全 文 ：黄荆子木脂类化合物对 Hela细胞生长的影响＊
蔡艳林1 ,周应军 2 ,向红琳 3 ,曹建国3＊ ,谢婉玉 1＊
(1.南华大学附属一医院妇产科 , 湖南 衡阳　421001;2.中南大学药学院 , 湖南 长沙　410013;
3.湖南师范大学医学院 ,湖南 长沙　410006)
　　[摘要 ] 　目的:研究 4种黄荆子木脂类化合物(VBE-1, 2, 3, 4)抑制人宫颈癌 Hela细胞生长作用。方法:溴化标记尿嘧啶
(BrdU)掺入法测定细胞核酸合成;平皿集落形成法和软琼脂培养集落形成法检测细胞生长。结果:4种黄荆子木脂类化合物
对 Hela细胞的核酸合成具有显著抑制作用 ,呈浓度依赖性;其中 VBE-3的 BrdU掺入抑制作用最强 , IC50是 0.93μg/mL。 4种
黄荆子木脂类化合物明显抑制 Hela细胞的集落形成能力 , VBE-3的效价强度最大 , 平皿集落形成法检测的 IC50为 0.13μg/
mL;软琼脂培养集落形成法检测的 IC50为 0.57μg/mL。结论:黄荆子木脂类化合物具有抑制人宫颈癌 Hela细胞生长作用。
[关键词 ] 　宫颈癌;黄荆子;黄荆子木脂类;治疗作用
[中图分类号 ] R737.9　　　[文献标识码 ] A　　　[文章编号 ] 1673-016x(2008)01-0024-05
EffectofLignansfromtheAcetoacetateExtractofVitexNegundo
SeedontheGrowthofHumanCervicalCancerHelaCelLine
CAIYan-lin1 , ZHOUYing-jun2 , XIANGHong-lin3 , CAOJian-guo3 , XIEWang-yu1
(1.FirstAfiliatedHospital, NahuaUniversity, Hengyang421001, China;
2.ColegeofPharmacy, CentralSouthUniversity, Changsha, 410013, China;
3.ColegeofMedicine, HunanNormalUniversity, Changsha, 410006, China)
[ Abstract] Objective　ToinvestigatetheinhibitionofgrowthinhumancervicalcancerHelacelsby4 spe-
ciesoflignansfromtheacetoacetateextractofofVitexnegundoseed(VBE-1, 2, 3 , 4).Methods　 Nucleicacid
synthesisofHelacelswasdeterminedbyBrdUincorporateassay.ThegrowthofHelacelswasdetectedusingthe
platecolonyformationmethodandthecolonyformationmethodinsoftagar.Results　4speciesoflignansfromthe
acetoacetateextractofVitexnegundoseedsignificantlyinhibitednucleicacidsynthesisofHelacels, aconcentra-
tion-dependentmanner;andVBE-3wasthemostefective, itsIC50 was0.93μg/mL.Theyalsosignificantlyinhibi-
tedthegrowthofHelacels, aconcentration-dependentmanner;andVBE-3wasthemostpotency, anditsIC50 was
0.13μg/mLintheplatecolonyformationassay, andwas0.57μg/mLinthecolonyformationassayinsoftagar.
Conclusion　4speciesoflignansfromtheacetoacetateextractofVitexnegundoseedinhibitesthegrowthofhuman
cervicalcancerHelacels.
[ Keywords] humancervicalcancer;Vitexnegundoseed;lignansfromtheacetoacetateextractofVitexne-
gundoseed;therapeuticaction
24
湖南师范大学学报(医学版)
JHunanNormalUniv(MedSci)　2008, 5(1)
＊ 收稿日期:2007-12-26
作者简介:蔡艳林(1978-),女 ,湖南益阳人 ,在职硕士研究生 ,南华大学附一医院妇产科 ,主治医生 ,研究方向:妇科肿瘤学。 Tel:86-
734-8287508
＊共同通讯作者:曹建国(1956-),男 ,湖南益阳人 ,教授 ,博士 ,硕士研究生导师 ,主要从事抗肿瘤药物筛选及分子机制研究。 E-mail:
caojianguo2005@yahoo.com.cn
＊通讯作者:谢婉玉(1956 -), 女 , 湖南衡阳人 , 教授 , 硕士研究生导师 , 南华大学附属一医院妇产科主任医师。 Tel:86 -734-
13807344199
　　新辅助化疗在宫颈癌治疗中越来越受到重视 ,
已被证实可提高生存率 , 改善预后。但现有化疗药
物的毒副作用较大 ,因此 ,寻找预防和治疗宫颈癌等
恶性肿瘤的药物仍是肿瘤防治研究的热点之一 。
黄荆(VitexnegundoL.)系一种被子植物马鞭草
科的牡荆属植物 ,分布于我国 20余省市 ,其中以秦
巴山区资源最为丰富 [ 1] 。具有清热解表 、利湿解
毒 、止咳平喘及缓解支气管痉挛的作用 [ 2] 。黄荆子
(Vitexnegundoseed.)为黄荆的果实 。生物活性实
验研究表明 ,黄荆子具有抗菌及抗氧化作用 [ 3, 4] , Di-
az等报道从黄荆中得到的黄酮类化合物如紫花牡
荆素 ,在生物活性测定中对肿瘤细胞显示广泛的细
胞毒作用[ 5] 。我们前期实验研究证实:黄荆子乙酸
乙酯提取物 (theacetoacetateextractofofVitexne-
gundoseed, EVn-50)具有抑制人乳腺癌 MCF-7细
胞增殖和抑制人乳腺癌 MCF-7裸鼠移植瘤生长作
用[ 6] 。有研究表明 ,黄荆子木脂类化合物具有显著
酪氨酸激酶抑制活性。我们采用现代天然植物化学
技术从黄荆子乙酸乙酯提取物中分级分离获得 4种
黄荆子木脂类化合物(VBE-1 , 2, 3, 4)。本文旨在探
讨该 4种黄荆子木脂类化合物对人宫颈癌 Hela细
胞生长的影响 。
1　材料与方法
1.1　细胞与细胞培养　人宫颈癌 Hela细胞购自中
国典型培养物保藏中心(中国武汉市)。用含 10%
小牛血清的 RPMI-1640培养基于 37℃、5%CO2混
合气体 、95%饱和湿度的培养箱内培养。取对数生
长期细胞用于实验 。
1.2　受试物与药品 　4种黄荆子木脂类化合物
(VBE-1, -2, 3, 4)由中南大学药学院提供 ,其性
状和化学名称见表 1。
表 1　4种黄荆子木脂类化合物的理化特性
代号 名称 性状 分子量
VBE-1 6-羟基-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)3-羟甲基-7-甲氧基-3,
4-二氢(3R, 4S)-2-醛基萘 黄色粉末 356
VBE-2 6-羟基-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)3-葡萄糖基氧甲基-7-甲氧基-3,
4-二氢(3R, 4S)-2-醛基萘 黄色粉末 518
VBE-3 6-羟基-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)3-羟甲基-5-甲氧基-3,
4-二氢(3R, 4S)-2-醛基萘 黄色粉末 354
VBE-4 6-羟基-4-(3, 4-二甲氧基苯基)3-羟甲基-5-甲氧基-3,
4-二氢(3R, 4S)-2-醛基萘 黄色粉末 370
　　紫杉醇(TAX)由北京四环医药科技股份有限
公司出品 ,规格:30mg/5mL,批号:0604131。
1.3　BrdU掺入法 　取对数生长期人宫颈癌 Hela
细胞 ,调节浓度为 2.0×105个细胞 /mL,每孔 0.1mL
接种于 96孔细胞培养板 ,加入不同浓度的黄荆子各
黄荆子木脂类化合物和紫杉醇(终浓度分别为 0.1 ,
0.3, 1.0, 3.0, 10.0μg/mL)空白对照组加入等量培
养基 ,溶媒对照组加入含 0.02%二甲基亚砜培养
基 ,每组 3孔 ,置 CO2培养箱中培养 24小时 。每孔
加入 20μLBrdU标记液(1∶2000),继续培养 24小
时 。吸去 96孔板中的液体 ,每孔加入 200μL的固
定液 , 室温孵育 30min, 再移去液体 , 每孔加入
100μL抗 -BrdU抗体(1∶200),室温孵育 1小时 。
加入 100μL洗涤缓冲液(1∶20), 3分钟 /次 , 洗涤 3
次 ,吸去液体 。每孔加入 100μL辣根过氧化物酶标
记的羊抗鼠 IgG二抗(1:500),室温孵育 30min, 3
分钟 /次 , 洗涤 3次 ,吸去液体 ,加入 100μL底物 ,暗
室室温孵育 15min。然后加入 100μL中止液 ,室温
孵育 15min, 用酶标仪以 490nm波长测定吸光度
(A)。按下式计算 BrdU掺入抑制率。掺入抑制率
(%)=[ 1-(处理组 A均数 /空白对照组 A均数)]
×100%。以上实验重复 2次。
1.4　平皿集落形成法 　取对数生长期人宫颈癌
Hela细胞 , 调节浓度为 0.4 ×103 个 /mL, 每孔
1.0mL接种于 24孔细胞培养板 ,加入不同浓度的各
黄荆子木脂类化合物和紫杉醇(终浓度为 0.1, 1.0,
10.0μg/mL),空白对照组加入等量培养基 ,溶媒对
照组加入含 0.02%二甲基亚砜培养基 ,每组 3孔 ,
置 CO2培养箱中培养 7天 。每孔加入甲醇 0.5mL
固定 15min,吉姆萨染色 10 ～ 30min。以细胞数大于
50个或直径大于 75μm为一个克隆 ,倒置显微镜下
计数每孔克隆数。按下式计算细胞克隆抑制率。克
25黄荆子木脂类化合物对 Hela细胞生长的影响　蔡艳林等
隆形成抑制率(%)=[ 1 -(处理组克隆均数 /空白
对照组克隆均数)] ×100%。以上实验重复 2次 。
1.5　软琼脂培养集落形成法　取 24孔细胞培养
板 ,每孔加入终浓度为 0.6%琼脂培养基 0.5mL,制
备底层琼脂;取对数生长期人宫颈癌 Hela细胞 ,调
节浓度为 3.0×103个 /mL,取细胞悬液 1.6mL, 加
入不同浓度的各黄荆子木脂类化合物和紫杉醇(终
浓度为 0.1, 1.0, 10.0μg/mL),空白对照组加入培
养基 , 溶媒对照组加入含 0.02%二甲基亚砜培养基
0.2mL,加入 3.0%琼脂液 0.2mL,制备上层培养体
系 2.0mL;立即用球形刻度吸管混匀 , 0.5mL/孔分
装 ,每组 3孔 ,接种于已铺底层琼脂的 24孔细胞培
养板中 ,培养 7天 。以细胞数大于 50个或直径大于
75μm为一个集落 ,倒置显微镜下计数每孔集落数 。
按下式计算细胞集落抑制率 。集落抑制率(%)=
[ 1-(处理组集落均数 /空白对照组集落均数)] ×
100%。以上实验重复 2次 。
1.6　数据处理　采用 Spsswindows13.0软件 One
WayANOVA方式行方差分析及两两比较 , P<0.05
为统计学意义显著标准 。
2　结果
2.1　黄荆子木脂类化合物对 Hela细胞核酸合成的影响
BrdU掺入法结果显示:4种黄荆子木脂类化合
物显著抑制人宫颈癌 Hela细胞核酸合成 ,呈浓度依
赖性(表 2)。
表 2　4种黄荆子木脂类化合物对人宫颈癌 Hela细胞核酸合成的影响(n=9, x±s)
组别 浓度(μg/mL) A490 IR(%) IC50(μg/mL)
Medium - 1.3930±0.0197 0.00
DMSO 0.02% 1.3850±0.0091 0.57
TAX 0.1 0.9775±0.0129a 29.18 0.45
0.3 0.6502±0.0051a 52.90
1 0.5702±0.0254a 58.69
3 0.4405±0.0136a 68.09
10 0.2582±0.0089a 81.30
EVn-50 0.1 0.9682±0.0186a 29.86 1.35
0.3 0.8822±0.0067a 36.09
1 0.7688±0.0092a 44.30
3 0.5677±0.0201a 58.87
10 0.4487±0.0470a 67.49
VBE-1 0.1 0.9492±0.0108a 31.23 2.05
0.3 0.8517±0.0370a 38.30
1 0.7692±0.0173a 44.28
3 0.6752±0.0051a 51.09
10 0.5293 0.0114a 61.65
VBE-2 0.1 1.2740±0.0823a 8.54 3.68
0.3 0.9363±0.0186a 32.78
1 0.8365±0.0150a 39.95
3 0.7368±0.0206a 47.10
10 0.6072±0.0158a 56.41
VBE-3 0.1 0.9722±0.0119a 30.21 0.93
0.3 0.8755±0.0195a 37.15
1 0.7532±0.0103a 45.93
3 0.5405±0.0214a 61.20
10 0.3253±0.0516a 76.65
VBE-4 0.1 1.1667±0.0720a 16.25 4.55
0.3 0.9657±0.0140a 30.68
1 0.8802±0.0108a 36.81
3 0.7267±0.0172a 47.83
10 0.6347±0.0149a 54.44
　　a:与空白对照组比较 , P<0.001
26 湖南师范大学学报(医学版), 2008, 5(1)
2.2　黄荆子木脂类化合物对 Hela细胞锚定依赖性
生长的影响
平皿集落形成法结果表明:4种黄荆子木脂类
化合物对人宫颈癌 Hela细胞锚定依赖性生长能力
具有明显抑制作用 ,呈浓度依赖性(表 3)。
2.3　黄荆子木脂类化合物对 Hela细胞集落形成能
力的影响
软琼脂培养集落形成法结果证实:4种黄荆子
木脂类化合物具有抑制人宫颈癌 Hela细胞集落形
成能力作用 ,呈浓度依赖性(表 4)。
表 3　4种黄荆子木脂类化合物对人宫颈癌 Hela生长的影响(n=9, x±s)
药物 浓度(μg/mL) 集落数 IR(%) IC50(μg/mL)
Medium - 81±6
DMSO 0.02% 78±9 4.09
TAX 0.1 37±3a 54.51 0.09
1 17±2a 78.28
10 7±2a 91.60
EVn-50 0.1 49±5a 39.75 0.27
1 29±2a 63.32
10 16±3a 80.12
VBE-1 0.1 59±8a 26.64 1.13
1 44±4a 45.90
10 21±4a 73.36
VBE-2 0.1 69±4b 14.96 11.41
1 57±2a 29.10
10 41±3a 48.77
VBE-3 0.1 43±5a 47.13 0.13
1 26±3a 68.03
10 14±2a 82.38
VBE-4 0.1 69±34b 15.16 10.07
1 58±2a 27.87
10 40±5a 50.82
　　a:与空白对照组比较 , P<0.001;b:与空白对照组比较 , P<0.01
表 4　4种黄荆子木脂类化合物对 Hela细胞集落形成能力的影响(n=9, x±s)
药物 浓度(μg/mL) 集落数 IR(%) IC50(μg/mL)
Medium - 97±3 0
DMSO 0.02% 92±7 4.98
TAX 0.1 57±4a 41.00 0.27
1 37±2a 61.23
10 16±3a 83.19
EVn-50 0.1 68±5a 29.17 0.84
1 46±4a 52.32
10 26±3a 73.24
VBE-1 0.1 81±7a 15.95 4.20
1 64±4a 33.62
10 38±4a 60.04
VBE-2 0.1 89±5b 7.55 14.48
1 78±3a 19.55
10 52±4a 45.97
VBE-3 0.1 63±6a 34.99 0.57
1 45±2a 53.17
10 24±2a 75.13
VBE-4 0.1 88±3b 8.92 25.07
1 72±9a 25.56
10 60±5a 38.25
　　a:与空白对照组比较 , P<0.001;b:与空白对照组比较 , P<0.01
27黄荆子木脂类化合物对 Hela细胞生长的影响　蔡艳林等
3　讨论
本文的目的是验证黄荆子木脂类化合物为黄荆
子抗人宫颈癌的活性成分的工作假设 。我们运用现
代天然植物化学提取和分离技术获得 4种黄荆子木
脂类化合物(VBE-1, 2, 3 , 4), 首先 ,采用 BrdU掺
入法测定结果显示:4种黄荆子木脂类化合物中
VBE-3对宫颈癌细胞核酸合成抑制作用最强 ,其
IC50为 0.93μg/mL。说明 VBE-3较黄荆子乙酸乙
酯提取物 EVn-50(IC50为 1.35μg/mL)具有更强的
抗肿瘤活性 。
为深入研究黄荆子木脂类化合物的体外抗肿瘤
作用 ,我们应用平皿集落形成法和软琼脂培养集落
形成法检测黄荆子木脂类化合物对人宫颈癌 Hela
细胞锚定依赖性生长能力和集落形成能力的影响 。
实验结果证实:4种黄荆子木脂类化合物显著抑制
Hela细胞锚定依赖性生长和集落形成 ,呈浓度依赖
性;其中 VBE-3的效价强度均高于黄荆子乙酸乙
酯提取物 EVn-50(平皿集落形成法的 IC50比较:
0.13μg/mLvs0.27μg/mL;软琼脂培养集落形成法
的 IC50比较:0.57μg/mLvs0.84μg/mL)。提示:黄
荆子有效部位即黄荆子乙酸乙酯提取物的主要活性
成分为黄荆子木脂类化合物 ,以 VBE-3的抗人宫
颈癌活性最高 。因此 ,本文的研究结果为人宫颈癌
治疗新药开发的先导物发现提供了实验依据 。
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