全 文 ：文章编号:1001-4829(2003)01-0074-04
　　收稿日期:2002-11-15
　　基金项目:云南省自然科学基金(98CO35M)、云南省教委科学
基金 、云南省植物病理重点实验室开放基金资助项目
作者简介:黄琼(1963-),女 ,副教授 ,主要从事植物病原细菌研
究。
蚕豆茎疫病菌 rep-PCR初析
黄　琼1 ,孙启明2 ,姬广海1 ,钱　君1 ,孙跃先1 ,刘凤权2
(1.云南农业大学植保学院 ,云南 昆明　650201;2.南京农业大学植保系 ,江苏 南京　210095)
摘　要:对分离自云南省 18个县(市)的蚕豆细菌性茎疫病菌 34个菌株进行的 rep-PCR分析结果表明 ,用引物 BOX 和 ERIC分别
扩增出 25和 24条多态性条带 ,分子量大小从 100～ 21 226bp ,大多数条带主要集中在 564～ 1375bp。蚕豆茎疫病菌菌株具有丰富
的 DNA 多态性和较大的遗传变异。 24～ 25个菌株在 75 %遗传水平上相似。研究发现来自景东 、昭通 、玉溪 、宣威 、弥渡 、文山、洱
源 、保山的菌株具有 75 %的同源性 ,与菌株的地理来源有一定相关关系。
关键词:蚕豆茎疫病菌;rep-PCR;蚕豆
中图分类号:S436.43　文献标识码:A
Preliminary rep-PCR analysis of Psudomonas fabae of broad bean
HUANG Qiong1 , SUN Qi-ming2 , JI Guang-hai1 , QIAN Jun1 , SUN Yue-xian1 , LIU Feng-quan2
(1.College of Plan t Protection , Yunnan Agricultural University , Kunming 650201 , China;2.Department of Plant Protection , Nanjing
Ag ricultural University , Nanjing 210095 , China)
Abstract:rep-PCR analysis for thirty-four i solates of Psudomonas fabae collected f rom 18 broad bean-producing coun ties in Yunnan was
conducted.The result s show ed that 25 and 24 polymorphism bands w ere amplified respect ively by using p rimers BOX and ERIC.The
molecular w eight of clust bands ranged f rom 100 bp to 21226bp , and most of them were 564bp to 1375bp.Analysis of genetic variation
show ed abundant DNA polymorphism and diversi ty among isolates, 24 or 25 isolates had 75 % genet ic similarity.And strains collected from
Jindong ,Zhaotong , Yuxi ,Xuanw ei , Midu ,Wenshan , Eryuan and Baoshan had 75 % homology , indicating that it was related to the geo-
graphical origin of the pathogen in a certain degree.
Key words:Psudomonas fabae;rep-PCR;b road bean
　　近年来的许多研究表明 ,细菌基因组中存在一
类短重复序列在维护细菌基因组 DNA结构和遗传
进化方面起着重要作用 ,且在不同的属 、种和菌株菌
间具有高度的保守性。利用 REP 、ERIC 、BOX等引
物 ,结合 PCR 技术 , 选择性扩增 REP 、ERIC 、BOX
因子之间不同基因组区域 ,扩增产物通过琼脂糖凝
胶电泳进行分离 ,此项技术合称 rep-PCR DNA指纹
技术 。根据 rep-PCR DNA 指纹 ,能在种 、亚种和小
种(致病型)和菌株水平上进行细菌分类和鉴定 ,并
且能明确同一致病变种菌株间的遗传变异关系。该
技术已成功地应用于 Xanthomonas 、Pseudomonas 、
Acidovorax 、Agrobacterium 、Rhizobium 、Ctavibac-
ter 等属内不同种的研究[ 1～ 3] 。目前 ,已报道的重复
序列有 REP 、ERIC 、BOX序列[ 4 ～ 6] 。
蚕豆细菌性茎疫病(Pseudomonas fabae T F
Yu)[ 7]在云南省蚕豆种植区常有发生 ,由于该病导
致全株死亡 ,发病率几乎等于损失率 ,给云南蚕豆生
产造成了一定的危害。本研究首次利用 rep-PCR比
较分析云南的蚕豆细菌性疫病菌的遗传谱型 ,以期
为蚕豆细菌性疫病菌菌系分化及亲缘关系提供理论
依据。
1　材料与方法
1.1　试验菌株
蚕豆细菌性茎疫病菌株分离自云南省的永胜 、
双江 、玉溪 、呈贡 、宣威 、剑川 、弥渡 、文山 、大姚 、景
东 、新平 、昭通 、武定 、宁蒗 、洱源 、保山和丽江。所有
菌株均经致病性测定。
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西　南　农　业　学　报
Sou thw est China Journal of Agricultural S ciences
　　　　　　　　　　　　　　2003年 16卷 1期
Vol.16　　No.1
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2003.01.018
1.2　菌株染色体 DNA 提取
参照文献[ 8]和[ 9]等进行。供试菌株在 KBA
培养液上 28 ℃,180 rpm 生长 24 h ,5000 rpm ,10min
离心收集菌体 ,用 PBS缓冲液悬浮离心 ,重复 3次;
加抽提缓冲液 ,胰 RNA酶至 20μg/mL ,37 ℃保温 1
h ,再加入 5μL 的 20 mg/mL的蛋白酶 K ,50 ℃保温
3 h ,加入等体积的水饱和酚 、氯仿和异戊醇混合液
(25:24:1),充分混匀后 10 000 rpm 离心 20 min ,收
集水相 ,重复抽提 1 ～ 2次;加入 2倍体积的冰无水
乙醇和 5M NaCl(至终浓度 0.2M),立即混匀 ,待絮
状沉淀出现后 ,于 4 ℃静置 30min ,12 000 rpm 、离心
15min 收集 DNA 沉淀 ,用 70 %乙醇洗涤 2次 , 10
mmol TE溶液溶解 ,4 ℃保存。DNA 纯品在 260 nm
和280 nm 处吸光值之比(OD260/OD280)为 2 ,若样
品OD比值明显低于 2则有蛋白质或酚污染。
1.3　DNA 样品浓度估测
取2μL DNA 溶液于 0.75 %的琼脂糖胶上电
泳 ,电压降为 4 v/cm ,用不同浓度梯度的λDNA 作
对照 ,比较样品 DNA带与λDNA带的亮度 ,估算待
测样品的 DNA 含量 ,并稀释至终浓度约为 50 ng/
μL。
1.4　参试引物
序列如下:
ERIC　　ERIC1R(5 -ATGTAAGCTCCTGGGGAT TCAC-3 )
ERIC2(5 -AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3 )
BOX BOX1R(5 -CTACGGCAAGGGCGACGCTGACG-3 )
REP REP1R-1(5 -IIIICGICGICATCTGGG-3 )
REP2-1(5 -ICGICT TATCIGGCCTAC-3 )
引物稀释至 200μmol ,分装 , -20 ℃保存(引物
由大连宝生公司合成)。
1.5　PCR扩增
PCR反应参照文献[ 9]和[ 10] 进行 。10 mmol
Tris-HCl ,pH8.3 ,10 mmol KCl ,1.5 mmol M gCl2 ,每
个dNTP200μmol ,每个引物 50 pmol , 2.5单位聚合
酶 ,50 ngDNA 模板 , ddH2O 加至 25 μL 反应体积 。
反应程序:95 ℃预变性 7 min ,PCR反应条件按每循
环 94 ℃1 min变性 ,52 ℃1 min退火 ,65 ℃延伸 18
min。扩增共进行 30轮循环。最后 65 ℃延伸 15
min ,PCR反应产物 4 ℃保存 。
1.6　rep-PCR扩增产物琼脂糖检测
取 6 ～ 8μL 扩增产物于 1.5 %琼脂糖胶上电泳
分离 ,电压降为 4 V/cm ,历时 5 ～ 6 h ,电泳完毕 ,溴
化乙锭染色 ,脱色 ,于紫外灯下观察结果 ,并用 VDS
系统进行图像采集和保存。初步分析后 ,电泳效果
好的用于Synelgel胶电泳。
1.7　rep-PCR扩增产物 Synelgel凝胶电泳检测
扩增产物用(0.5 %Agarose+0.75 %Synelgel)
混合胶进行电泳 ,电压降为 2 V/cm ,10 h后染色 ,清
水漂洗脱色 ,检测 ,摄影 。
1.8　聚类分析
对 rep-PCR扩增产物凝胶图谱进行读带 ,有带
记为 1 ,无带的为 0 ,制成 Excel文件用于聚类分析;
使用 N TSYS-pc 计算机软件采用 UPGMA 分析程
序 ,进行分子指纹聚类分析 。
2　结果与分析
2.1　rep-PCR分析
泳道 1 ～ 34(菌株编号 1 ～ 34)依次为:永胜 1 、
永胜 2 、双江 1 、双江 2 、玉溪 2 、玉溪 3 、呈贡 2 、呈贡
10 、宣威 11 、宣威 12 、剑川 1 、剑川 6 、弥度 2 、弥度 5 、
文山 3 、文山 6 、大姚 9 、大姚 16 、景东 4 、景东 8 、新平
3 、昭通 6 、武定 2 、宁蒗 、洱源 2 、洱源 3 、洱源 4 、洱源
6 、保山 2 、保山 1 、昭通 1 、昭通 2 、丽江 2 和丽江 5。
M 泳道为 Marker λDNA/EcoRⅠ +HindIII ,分子量
从 564 ～ 21 226bp 。
BOX引物对 34 个蚕豆茎疫病菌株进行 rep-
PCR扩增的指纹图谱(图 1 , A 、B)结果显示供试菌
株共扩增到 25 条带 ,均为多态带;ERIC 引物共扩
增到 24条带 ,亦均为多态带(图 1 ,C 、D);而 REP 引
物由于扩增结果条带太少 ,部分菌株未扩增出条带 ,
故本文未对其扩增结果进行分析 ,可能是反应条件
不适合所致。BOX 和 ERIC 引物扩增的片段大小
从 100bp到 21 226bp左右 ,但大多数带 ,主要集中
在 564 ～ 1375bp。34个菌株共扩增出 24 ～ 25条分
子量不等的带 ,均为多态性带 ,说明蚕豆茎疫病菌存
在丰富的遗传多样性。使用 N TSYS-pc计算机软件
采用 UPGMA 分析程序 ,进行分子指纹聚类分析 ,
结果见图 2和图 3。不同的相似水平下可划分为不
同的遗传相似组群 。在 45 %遗传相似水平 ,所有菌
株聚成一类 。在 95 %遗传水平上 , BOX和 ERIC引
物分别有 5 个和 10 个菌株聚成一类 。16个和 18
个菌株在 85 %遗传水平上相似 。在 75 %遗传水平
上 ,分别有 24个 , 28 个菌株聚成一组。此时 , ERIC
引物与引物 BOX扩增结果非常一致 , ERIC扩增结
果包括了全部 BOX 扩增出的 24个菌株 ,仅多 4个
菌株。
751期 黄　琼等:蚕豆茎疫病菌 rep-PCR初析
图 1　引物 BOX(A , B), ERIC(C ,D)对蚕豆茎疫病菌扩增的 DNA 指纹图谱
Fig.1　Finger printing patterns from genomic DNA of Pseudomonas fabae isolates generated by BOX(A , B)and ERIC(C ,D)p rimers
图 2　引物 BOX扩增的蚕豆茎疫病菌间变化的树状系
谱图
Fig.2　Dendrogram for variables unw eighted pair-grouped average
percent disagreement among 34 st rains of Pseudomonas fabae based on
p rimer BOX
图 3　引物 ERIC扩增的蚕豆茎疫病菌间变化的树状系谱图
Fig.3　Dendrogram for variables unw eighted pai r-grouped average
percent disagreemen t among 34 st rains of Pseudomonas fabae based on
primer ERIC
76 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　16卷
2.2　rep-PCR遗传组与病菌致病性的关系
分子指纹聚类分析表明蚕豆茎疫病菌存在丰富
的遗传多样性。由于对该病害研究报道很少 ,未见
寄主的抗性遗传的报道。笔者曾对不同地区蚕豆茎
疫病菌致病力进行了比较研究 ,发现各地菌株致病
力强弱与病害田间发病程度 ,即与病害流行有关 ,存
在明显的致病力分化现象[ 11] 。虽然来自昭通的强
毒力菌株同源性高达 90 %～ 100 %,但来自剑川的
强毒力菌株同源性为 65 %～ 90 %。 rep-PCR遗传
谱型表明 ,来自景东 、昭通 、玉溪 、宣威 、弥渡 、文山 、
洱源 、保山的菌株具有 75 %的同源性 ,与菌株的地
理来源有一定相关关系 ,和菌株毒力无明显相关关
系 ,可能与菌系分化 ,或病原有关。至于其菌系分化
则有待更多不同地方的菌株与品种的互作研究。因
此 ,建立一套能清晰地反映寄主 —病原互作的鉴别
系统对明确病菌菌系遗传多样性与致病力分化之间
的系统发育关系是至关重要的 。
3　讨论与结论
用BOX和 ERIC引物扩增的条带数较一致 ,分
别为 25 和 24 条 ,亦均为多态带;来自景东 、昭通的
菌株均具有 95 %的同源性 ,来自 8个地区的菌株具
有 75 %的同源性;来自其他地区的菌株则有不同程
度的差异 ,亲缘关系较远 。BOX和 ERIC 分别有 25
个和 28个菌株在 75 %遗传水平上相似。ERIC 引
物扩增显示来自弥渡的菌株具有 95 %的同源性 ,用
BOX引物扩增来自弥渡的菌株只有 80 %～ 85 %的
同源性 ,有的亲缘关系则较远 ,如来自洱源的菌株 ,
ERIC 引物扩增显示同源性40 %～ 90 %, BOX引物
扩增同源性 70 %～ 90 %。这表明用不同的引物扩
增结果存在差异[ 9] 。Vera Cruz C M 认为用两个以
上引物比单独一个引物能检测到较高的多态性[ 9] 。
此外 ,加大检测病菌的群体对于病菌的群体遗传 ,监
测病菌的动态变化是很重要的[ 9 ,12 , 13] 。本研究初
步探索了云南蚕豆茎疫病菌染色体 DNA 的 rep-
PCR谱型构成。今后应加强寄主 —病原互作研究 。
由于菌株主要来自云南 ,未涉及其他地区的菌株 。
因此 ,进一步测定更多地区的菌株 ,加大检测病菌的
群体来研究我国蚕豆茎疫病菌的群体结构和遗传多
样性是很有必要的 。
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(责任编辑　王家银)
771期 黄　琼等:蚕豆茎疫病菌 rep-PCR初析