全 文 ：第 20卷　第 1 期 　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　 Vol.20　No.1
2005年　2月 　　　　　　　　　　Journal of Yunnan Agricultural University　　　　　 Feb.2005
　收稿日期:2004-11-09　　　　　＊＊通讯作者
＊基金项目:云南省科技攻关项目(2000A3-01)
　作者简介:李霞(1978-),女 ,河南开封人 ,硕士研究生 , 主要从事香荚兰根腐病的研究工作。
香荚兰根腐病原菌酯酶同工酶分析＊
李　霞 ,陈丽珊 ,王云月＊＊
(云南农业大学 ,云南省植物病理重点实验室 , 云南 昆明 650201)
摘要:香荚兰根腐病是影响香荚兰生产的一个制约因素 ,其病原菌为尖孢镰刀菌和茄类镰刀菌。试验应用同工
酶电泳技术对引起香荚兰根腐病致病性不同的 12个菌株(其中尖镰孢 9 株 , 茄镰孢 3 株)进行酯酶同工酶谱分
析。结果发现酯酶同工酶的活性区主要集中在中间带区和快带区。对 12 个菌株的酯酶同工酶带的 Rf 值进行
UPGMA聚类分析 , 发现在相似性 0.71的水平上 ,能将尖孢镰刀菌和茄类镰刀菌区分;在相似性 0.86 的水平上 ,
能将用传统的致病性鉴定方法鉴定出的强 、中 、弱致病菌株及非致病菌株分开。试验的目的在于寻找与致病性/
非致病性相关的同工酶标记。
关键词:香荚兰;尖镰孢;茄镰孢;酯酶同工酶
中图分类号:S 435.73　　文献标识码:A　　文章编号:1004-390X(2005)01-0027-04
Isozyme Analysis of the Causal Reagents of Vanilla Root-rot
LI Xia ,CHEN Li-shan ,WANG Yun-yue
(Key Laboratory for Plant Patholoy of Yunnan Province , Y A U , Kunming 650201 , China)
Abstract:Vanilla root rot has been a limiting factor to vanilla production in most regions in which it is
grown.The causal reagents of vanilla root rot were Fusarium oxysporum f.sp.vanillae and Fusarium
solani.The technique of isozyme electrophoresis was applied to analyze 12 of causal reagents of vanilla root
rot , including 9 isolates of F .oxysporum and 3 isolates of F.solani .The aims of this research was to find
the marker related with pathotypes.The EST (esterase)electrophoresis analysis showed:EST was almost
distributed in middle and fast areas.All the EST bands were clustered by Unweighted Pair Group with
Mathematic Average (UPGMA).The dendrogram of UPGMA showed that F .oxysporum f.sp.vanillae and
F .solani can be differentiated based on 0.71 analogical level;different pathotypes can be differentiated
based on 0.86 analogical level.
Key words:Vanilla root rot;Fusarium oxysporum;Fusarium solani ;Esterase
　　香荚兰又名香子兰 、香草兰 、香草或香兰 ,是
一种名贵的多年生热带兰科藤本植物[ 1] 。香荚兰
病害的研究早在 20世纪初期就有了少量的报道 ,
迄今国内外报道的病害共有 30多种 ,其中香荚兰
根腐病是制约香荚兰生产的重要因素 ,广泛分布于
国内外香荚兰生产种植区 。在云南西双版纳香荚
兰种植园当病害发生严重时可导致香荚兰种植园
的部分毁灭。其病原菌为尖孢镰刀菌香荚兰专化
型 Fusarium oxysporum f .sp vanillae (Tucker)Gordon
和茄类镰刀菌 F.solani[ 2] 。
生物体内酯酶同工酶的变化是基因与内部生
化特性的反应 ,已广泛用于作物品种资源调查分
析 ,优种纯化 ,作物品种抗病性分析 ,真菌分类以及
病原菌致病力和生理分化鉴定等领域[ 3 ,4] 。酯酶
DOI :10.16211/j.issn.1004-390x(n).2005.01.006
同工酶作为一种分子标记 ,不易受外界环境条件的
影响 ,遗传上具有稳定性 ,酶谱类型丰富 ,作为遗传
标记可以看作是基因和性状的联结物 ,用以识别基
因的存在和表达 ,是一种可靠的遗传标记[ 5] 。本试
验应用同工酶电泳技术对香荚兰根腐病病菌进行
酯酶同工酶谱分析 , 其目的是想寻找与致病性/非
致病性相关的同工酶标记 。
1 　材料和方法
1.1 　供试菌株
香荚兰根腐病的致病菌与非致病菌:本研究选
用12个菌株 ,其中尖镰孢 9株 ,茄镰孢 3株(表 1)
进行酯酶同工酶谱分析。
表 1 　供试菌株
Tab.1　Isolatesof Fusarium spp.used in isozyme analysis
菌株 致病性 类型
HK-3a-3(A1)
MJD-2e(A2)
DL-3-1(A3)
ML-7-2(B1)
DL-1-1(B2)
DL-4b(B3)
MJD-2b-1(C1)
HK-9a-1(C2)
HK-5b-4-1(D)
ML-7-3(E1)
MJD-2-2(E2)
ML-13(E3)
3+
3+
3+
2+
2+
2+
1+
1+
-
-
2+
3+
F .oxysporum
F .oxysporum
F .oxysporum
F .oxysporum
F .oxysporum
F .oxysporum
F .oxysporum
F .oxysporum
F .oxysporum
F.solani
F.solani
F.solani
　　注:3+为强致病菌株;2+为中致病菌株;1+为弱致病
菌株;-为非致病菌株
1.2 　酶的提取
将培养 7 d 重量基本相同的菌丝用刀片刮入
干净研钵中 ,加入液氮研磨成粉末状 ,移进 1.5 mL
离心管中 ,加入两倍量0.1mol/L Tris-Cl(pH 7.0)
缓冲液 ,13 000 r/min离心20min ,抽提上清 ,置于-
20 ℃冰箱备用[ 6 ,7] 。
1.3 　同工酶电泳
采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳系
统[ 8] ,其中酯酶同工酶电泳浓缩胶 pH =6.8 ,质量
浓度 3%;分离胶 pH=8.9 ,质量浓度 11%,催化剂
为过硫酸铵 ,电极缓冲液为pH=8.7的低离子强度
Tris-甘氨酸缓冲液。
电泳有2种方式:稳压和稳流。电泳在 4 ℃下
进行 ,大约需 5 h左右。以溴酚蓝为电泳指示剂 。
稳压时先 100 ～ 150V 电泳一段时间 ,待指示
剂在胶版上成一直线时 ,再加大电压至 200 ～ 250
V 。
稳流:在浓缩胶上跑时一个样品 1 mA ,跑至分
离胶上时加到一个样品 2 mA 。电泳跑至离胶槽底
部约 5mm 处停止。
1.4 　染色
酯酶同工酶在 37 ℃条件下染色 ,染色方法为:
以α-醋酸萘酯 、β-醋酸萘酯为底物 ,坚固蓝为染
料法[ 8] 。染色液的配方为:称取坚固蓝 90mg ,溶于
90mL pH 6.4的 0.1 mol/L磷酸缓冲液里(磷酸氢
二钠 0.949 g ,磷酸二氢钠1.146g ,溶于100mL蒸馏
水中),再加 6mL 1%α-醋酸萘酯 , 3mL 2%β -醋
酸萘酯。将电泳胶放入染色液中 30min左右 ,酶带
清晰后 ,用蒸馏水轻轻冲洗胶面 。用 10%的甘油
或 70%的乙酸固定 、制干胶片 。
1.5 　电泳结果分析
测量溴酚兰迁移线及各酶带的泳动距离 ,计算
谱带相对迁移率(Rf值)。
Rf值=谱带迁移距离/前沿指示剂迁移距离
式中“谱带迁移距离”是指浓缩胶与分离胶分
界线至谱带中心位置的距离 。“前沿指示剂迁移距
离”是指浓缩胶与分离胶分界线至指示剂中心位置
的距离。根据 Rf值分出酶带的快带 、中间带 、慢带
区并统计出0 ,1条带 ,利用Statistical统计分析软件
对结果进行UPGMA聚类分析 。
2 　结果与分析
2.1 　酯酶同工酶电泳结果
12个样品共出现了 14 条带 ,经聚类分析有 5
个表型。相对迁移率范围在:0.18 ～ 0.71。各个样
品在慢带区(Rf值<0.15),中间带区(Rf值在 0.15
～ 0.4之间),快带区(0.4 ～ 0.71)的分布见表 2。
从电泳结果(图 1)可看出酶活性区主要集中
在0.18到 0.71之间即中间带区和快带区 。这两
个区域不仅酶活性强 、染色快 ,且很稳定 。在 Rf值
0.18处 E1 ,E2 ,E3没有出现条带 ,而 9个尖孢镰刀
菌都有这条带 ,在本研究中这是尖镰孢菌特异带;
在 Rf值0.32 ,0.40 ,0.71处 ,只有菌株E1 , E2 ,E3有
条带 ,在本研究中这是茄类镰刀菌的特异带 。非致
病菌株 D 在电泳图谱上明显与其它菌株有差异 ,
它共跑出 4条带 ,中间带区 、快带区活性很弱 ,染色
28 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第20卷
浅 ,其中 Rf值 0.29处的条带是有别于茄类镰刀菌
E1 ,E2 ,E3的带 ,而 Rf值 0.42处的条带是非致病
菌D有别于尖孢镰刀菌的条带 。D菌株与 C1 ,C2
两个弱致病菌株在中间带区的酶谱有相似之处 ,差
异也仅是 C2 菌株在 Rf 值 0.23处多一条带 ,但 D
菌株与 C1 , C2 菌株在快带区的酶谱差异很大 。
A1 ,A2 ,A3 ,B1 ,B2 , B3 ,C1 ,C2这八个菌株在凝胶的
中下部的酶谱相似 ,而且分布稳定 ,只是存在染色
强弱的差异;A1 ,A2 ,A3 菌株在 Rf 值 0.18到 0.28
处出现了 4条带 , A3菌株第四条主酶带的迁移率
略有改变 ,在凝胶板上的位置较 A1 ,A2 略低了一
些;A3菌株在 Rf值 0.51处缺失了一条带 ,但在 Rf
值0.63 处多出一条带 。B1 , B2 , B3 菌株在 Rf 值
0.18处均出现了一条带 ,在 Rf值 0.51到 0.63 的
酶谱相似 ,只是 B2菌株在 Rf值 0.63 的地方多出
一条带;C1 , C2 菌株酶谱的差异仅在于在 Rf 值
0.23处 C2菌株有一条带 。
表 2 　酯酶同工酶各酶带在慢带区 、中间带区 、快带区分布
Tab.2　Distributing of bands of esterase isozyme in slow/middle/ fast area
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 D E1 E2 E3
慢带区 无条带
中间带区 4 4 4 1 1 1 3 4 3 4 4 4
快带区 4 4 4 4 5 4 5 5 2 5 5 5
图 1 　酯酶同工酶电泳结果示意图
Fig.1　Sketch of electrophoresis isozyme profile of esterase 图 2 　12个菌株的酯酶同工酶电泳结果聚类图
Fig.2　Clustering dendrogram based on result of
esterase isozyme electrophoresis
　　从树状图(图 2)可看出 ,相似性为 0.86时 ,强
致病性菌株 HK-3a-3(A1),MJD-2e(A2), DL-3
-1(A3)聚为一类;中致病性菌株ML-7-2(B1),
DL-1-1(B2),DL-4b(B3)聚为一类;弱致病菌株
MJD-2b-1(C1),HK-9a-1(C2)聚为一类;非致
病菌株 HK-5b-4-1(D)为一类;这与致病性测
定结果相关 。茄类镰刀菌ML-7-3(E1),MJD-2
-2(E2),ML -13(E3)聚为一类 。另外 ,在相似性
0.71时尖孢镰刀菌和茄类镰刀菌可被分开。
3 　讨论
生物的遗传变异是生物群体内多态等位基因
存在的反映 ,是生物进化的先决条件 ,也是同工酶
技术在研究生物分类及系统进化中得以应用的理
论基础 。同工酶技术可联系基因型 、酶与功能 、性
状 4元素 ,以生化表现型表现基因型 ,而且操作简
便 ,样本分析成本低 ,作为真菌分类手段之一 ,同工
酶电泳技术具有重要意义和实用价值 。
王四宝[ 5]认为真菌的同工酶分析结果易受取
样部位 ,培养条件 ,转代次数等影响 ,王守正[ 9]认为
培养基偏酸性和中性(pH 5 , 6 , 7)对同工酶结果影
响不大 ,培养天数也没有明显影响 ,但培养基成分 ,
培养温度对结果有影响 ,因此为了保证结果的科学
性和可靠性 ,本研究中镰刀菌的培养统一用马铃薯
蔗糖培养基 , pH =7;而且培养条件 、天数一致;样
品制备条件一致 。由于酯酶同工酶一般为单体或
29第 1期　　　　　　　　　　李霞 ,等:香荚兰根腐病原菌酯酶同工酶分析
二聚体 ,分子量较小 ,因此分离胶的浓度为 11%。
从酯酶同工酶谱来看 ,聚类分析表明9个尖镰
孢聚为一类 ,3个茄类镰刀菌聚为一类。从电泳图
谱可看出一个种内的酶谱并不完全相同 ,原因是变
异性 ,一个生物种群内存在异质性 ,是一个遗传上
的杂合群体 ,这在镰刀菌中尤为突出.同工酶是受
基因决定和调控的 ,种群内的遗传异质性必然对酯
酶同工酶的组成和谱型造成差异 ,因此一个种内出
现不同酶谱类型是种内遗传异质性的客观反应 。
这也表明了变异的普遍性 ,而一个种的遗传性也是
相对稳定的 。本试验结果还表明酯酶同工酶与致
病性有明显的相关性 , 运用酯酶同工酶可分开致
病性不同的菌株 ,但由于本研究所用菌株有限 ,还
需要扩大菌株数量进一步证实该结论。
茄类镰刀菌的 3个菌株分属于不同的致病性 ,
但从聚类图来看 ,3 个菌株没有明显差距 ,且酯酶
同工酶谱出现了 3条特异带 。这可能与所选菌株
的数量有关 ,若有一定数量的 、致病性不同的菌株 ,
可以对多个菌株进行分析比较 ,找出代表不同的致
病性的相关酶带和电泳图谱类型 ,种内的变异有可
能被检测出来。
长期以来菌株致病性的测定 ,一直是采用鉴别
寄主的测定法 ,但常常受到各种因素的干扰使结果
表现为不稳定性。如能把常规鉴别寄主的测定法
与同工酶酶谱鉴定法结合必将能弥补寄主测定法
的不足。笔者在试验结果的基础上初步认为:香荚
兰根腐病致病性鉴定 ,在标准培养条件下 ,可用酯
酶同工酶酶谱鉴定来弥补寄主测定法的不足。
[ 参　考　文　献]
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