全 文 ：第 41 卷第 3 期
2013 年 2 月
广 州 化 工
Guangzhou Chemical Industry
Vol. 41 No. 3
February. 2013
珙桐叶甲醇提取物的分离纯化
段荣华，石国荣
(湖南农业大学理学院，湖南 长沙 410128)
摘 要:以珙桐叶甲醇提取物为研究对象，比较 12 种吸附树脂:HZ － 801、HZ － 803、HZ － 816、DM － 4、XDA － 5、306、
D101、AB － 8、CAD － 40、D －5、YPR － I和聚酰胺对提取物中多酚和黄酮类化合物的吸附及解吸性能。结果表明:聚酰胺对珙桐
叶提取物的分离纯化效果最好，聚酰胺对珙桐叶甲醇提取物中多酚的吸附率和解吸率分别达到了 54. 85%和 46. 13%而对黄酮的吸
附率和解吸率则分别达到了 48. 92%和 52. 65%。
关键词:珙桐;吸附树脂;多酚;黄酮
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001 － 9677(2013)03 － 0077 － 04
作者简介:段荣华 (1982 －) ，男，硕士研究生，主要从事天然产物的提取分离研究。
Extraction and Purification of the Davidia involucrata
Baill Leaves Methanol Extracts
DUAN Rong － hua，SHI Guo － rong
(College of Science，Hunan Agricultural University，Hunan Changsha 410128，China)
Abstract:The adsorption and desorption performances of phenolics and flavonids in twelve different kinds of adsorp-
tion resins，including HZ －801，HZ －803，HZ －816，DM －4，XDA －5，306，D101，AB －8，CAD －40，D －5，YPR
－ I and polyamide，were compared，taking the methanol extract of Davidia involucrata leaves as the subject. The results
were that polyamide was the optimal adsorption resin for the separation and purification of the phenolics and flavonids in
the D. involucrata leaves methanol extracts. The static adsorption rate of phenolics in the methanol extracts was 54. 85%，
and the desorption rate was 46. 13%，while those for the flavonids was 48. 92% and 52. 65%，respectively.
Key words:Davidia involucrata Baill;adsorption resin;phenolics;flavonids
珙桐科植物包括喜树属、紫树属和珙桐属三属［1］。目前已
从该科植物喜树和紫树中分离得到了几十种具有抗癌、抗病毒
活性的天然化合物［2 － 7］，而对珙桐化学成分的研究较少。前期
实验结果表明:珙桐叶提取物具有较强的清除羟自由基和超氧
阴离子自由基的能力。笔者借鉴喜树属和紫树属的研究经验和
研究方法对珙桐叶提取物进行分离、纯化，对分离得到的天然
化合物进行分析，以期为珙桐叶的开发利用提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
珙桐叶:2009 年 10 月采集于张家界，洗净后置通风处自
然阴干，用粉碎机粉碎，置干燥器内保存。
甲醇、无水乙醇、氢氧化钠、芦丁、没食子酸、盐酸、无
水碳酸钠、钨酸钠、钼酸钠、Al(NO3)3·9H2O、磷酸、硫酸
锂、30%过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸、大孔吸附树脂:HZ －
801、HZ － 803、HZ － 816、DM － 4、XDA － 5、306、D101、AB
－ 8、CAD － 40、D －5、YPR － I、聚酰胺。试剂为国产分析纯，
用水为二次蒸馏水。
B2200S超声波清洗仪，必能信超声 (上海)有限公司;
AL204 电子天平，梅特勒 －托利多仪器有限公司;TDL80 － 2B
台式离心机，上海安亭科学仪器厂;KDM型调温电热套，山东
鄄城华鲁电热仪器有限公司;DLSB － 5 /10 型低温冷却液循环
泵，郑州长城科工贸有限公司;PE － 52AA 旋转蒸发仪，上海
亚荣生化仪器厂;SZ － 93 自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化
仪器厂;SHB －Ⅲ循环水式多用真空泵，郑洲长城科工贸有限
公司;VIS － 7220 型可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司;
FD － 1B冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司;HEQ － C
空气浴振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器厂;FW177 型中草药粉
碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;ShimadzuLC － 10ATvp 高效
液相色谱仪，日本岛津公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 珙桐叶有效成分的提取
称取珙桐叶干粉 40 g 于 250 mL 锥形瓶中，加入 8 倍量的
水，在 25 ℃，转速 100 r·min －1的条件下提取 3 次 (每次 8 h)
后，过滤。滤渣再用 8 倍量甲醇在相同条件下提取 3 次，合并
甲醇提取液，浓缩并冻干后，得 10. 04 g 珙桐叶甲醇提取物，
收率为 5. 01%。
1. 2. 2 多酚含量的测定
采用 Folin － Ciocalteu比色法［8］ (稍有改动)进行总多酚含
量的测定。取一定量样品溶液加于 10 mL 比色管中，加入
2. 00 mL 稀释 10 倍后的福林 －酚试剂，摇匀后再加入 3. 00 mL
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1 mol·L －1 Na2CO3溶液，用水定容。15 min后，在波长 765 nm
处以样品空白为参比测定吸光度 A。同时以没食子酸为对照
品，绘制标准曲线，由标准曲线回归方程计算样品中多酚含
量，以 mg没食子酸当量·mL －1表示。
1. 2. 3 黄酮含量的测定
采用硝酸铝法［9］测定总黄酮含量。于 10 mL 比色管中分别
加入一定量样品溶液、6. 00 mL无水乙醇和 0. 50 mL浓度为 5%
的 NaNO2，摇匀。5 min后，加入 1. 00 mL 10%的 Al(NO3)3 溶
液，静置 5 min，再加入 1. 00 mL 10%的 NaOH 溶液，以水定
容。15 min后，以样品空白为参比，在波长 510 nm处测定吸光
度 A。同时以芦丁为对照品，绘制标准曲线，由标准曲线回归
方程计算样品中黄酮含量，以 mg芦丁当量·mL －1表示。
1. 2. 4 羟自由基清除能力的测定
采用水杨酸法［10］测定样品溶液清除羟自由基的能力。在
10 mL 的试管中依次加入 0. 50 mL FeSO4 溶液(5 mmol·L
－1)，
5. 0 mL 不同浓度的样品溶液和 0. 50 mL H2O2(5 mmol·L
－1)，摇
匀，静置 10 min后，再加入 2. 0 mL水杨酸溶液(20 mmol·L －1)，
用水定容，摇匀。10 min后，在 510 nm波长处以试剂空白为参比
测定吸光度。按下式计算聚酰胺洗脱液对·OH的清除率 E:
E(%)=
A0 － A1
A0
× 100
式中:A0———未加样品溶液时的吸光度
A1———样品溶液的吸光度
1. 2. 5 珙桐叶甲醇提取物的初步纯化
(1)树脂的预处理
将 HZ － 801、HZ － 803、HZ － 816 和聚酰胺等 12 种吸附树
脂各取约 20 g用无水乙醇浸泡 24 h，用水洗至无醇味后，再用
5%NaOH浸泡 24 h，用水洗至中性。最后用 5%HCl浸泡 24 h，
用水洗至中性。
(2)静态吸附
称取 1 g处理过的树脂 (滤纸吸干)，加入珙桐叶甲醇提取物
溶液40. 00 mL(浓度为0. 207 mg·mL －1)，在25 ℃、60 r·min －1条
件下，静态吸附24 h后过滤，滤液用无水乙醇定容至50 mL。分别
按 1. 2. 2和 1. 2. 3所示方法测定滤液中总多酚和总黄酮含量。
Q(mg /g)=
(C0 － C1)× V
M
q1(%)=
(C0 － C1)
C0
× 100
式中:C0———上样液质量浓度，mg·mL
－1
C1———吸附液质量浓度，mg·mL
－1
V———溶液体积，mL
M———树脂质量，g
(3)树脂解吸附
在吸附饱和后的树脂中，加入20. 00 mL 90%乙醇溶液，在
25 ℃、60 r·min －1条件下进行静态解吸附。24 h后过滤，滤液
用水定容至 50 mL。分别按 1. 2. 2 和 1. 2. 3 测定滤液中总多酚
和总黄酮含量。
q2(%)=
C2
C0 － C1
× 100
式中:C0———上样液质量浓度，mg·mL
－1
C1———吸附液质量浓度，mg·mL
－1
C2———解吸液质量浓度 mg·mL
－1
(4)珙桐叶甲醇提取物的柱层析
装柱:取 200 mL已处理好的聚酰胺树脂，采用湿法装柱，
以 10%乙醇洗脱 24 h。
上样:浓度为 1. 35 mg·mL －1的珙桐叶甲醇提取物，以
1. 5 BV /h的速度湿法上样，总上样量为 1. 08 g。
洗脱、收集:依次用 10%、20%、30%、50%、70%、
90%、100%乙醇和 0. 5%NaOH溶液各 300 mL洗脱 (洗脱速度
1. 5 mL·min －1) ，每 100 mL 收集为一个样品，编号为洗脱液
B1、B2……B21。分别按照 1. 2. 3 和 1. 2. 4 所述方法测定各洗
脱液中总黄酮含量和清除羟自由基的能力。
分析:用 HPLC分析收集的洗脱液，将组成基本相同的洗
脱液分别合并浓缩成 25 mL，得样品为 1、2、3、4、5 和 6。按
1. 2. 2 和 1. 2. 3 所述方法测定样品液中的多酚和黄酮含量。并
按以下公式计算出总多酚和总黄酮含量提高倍数。
W =
C2
C1
式中:W———总多酚或总黄酮含量提高倍数
C1———上样液中总多酚或总黄酮含量
C2———样品溶液中的总多酚或总黄酮含量
2 结果与分析
2. 1 树脂对珙桐叶甲醇提取物的静态吸附和解吸附
12种吸附树脂对珙桐叶甲醇提取物中多酚和黄酮类化合物
的吸附率及解吸附率见表 1 和表 2。
表 1 12种吸附树脂对珙桐叶甲醇提取物中多酚的吸附率和解吸率
Table 1 The adsorption and desorption rate of twelve adsorption
resins for the phenolics in the methanol extract of D. involucrata
树脂型号 吸附率 /% 解析率 /%
HZ － 801 54. 73 3. 93
HZ － 803 59. 29 8. 37
HZ － 816 62. 03 4. 22
DM －4 65. 37 1. 59
XDA －5 63. 54 3. 61
306 62. 63 3. 25
AB － 8 55. 04 4. 93
D － 5 63. 54 2. 98
YPR － I 60. 51 1. 63
聚酰胺 54. 85 46. 13
表 2 12种吸附树脂对珙桐叶甲醇提取物中黄酮的吸附率和解吸率
Table 2 The adsorption and desorption rate of twelve adsorption
resins for the flavonids in the methanol extract of D. involucrata
树脂型号 吸附率 /% 解析率 /%
HZ － 801 60. 58 4. 02
HZ － 803 27. 52 6. 05
HZ － 816 14. 05 5. 24
DM －4 26. 3 6. 33
XDA －5 17. 73 6. 41
306 11. 6 6. 87
D101 27. 52 5. 46
AB － 8 27. 52 2. 65
CAD －40 17. 73 7. 26
D － 5 20. 18 3. 95
YPR － I 10. 38 8. 75
聚酰胺 48. 92 52. 65
第 41 卷第 3 期 段荣华等:珙桐叶甲醇提取物的分离纯化 79
从表 1 可以看出:DM －4 对珙桐叶甲醇提取物中多酚类化
合物的吸附率最高，为 65. 37%，D － 5 和 XDA － 5 其次，吸附
率均为 63. 54%，但相应的解吸率却较低，分别只有 1. 59%、
2. 98%和 3. 61%;而聚酰胺树脂的吸附率虽然只有 54. 85%，
但其解吸率却最高，达到了 46. 13%。
从表 2 可以看出:HZ － 801 对珙桐叶甲醇提取物中黄酮类
化合物的吸附率最高，为 60. 58%，聚酰胺的吸附率其次，为
48. 92%，但聚酰胺的解吸率比 HZ － 801 的 4. 02%高，达到了
52. 65%。
综合表 1 和表 2 可知:聚酰胺对珙桐叶甲醇提取物中多酚
和黄酮类化合物的吸附和解吸率都比较高，所以选用聚酰胺进
行珙桐叶甲醇提取物的柱层析分离。
2. 2 珙桐叶甲醇提取物的聚酰胺柱层析
2. 2. 1 聚酰胺柱洗脱液中黄酮含量
珙桐叶甲醇提取物经聚酰胺柱层析后，各洗脱液中的黄酮
含量见图 1。
图 1 珙桐叶甲醇提取物聚酰胺柱洗脱液中黄酮含量
Fig. 1 The flavonids content in the polyamide column elution
of methanol extract from D. involucrata Baill leaves
从图 1 可以看出:珙桐叶甲醇提取物经聚酰胺柱层析后，
B14 中黄酮含量最高，其次是 B13，B15 再次。说明 70%乙醇
同样是珙桐叶甲醇提取物中黄酮类物质的最佳洗脱剂。
2. 2. 2 聚酰胺柱洗脱液羟自由基清除能力
珙桐叶甲醇提取物经聚酰胺柱层析后，各洗脱液对羟自由
基的清除能力见表 3。
表 3 珙桐叶甲醇提取物聚酰胺柱洗脱液羟自由基清除能力
Table 3 The hydroxyl radical scavenging rate of the polyamide
column elution of methanol extract from D. involucrata leaves
洗脱液
编号
清除率
/%
洗脱液
编号
清除率
/%
洗脱液
编号
清除率
/%
洗脱液
编号
清除率
/%
B1 － B6 25. 19 B11 － B16 －
B2 18. 78 B7 31. 07 B12 － B17 －
B3 23. 06 B8 29. 20 B13 － B18 －
B4 3. 29 B9 27. 33 B14 － B19 －
B5 21. 19 B10 15. 40 B15 － B20 －
从表 3 可以看出:珙桐叶甲醇提取物经聚酰胺柱层析后，
30%乙醇洗脱液清除羟自由基的能力最强。
2. 2. 3 样品制备
1. 08 g 珙桐叶甲醇提取物经 200 mL聚酰胺树脂柱层析后，
各洗脱液在下述色谱操作条件下进行液相色谱分析，将色谱图
相似的洗脱液合并得样品 1 ～ 6。
(1)色谱操作条件:色谱柱 Shimadzu VP － ODS 柱，
1504. 6 mm id，5 μ;流动相:0. 01 ～ 5. 00 min，98% 甲醇;
11. 00 ～ 90. 00 min，65%甲醇;95. 00 ～ 100. 00 min，2%甲醇;
流速 1. 00 mL·min －1，柱温 35 ℃，检测波长 225 nm，进样量:
20 μL。
(2)样品制备 根据上述梯度分析洗脱结果，将洗脱液 1 ～
3 合并为样品 1，洗脱液 4 ～ 9 合并为样品 2，洗脱液 10 ～ 12 合
并为样品 3，洗脱液 13 ～ 15 合并为样品 4，洗脱液 16 ～ 18 合并
为样品 5，洗脱液 19 ～ 21 合并为样品 6。
2. 2. 4 样品的 HPLC分析
(1)色谱操作条件
色谱柱:Shimadzu VP － ODS 柱，1504. 6 mm id，5 μ;流动
相:甲醇∶水 = 50∶50(V∶V) ，流速:0. 8 mL·min －1，柱温
35 ℃;检测波长 225 nm，进样量:20 μL。
(2)样品分析结果
样品 1 ～ 6 号的 HPLC分析结果见图 1 ～图 6。
由图 1 ～图 6 可以看出:珙桐叶甲醇提取物经过聚酰胺柱
层析后，保留时间为 3. 061 min 的组分在 10%乙醇洗脱液中含
量最高，保留时间为 3. 083 min 和 3. 189 min 的组分在 20% ～
30%乙醇洗脱液中含量最高，保留时间为 1. 771 min 的组分在
90% ～100%乙醇洗脱液中含量最高，而保留时间为 3. 253 min
和 3. 488 min的组分则集中在 0. 5% NaOH洗脱液中。可见，聚
酰胺对珙桐叶甲醇提取物的分离效果明显。
图 1 样品 1 稀释 10 后的高效液相色谱图
Fig. 1 The HPLC chromatogram of sample 1 diluted by 10 － fold
图 2 样品 2 稀释 10 后的高效液相色谱图
Fig. 2 The HPLC chromatogram of sample 2 diluted by 10 － fold
图 3 样品 3 稀释 20 后的高效液相色谱图
Fig. 3 The HPLC chromatogram of sample 3 diluted by 20 － fold
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图 4 样品 4 稀释 20 后的高效液相色谱图
Fig. 4 The HPLC chromatogram of sample 4 diluted by 20 － fold
图 5 样品 5 稀释 20 后的高效液相色谱图
Fig. 5 The HPLC chromatogram of sample 5 diluted by 20 － fold
图 6 样品 6 稀释 10 后的高效液相色谱图
Fig. 6 The HPLC chromatogram of sample 6 diluted by 10 － fold
2. 2. 5 样品中总多酚和总黄酮含量测定
经过聚酰胺柱层析后，各样品溶液中总多酚和总黄酮含量
及提高倍数见表 4。
由表 4 可以看出:珙桐叶甲醇提取物经过聚酰胺柱层析
后，50%乙醇洗脱液中总多酚含量最高，比上样液提高了
143. 2 倍，20% ～30%乙醇洗脱液中总多酚含量其次，比上样
液提高了 58. 7 倍;90% ～100%乙醇洗脱液中总黄酮含量最高，
比上样液提高了 3. 5 倍，70%乙醇洗脱液中总黄酮含量其次，
比上样液提高了 3. 3 倍。
表 4 样品溶液总多酚和总黄酮含量
Table 4 The contents of phenolics and flavonoids in the samples
多酚含量
/(mg·mL －1)
多酚含量
提高倍数
黄酮含量
/(mg·mL －1)
黄酮含量
提高倍数
样品 1 0. 0214 1. 8 0. 1587 1. 3
样品 2 0. 7111 58. 7 0. 1953 1. 6
样品 3 1. 736 143. 2 0. 2564 2. 1
样品 4 0. 0494 4. 1 0. 4029 3. 3
样品 5 0. 0214 1. 8 0. 4237 3. 5
样品 6 － － 0. 1099 0. 9
上样液 0. 0121 1 0. 01221 1
3 结 论
实验结果表明:聚酰胺对甲醇提取物中多酚的吸附率和解
吸率分别为 54. 85%和 46. 13%，对黄酮的吸附率和解吸率则分
别为 48. 92%和 52. 65%，是 12 种树脂中分离纯化珙桐叶甲醇
提取物多酚和黄酮效果最为理想的树脂。聚酰胺柱对珙桐叶甲
醇提取物也具有明显的纯化效果。
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