全 文 ：黄栌根内生真菌分离鉴定及
拮抗真菌筛选
王建美1 , 田呈明1 , 过颂新2 , 宋立洲3 , 贺 　伟1
(1.北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室 , 北京 100083;2.北京市林业
保护站 , 北京 100029;3.北京市香山公园管理处 , 北京 100093)
摘　要:采用常规分离法从不同地区健康黄栌根系中共分离得到 33 株内生真菌 , 其优势类群主要包括无孢
菌群 、腐质霉属 、青霉属等 ,而且不同地区黄栌的根系内生真菌种类和数量有一定差异。内生真菌对黄栌枯萎
病病原———大丽轮枝孢的拮抗试验结果表明:团炭角菌 、黑乌霉属 、假丝酵母属的菌株抑制作用较强 , 其它内
生真菌菌株对大丽轮枝孢均有不同程度的抑制作用。
关键词:内生真菌;大丽轮枝孢;拮抗真菌;黄栌
中图分类号:Q949.32;Q949.754.4　　　文献标识码:A　　　文章编号:1672-3538(2008)01-0035-05
Isolation and Screening of Endophytic Antifungal Fungi
from Cotinus coggygria Roots
WANG Jian-mei1 , TIAN Cheng-ming1＊＊ , GUO Song-xin2 , SONG Li-zhou3 , HE Wei1
(1.Key Laboratory for Silviculture and Conservation , Ministry of Education , Beijing Forestry University ,
Beijing 100083 , China;2.Beijing Forestry Protection Station , Beijing 100029 , China;3.Beijing
Xiangshan Park Management Office , Beijing 100093 , China)
Abstract:Endophytic fungi isolated from different places of healthy Cotinus coggygria roots with conven-
tional isolation method were surveyed.The results indicated that there were thirty-three strains of endo-
phytic fungi , the dominant species of which were Mycelia sterilia , Humicola and Penicillium.The quanti-
ty and species of healthy Cotinus coggygriaroots varied from places.Antagonistic activities of endophytic
fungi to Verticillium dahliae indicated that Xylaria hypoxylon strain and Memnoniella strains and Candi-
da strains had strong activity against Verticillium dahliae ,while other strains also had different degrees of
antagonism to the pathogen.
Key words:endophytic fungus;Verticillium dahliae;antagonistic fungus;Cotinus coggygria
　　黄栌(Cotinus coggygria Scop.)又称黄道栌 、黄
栌材 ,为灌木或小乔木 ,株高 3 ～ 5 m ,是漆树科黄
栌属植物 。黄栌入秋后叶变红色 ,可供观赏 ,在北
京广泛栽培于香山 、西山 、十三陵 、八达岭等景区 ,
世界闻名的香山红叶即为黄栌的秋叶。但是近年
来黄栌枯萎病发生严重 ,不仅破坏了红叶景观 ,而
且造成黄栌的大量枯死 ,成为严重影响北京城市
景观及生态环境建设的重要灾害。
内生菌生活在健康植物的茎干或叶片中 ,不
引起明显病害症状 ,它包括潜伏在植物体内的病

通讯作者:田呈明 , E-mai l:chengmt@bjfu.edu.cn
基金项目:国家“十一五”科技支撑项目(2006BAD08A10-03),北京市科技计划项目(D0705002040291),北京林业大学研究生自选课
题基金项目(OBJJ001),北京市教育委员会共建项目建设计划项目(JD100220648)
作者简介:王建美(1982-),女 ,硕士研究生 ,研究方向:森林病理学。
收稿日期:2007-10-10
　第 6卷第 1 期 菌　物　研　究 Vol.6 No.1　
　2008 年 3月 Journal　of　Fungal　Research Mar.2008　
原菌 ,但不包括菌根菌[ 1] 。近年来 ,植物内生真菌
的研究越来越受到重视 ,国内外已陆续报道了多
种树木内生菌的种类 、分布特征 ,并从中获得了具
有抗菌 、杀虫等活性物质的内生真菌 ,如脉孢菌
(Neurospora sp.)、木霉(Trichoderma sp.)、镰孢菌
(Fusarium sp.)等[ 2-3] 。关于黄栌内生真菌的研究
尚未见报道。本研究对北京 3个地区健康黄栌根
部内生真菌进行了分离 ,分析了内生菌的种类及
其分布特点 ,探讨了黄栌根部内生菌对黄栌枯萎
病菌的拮抗作用 ,对将黄栌根部内生真菌应用于
黄栌枯萎病的控制具有重要意义。
1　材料与方法
1.1　供试材料
在北京香山 、八达岭 、八大处 3处健康黄栌林
地选取黄栌根系 ,直径约为 1 cm。将所采样本分
别装入食品保鲜袋内 ,带回室内进行内生真菌分
离。
1.2　内生真菌的分离纯化
分离:采用组织分离法 。取高温灭菌的 PDA
培养基10 ～ 15 mL ,倒入直径 9 cm 的培养皿中 ,凝
固制成平板。将健康黄栌根剪成小段 ,剖皮 ,首先
经70%的乙醇消毒 1 min ,然后用 1%～ 3%次氯
酸钠消毒 3 ～ 5 min ,用无菌水冲洗 3 ～ 5次 ,每次
1 min 。放在灭菌的滤纸片上 ,待水吸干后移入
PDA培养基(含氯霉素 200 rag/L)上生长[ 4] 。
纯化:采用无菌接种针将刚长出的菌丝尖端
部分移植到新的培养基 ,呈三角形接在培养皿上 ,
直至得到纯化后的典型菌落 ,保存备用 。
1.3　内生真菌的鉴定
在PDA培养基上培养所得的真菌 ,对已产孢
的菌落直接挑取进行鉴定 ,通过水载片 ,观察孢子
梗 、孢子的形态 、大小 ,并进行摄影 。结合培养特
性及菌丝的特征 ,参照文献[ 5-6]进行鉴定 。
1.4　拮抗真菌的筛选
采用对峙培养法 ,测定内生菌对黄栌枯萎病
病原 Verticillium dahliae 的抑制生长效果 ,筛选出
抑制黄栌枯萎病的拮抗真菌。
制备 PDA平板培养基 ,分别接种内生真菌和
病原菌 ,于 25℃培养箱中黑暗培养 。待菌落长到
3 ～ 4 cm 时 ,用灭菌的打孔器切取同样大小的内
生真菌和病菌真菌菌丝块 ,置于同一平板培养基
上 ,两者间距2 ～ 3 cm 。在培养皿背面作好菌落名
称 、日期等标记。放置于黑暗培养箱中进行对峙
培养 , 7 d 后进行观察 。根据 2 种菌菌落生长速
度 、菌落之间有无抑菌带 、菌落前缘菌丝是否发生
稀疏和萎缩畸变等现象 ,判别内生真菌的拮抗作
用。每种处理 5个重复 ,同时设单独接种为对照。
放入恒温箱培养 ,约 7 d 后 ,分别测量菌落的纵横
半径(共 4个半径),并作标记 ,抑制作用采用被抑
制率 、相对抑菌效果[ 7]表示。
被抑制率=(单独培养菌落半径-菌落趋向
半径)/单独培养菌落半径×100%, 相对抑菌效
果=病原菌被抑制率/拮抗菌被抑制率 。
2　结果与分析
2.1　黄栌根系内生真菌的分离鉴定
对黄栌根系内生真菌进行分离 、鉴定 ,共得到
33个真菌菌株(表 1),其中 25个菌株经鉴定隶属
于 11个属(种),另外 8个菌株归为无孢菌群 。在
33个菌株中 ,香山地区内生真菌 11 株 ,八大处地
区10株 ,八达岭地区 12 株。其中大部分是半知
菌类真菌 ,个别属于子囊菌门真菌 。从表 1中可
看出 ,各地区中各属(种)分离频率不同 ,在所分离
菌落中占的比例也不同。在香山地区 ,无孢菌群
出现频率为 45.45%,其次为小毛克壳菌属 、青霉
属 、单头孢霉属 、发簇霉属 。而在八大处地区 ,腐
质霉属所占比例最大 ,其次为假丝酵母菌 、黄曲
霉 、发簇霉属 、粉红单端孢 、黑乌霉属 、无孢菌群
等。在八达岭地区 , 团炭角菌所占比例为
33.3%,其次为青霉属 、假丝酵母菌和无孢菌群。
无孢菌群包括 BHGJ6 , SBHJ2 , BDJH5等菌株。在
3个地区的黄栌根中都能分离到无孢菌群 ,因此
认为在黄栌根系内生真菌中 ,这类真菌分布较为
广泛 ,可能具有重要的作用。除八大处地区外 ,在
其它 2个地区的黄栌根中都有青霉属真菌存在 。
36 菌　物　研　究 2008 年
表 1　不同地方黄栌根系内生真菌种类与数量
Table 1.Species and quality of Cotinus coggygria root endophytic fungi from different places
内生真菌名称
Endophytic
fungus name
香山 Xiangshan
分离组织块数
Number of
isolated
organization
菌株数
Number of
strains
出现频率/%
Isolation
frequency
八大处 Badachu
分离组织块数
Number of
isolated
organization
菌株数
Number of
strains
出现频率/%
Isolation
f requency
八达岭 Badaling
分离组织块数
Number of
isolated
organization
菌株数
Number of
strains
出现频率/%
Isolation
frequency
绳状青霉
Penici llum
funiculosum
56 1 9.09 36 0 0 40 3 25.00
黄曲霉
Aspergillus
flavus
56 0 0 36 1 10.00 40 1 8.33
黑青霉
Penici llium
nigricans
56 1 9.09 36 0 0 40 1 8.33
团炭角菌
Xylaria
hypoxylon
56 0 0 36 0 0 40 4 33.33
腐质霉属
Humicola 56 0 0 36 3 30.00 40 0 0
假丝酵母菌属
Candida 56 0 0 36 2 20.00 40 1 8.33
发簇霉属
Sporothrix 56 1 9.09 36 1 10.00 40 0 0
粉红单端孢
Trichothecium
roseum
56 0 0 36 1 10.00 40 0 0
单头孢霉属
Monotospora 56 1 9.09 36 0 0 40 0 0
小毛克壳菌属
Chaetomella 56 2 18.18 36 0 0 40 0 0
黑乌霉属
Memnoniella 56 0 0 36 1 10.00 40 0 0
无孢菌群
Mycelia Sterilia 56 5 45.45 36 1 10.00 40 2 16.67
总和
Total
56 11 100.00 36 10 100.00 40 12 100.00
2.2　内生真菌对黄栌枯萎病病原的拮抗作用
内生真菌与病原真菌的对峙培养结果(表 2)
表明 ,大部分内生真菌对大丽轮枝孢有明显的拮
抗作用。其中团炭角菌菌株与病原菌的对峙培养
效果最明显 ,病原菌的被抑制率达到 95.88%,而
拮抗菌的被抑制率为 22.90%,相对抑菌效果达
到4.19 ,未产生拮抗带 ,但病原菌生长被完全抑
制 ,而团炭角菌接触到病原菌后继续覆盖生长 ,病
原菌萎缩 、菌丝塌陷 、菌落变小 ,不再生长。其次
是黑乌霉属对病原菌的抑制效果较明显 ,病原菌
被抑制率也达到 95.83%,拮抗菌的被抑制率为
43.75%,相对抑菌效果达到 2.19。两者相接触
时 ,病原菌不再继续生长 ,并且先前生长的部分菌
丝发生消解 ,病原菌生长明显受到抑制 ,无抑菌
带。其余抑菌效果由高到低依次为假丝酵母菌 、
发簇霉属 、绳状青霉 、单头孢霉属 、腐质霉属 、黄
曲霉 、黑青霉 ,虽抑制程度不同 ,但从相对抑菌效
果来看 ,都能不同程度地抑制病原菌生长 。其中
BHGJ6 , SBHJ2 , BDJH5有待进一步采用诱孢培养
基或分子生物学方法进行鉴定 。
由此可见 ,对于同一病原菌 ,不同内生真菌的
抑制作用表现形式不同 ,有的产生抑菌带抑制病
原菌生长 ,有的则与病菌接触溶解病菌菌丝而达
到抑制效果 ,或从空间和营养上与病原菌进行竞
争。
37　第 6卷　第 1 期 王健美等:黄栌根内生真菌分离鉴定及拮抗真菌筛选
表 2　内生真菌与大丽轮枝孢对峙培养
Table 2.Antagonistic cultivation between endophytic fungus and Verticillium dahliae
对峙培养菌株
Name of antagonistic
cultivation fungus
对峙培养菌落趋向半径/ cm
Colony radius
对照菌落半径/ cm
Radius of control
colony
被抑制率/ %
Inhibited rate
相对抑菌效果
Relat ive inhibitory
effect
接触时内生菌 、病原菌生长状况
Growth situation of both
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 0.10 2.43 95.88
团炭角菌
Xylaria hypoxylon 3.03 3.93 22.90
4.19 病原菌被覆盖 ,萎缩 、塌陷 ,不再继续生长;内生菌继续生长
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 0.10 2.40 95.83
黑乌霉属
Memnoniella 1.80 3.20 43.75
2.19 部分菌丝被消解 、萎缩 ,停止生长 ,无抑菌带;内生菌继续生长
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 1.07 2.60 58.85
假丝酵母属
Candida 1.27 1.97 35.50
1.67 接触时 ,病原菌不再生长 ,萎缩 、塌陷;内生菌略有生长
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 0.30 2.60 88.46
BHGJ6 1.53 4.07 62.40
1.42 病原菌不再生长 , 前缘菌丝消解 、萎缩;内生菌前缘菌丝略萎缩
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 0.80 2.77 71.11
发簇霉属
Sporothrix 0.80 2.50 68.00
1.05 病原菌明显萎缩塌陷 ,不再生长;内生菌前缘菌丝生长旺盛 ,有抑菌带
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 0.93 2.47 62.35
SBHJ2 1.30 3.60 63.89
0.98 病原菌前端菌丝生长旺盛 ,生长缓慢;内生菌前缘菌丝生长良好
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 1.33 2.37 43.88
绳状青霉
Penicillum funiculosum 0.80 1.93 58.55
0.75 达 0.2 cm 的抑菌带 ,病原菌前端菌丝萎缩;内生菌前端菌丝轻微塌陷
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 1.44 2.48 41.89
BDJH5 0.79 3.51 77.61
0.54 接触时病原菌菌丝萎缩 , 不再生长;内生菌也同时受到了抑制
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 1.69 2.61 35.33
单头孢霉属
Monotospora 0.92 2.78 66.77
0.53 病原菌前缘菌丝良好 ,速度减慢;内生菌前缘菌丝略萎缩塌陷
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 1.63 2.73 40.29
腐质霉属
Humicola 0.30 2.00 85.00
0.47 病原菌生长缓慢 , 前段菌丝良好;内生菌前端菌丝略萎缩塌陷
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 1.50 2.10 28.57
黄曲霉
Aspergi llus f lavus 1.60 4.47 64.21
0.44 病原菌生长减慢;内生菌生长迅速 ,很快把病原菌包围
大丽轮枝菌
Vertici llium dahliae 2.40 2.67 10.11
黑青霉
Penicillium nigricans 3.17 4.47 29.08
0.35 病原菌生长缓慢;内生菌生长迅速 ,很快将病原菌包围 ,病菌不再生长
3　讨　论
本研究采集北京香山 、八达岭 、八大处 3处健
康黄栌林地黄栌根系 ,对其内生真菌进行了分离
鉴定和筛选。结果显示 ,黄栌根系组织中存在丰
富的内生真菌 ,且不同地区内生真菌的种类 、数量
存在一定差异 ,其中团炭角菌 、黑乌霉属 、假丝酵
母属的菌株抑制作用较强 ,而其它内生菌菌株对
大丽轮枝孢均有不同程度的抑制作用。
不同地区所分离到内生真菌数量和种类存在
差异 ,可能是因为内生真菌类群的分布除了受宿
主植物种类的影响外 ,还受其它因素如地理位置 、
38 菌　物　研　究 2008 年
气候 、环境 、降雨量等外在条件的影响。这与王梅
霞等[ 8]研究结果相一致。从健康植物组织中分离
内生真菌的方法很多 ,其关键在于植物表面要完
全消毒 ,从而保证所分离的内生真菌都来源于植
物组织内部 。在本试验操作过程中 ,如果 3 ～ 4 d
内培养皿中没有菌落产生 ,则认为该材料消毒较
彻底 ,分离到的真菌即为内生真菌。在采集黄栌
根系样本时我们选择健康无发病的黄栌植株 。采
样后在最短时间内进行内生真菌的分离 ,以确保
黄栌根部内生真菌的生存活力及其条件无显著变
化。
本试验在对峙培养中发现 ,分离的团炭角菌
与大丽轮枝孢对峙培养中没有抑菌带出现 ,但生
长速度明显超过大丽轮枝孢 ,表现为快速生长 ,说
明其在空间和营养上对轮枝孢产生了竞争作用。
同时对峙试验也表明 ,根系中的内生真菌生物因
子对大丽轮枝菌生长表现出相互制约的关系 ,一
些内生真菌可明显地抑制其菌丝生长 ,表现为先
包围覆盖大丽轮枝孢菌落 ,从而使大丽轮枝孢菌
丝生长受到抑制 ,面积不再进一步扩展 ,最终全部
萎缩 ,有时两菌相交界面处能看到拮抗带。
通过对黄栌植株根系内生真菌初步分离鉴
定 ,结果以半知菌类真菌最多 ,其中大部分菌株不
同程度地抑制了病原菌生长 ,使其萎缩 、产生抑菌
带。由于黄栌枯萎病是一种从根部侵染的系统性
病害 ,因此明确黄栌根系内生真菌类群具有重要
的意义 ,但关于黄栌茎干和叶片内是否也存在着
抑制病原菌生长的内生真菌类群还有待进一步研
究。
参考文献:
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