗肿瘤作用
已得到大量国内外的研究证实［5 － 7］，机制可能与抑制细胞增
殖、调控细胞周期，诱导细胞凋亡等有关［2］。本实验研究结
果表明，臭牡丹总黄酮对 HepG2 肝癌细胞有增殖抑制作用，
并呈药物剂量依赖性。结合对臭牡丹总黄酮影响 HepG2 肝
癌细胞的形态及数量，提示前者可能与其直接抑制或杀伤
细胞即细胞毒作用有关，其具体作用机制，还有待进一步
探讨。
参考文献
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(收稿日期:2015 － 03 － 24)
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2015 年 4 月 HUNAN JOUＲNAL OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
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