全 文 ：四 川林业科技 1 9 5 8; 9 ( 2)
书,通
/
油 桐根 腐 病 致病 菌
一一腐皮镰抱醋酶同工酶研究 ’
陈守常 肖育贵
(四 川省林业科学研究所 )
摘
采用 装丙烯酞胺凝胶 屯泳技术对 油桐根腐病时致病菌与国 内 已知腐皮镰袍 8 个、
专化型菌株的醋晦同二醉进行 了侧 定和分析 , 进一 步证明 了油桐根腐病致病菌为腐
皮镰袍一新的专化型 , 为油桐腐皮镰艳 ( F u s a r i o m 5 0 1: n i 丈人1二 r t . ) S a e e . f . s F . : : -
l e o r i t i d i s C h e n e t X i a o ) 的命名提 供 了生转 化 学依据 。
关键词 油桐腐皮镰抱 醋酶同工酶
近 20 年来 , 由于分子生物学发展迅速 , 认为同工酶是生物休的遗传标志 , 它可反映 D N人
上一个碱基的微小变化 , 从而以此作为真菌分类的辅助手段 。 当今由宏观 向 微 观 的深化进
展 , 从分子生物学角度去探索简便而有效 的鉴别菌种的方法 , 已为国内外学者所高度重视 ,
并对作物病害和真菌进行了研究 。
1 9 6 6年 , B o ot h t7 1 , 1 9 6 9年 , G行 n n 〔 “ J 曾提出应用凝胶电泳分析菌体同工酶语来区别
镰泡菌种 。 随后 , H a l l 〔 g 了 ( x 9 6 7年 ) 研究了少数腐皮镰抱 同 二泛厂海, 入丁e y e r 仁’ 。 ’ ( r 9 6 9年 )
对尖镰抱两个专化型炸了酩海同工酶分祈 ,` 了。 年 代以来 , 州网对棉枯姜病菌 〔` 〕 , 麦类赤霉
菌 〔 5 ’ “ 〕 同工酶开砚 了研究 。 对应用凝胶 电泳技 术分 沂病皮镰袍 一专化型的酷脑 同 _爪沁 , 尚未
见报道 。
在 1 9 8旦一 198 6年对油桐不如汀病致病菌的形态学 , 店芥性伏研究和 专化性寄主杭物扮种 i J让
验的基础上 〔 ` 3 , 1 98 7年对油桐根腐病致病菌缭晦同工酶进行 一」` 、玩肢电 沉、 测定 , 为进一步鉴
定提供 一了科学依据 。
试 材 和 方 法
l
、 供试菌株 : 油柯根腐病菌 ( F二 ar ilt m s o h 、 n i 四川 , 【9 8 5 年 5 月川 日从万具病株
义文稿策南京 不 宝大学井素轩退行受审只 , 在 价 脸卜, , 得夕工乖片高了厂厂程师指导和江玲目志欲劲 , 布比译 致诀侣
2 期 油桐根腐病致病菌一腐皮镰抱醋酶同工酶的研究
上分离 )、 一甘薯根腐病菌株 ( F . sl o an if. sp.b t at a as )、 黄瓜根腐病菌 株 ( F . sl o an i. f
sp
.
C u C ur b it a e )
、 蚕豆根腐病菌株 ( F . s ol n a if. sp. f ab a e )、 菜豆根腐病菌株 ( F。 50 -
l n a if
.
sp
.
ph a s e ol i )
、 豌豆根腐病菌株( F . s ol an if. sp. p i s i )、 桑芽枯病 菌 株 ( F . 0 5一
an if
.
sp
.
m or i )
、 刺槐枝枯病菌株 ( F . s ol n a if. sp.r ob in i a e )和马铃薯根腐病 菌 株 ( F。
:
l on a if
.
sp
.
e u mr at i )
。 _上列 8 个国 内发生的专化型菌株分别由南京林业大学张素轩教授 、
云南农业大学阮兴业教授提供 。
2
。 菌液培养 :将 供 试 菌 株分别在新鲜的 D P A斜面培养基上 , 25 ℃恒温条件下培养
5 天活化 。 经活化的菌株转入备制的 1 肠 马铃薯蔗糖液体 培 养 基 中 (马铃薯 10 克 , 蔗糖
10 克 , 蒸馏 水 10 0。毫升 。 在 25 ℃恒温条件下振荡培养 (每天振荡 4 小时 ) 。
3
. 酶液制备 : 将上述振荡培养 8 天的供试菌液移至离心管 , 以 2 0 0 0转 /分离心 10 分钟 ,
收集后经蒸馏漂洗两次 , 用滤纸吸千水分 , 菌体称重后置于 O一 4 ℃暂存备用 。 每一菌株称
取菌体 4 克 , 加入蒸馏水 2 毫升和少许金刚沙 ( 1 8 0。目 ) , 在 水浴中研磨匀浆 , 0 ℃下离心
10 分钟 ( 1 2 0 0转 /分 ) , 取上清液以备 电泳上样用 。
4
。 电泳分离 : 采用聚丙烯酞胺凝胶垂直平板电泳法 〔“ ` “ 〕 , p H连续缓冲凝胶的三经甲
基氨基甲烷 ( T r i ) s一柠檬酸缓冲系统 。 电极缓冲液为 T : is 一甘氨酸 , p H 8 . 7 。 分离胶浓度
10 肠 p H 8 . 9 ; 交联度 2 % , 浓缩胶浓度 4 呱 , p H 6 . 3 。 电泳前 , 在上槽缓冲液中加入 l 滴 0 . 2帕
嗅酚兰作为指示剂 。 点样后 (每样品 10 。 微升 ) , 电泳在 O一 4 ℃ 下进行 。 电 流 强度 10 毫
安 /厘米 , 随后加大电流为 25 毫安 / 2 5 0伏 。 电泳在 4 一 5 小时完成 。
5
。 染色定位 : 将胶板取出 , 缓冲液漂洗后 , 置于染液中 , 在 30 ℃下染色 。 酶带显示清
晰后 , 流水冲洗 (约半小时 ) , 将所有样品酶带出现的位置 , 按向正极泳动的速度顺序编号
( E
: ,
E
: …… ) , 求算酶带相对迁移率 ( R f) 。
结 果 和 分 析
对油桐根腐病致病株和 8 个专化型菌株进行聚丙烯酸胺凝胶 电泳分析 。 经取样 4 次 , 电
泳和染色后获得图 1 酶谱 。
测定表明 , 各供试菌株的醋酶同工酶谱各有其特异的醋酶图形 , 它们之间差异显著而橙
定 。 酶带差异性表现在酶带的数 目 , 颜色的深浅和宽度 (图 1 ) 。 马铃薯干腐病菌株 、 桑腐皮
镰抱 、 刺槐腐皮镰抱和蚕豆腐皮镰抱酶带 4 条 , 甘薯腐皮镰抱 、 黄瓜腐皮镰抱 、 菜豆腐皮镰
抱酶带 3 条 , 豌豆腐皮镰抱 2 条 , 而油桐根腐病致病菌株具有 3 条酶带 , 但谱带特征不同于
8 个供试菌株 。
从表 1 看出 , 油桐根腐病致病菌醋酶同工酶的相对迁移率 R f 值显著不同于供试 的腐皮
镰抱 8 个专化型菌株 。 这是因各酶蛋 白分子所携带的电荷和分子量大小决定的 。
上述醋酶同工酶测定分析结果 , 进一步证明了油桐根腐病的致病菌是腐皮镰抱的 1个新
专化型 。
四 川 林 业 科 技 9卷
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表 l 油桐根腐病致病 菌与供试菌株醋酶同工酶 电泳带的相对迁移率 R f 值 )
电泳带序号
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R f 值 i E , , E : E 。 E ` E 。 i E 。 E , { E 。 , E 。 {E , 。 E , : 一E , : IE t :
酶带数
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洪试菌株 \ 、
奋铃薯干腐病菌株 {一 : 一 }一 0 . 51 一
:袭芽枯病菌株
刊槐枝枯病菌株
〕育瓜根腐病菌株
菜豆根腐病菌株
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2期 油桐根腐病致病菌一腐皮镰抱醋酶同工酶的研究
鉴 定 结 语
对形态特征 、 培养性状研究和专化性寄主植物接种试验 , 腐皮镰抱 8 个专化型菌株接种
油桐试验表明 , 油桐根腐病致病菌是腐皮镰抱的一新专化型 。
在此基础上 , 又对油侗根腐病致病菌与 8 个专化型菌株进行了聚丙烯酞 胺 凝 胶 电泳分
析 。 分析 比较表明 , 在醋酶同工酶的谱带 、 特征和相对迁移率上 , 、 油桐根腐病的致病菌均异
于供试专化型菌株 。
为此 , 将油桐根腐病致病菌鉴定为世界上 已报道的腐皮镰抱 18 个专化型外又一新的专化
型 , 命名为油桐腐 皮 镰 抱 ( F u s a r i u m s o l a n i ( M a r t . ) S a e e . f . s p . a l e u r i t i d i s C h e n e t
X ia o f
.
sP
.
n o v .
)
, 在油桐上尚无记载 , 属于首次报道 。
本试验运用醋酶同工酶测定油桐根腐病致病菌的专化型 , 效果明显 。 可 以认为 , 应用聚
丙烯酸胺凝胶 电泳技术作为腐皮镰抱专化型 分类的辅助手段 , 具有实践的意义 。
参 考 文 献
〔 l 〕 陈宁常 , 肖育贵 , 1 9 8 8 , 四川林业科技 , 9 ( 2 ) : l 一 7 。
〔 2 〕 吴 少伯 , 2 9 7 9 , 植物生理学通讯 , 1 : 3 0一 3 3 。
( 3 ) 莽克强 , 1 9 7 5 , 聚丙 烯耽胺凝胶 电泳 , 科学出版社 。
〔 4 〕 吕金殿等 , 1 9 8 2 , 植物病理学报 , 1 2 ( 2 ) : 4 1一 4 5 。
〔 5 〕 叶华智等 , 1 9 5 5 , 植物病理学报 , 1 5 ( 4 ) : 5 7一 9 3 。
〔 6 〕 李清铣等 , 1 9 5 5 , 植物病理学报 , 1 5 ( 4 ) : 2 1 7一 2 2 2 。
〔 7 〕 B o o t h , C . 1 9 6 6 , J . G e n . M i e r o b i a 。 连2 : 租一孤 。
〔 8 〕 G l y n n , A . N . e t a l , 1 9 6 9 , C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y , 4 7 ( 4 ) 1 8 2 5一
18 3 1 0
〔 9 〕 H a l l , R . 19 6 7 , A u s t r a l J . B i o l . S e i . Z o : 4 1 9一 4 2 5 。
〔 20 〕 M e y e r , J . A . 1 9 6 9 , P h 丁 t o p a t h . 5 9 : 1 4 0 4一 1 4 1 1 。