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桃枝枯病病原鉴定



全 文 :书桃枝枯病病原鉴定
纪兆林1,戴慧俊1,金唯新2,宋宏峰3,张慧琴4,金建芳5,熊彩珍6,徐敬友1*
(1.扬州大学 园艺与植物保护学院,江苏 扬州225009;2.无锡市 惠山区 阳山镇农业技术综合服务站,江苏 无锡214155;
3.江苏省农业科学院 园艺研究所,江苏 南京210014;4.浙江省农业科学院 园艺研究所,浙江 杭州310021;
5.嘉兴市 南湖区 凤桥镇农业服务中心,浙江 嘉兴314007;6.嘉兴市南湖区林业与蚕桑站,浙江 嘉兴314000)
摘 要:为明确近年来新发现的严重危害桃树的桃枝枯病病原种类,采集浙江和江苏两地的桃枝枯病病枝,对病原进行
分离和鉴定。通过对真菌分离物培养性状、分生孢子器和分生孢子形态观察,两地真菌分离物均为桃拟茎点霉(Pho-
mopsis amygdali)。ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列分析表明两地真菌分离物为同一种病原菌,与GenBank中桃拟茎点霉
序列具有99%的相似性,其ITS序列已在GenBank中登录(登录号分别为JX081273和JX182974)。离体和活体致病性
测定结果表明,分离菌株均能使桃健康新梢产生枝枯病症状,从接种发病部位再次分离到病原菌,完成了柯赫氏法则
(Koch’postulates)验证。结合其形态特征、ITS序列和致病性测定结果,浙江和江苏桃枝枯病病原确定为桃拟茎点霉。
关键词:桃枝枯病;形态特征;致病性;ITS序列;桃拟茎点霉
中图分类号:S 662.1;S 432.4+4    文献标志码:A    文章编号:1671 4652(2013)04 0094 05
Identification of the pathogen causing shoot blight of peach trees
JI Zhaolin1,DAI Huijun1,JIN Weixin2,SONG Hongfeng3,ZHANG Huiqin4,
JIN Jianfang5,XIONG Caizhen6,XU Jingyou1
(1.Coll of Hort and Plant Prot,Yangzhou Univ,Yangzhou 225009,China;
2.Agric Tech Int Serv Sta of Yangshan Town,Huishan Dist,Wuxi City,Wuxi 214155,China;
3.Inst of Hort,Jiangsu Acad of Agric Sci,Nanjing 210014,China;
4.Inst of Hort,Zhejiang Acad of Agric Sci,Hangzhou 310021China;
5.Agric Serv Cen of Fengqiao Town,Nanhu Dist,Jiaxing City,Jiaxing 314007,China;
6.For and Seric Sta of Nanhu Dist,Jiaxing City,Jiaxing 314000,China)
ABSTRACT:Peach shoot blight is an increasingly serious and new disease in Zhejiang and Jiangsu province peach growing
areas in recent years.The pathogen was isolated from peach twigs with constriction canker from peach orchards in Jiax-
ing,Zhejiang province and Wuxi,Jiangsu province,respectively.Examination of the strains by morphological and cultur-
al characteristics showed that the fungus was Phomopsis amygdali.The identification was verified by ITS analysis of rD-
NA.The sequences(GenBank accession Nos.JX081273and JX182974)shared 99.6%identity with each other.A com-
parison of these two sequences with those in GenBank showed that the sequences had the highest nucleotide similarity
(99%)with P.amygdali isolate FAU1052from peach in the southeastern United States(accession No.AF102998).
Pathogenicity tests in vivo and in vitro indicated that the isolates caused similar reddish brown around twigs as observed
in the field.The pathogen was reisolated from inoculated plants,confirming Koch’s postulates.Based on the pathogenici-
ty,morphological characteristics and rDNA molecular analysis,the pathogen of peach shoot blight was finaly identified
as P.amygdali.
KEY WORDS:peach shoot blight;morphological characteristics;pathogenicity test;ITS sequence;Phomopsis amygdali
近年来,浙江嘉兴市及江苏无锡市、常州市等桃产区桃枝枯病相继发生且逐年加重,病树产量一般
收稿日期:2013 06 12
基金项目:国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-31-2-02);扬州大学高层次人才科研启动基金资助项目(0274983014811)
作者简介:纪兆林(1978- ),男,江苏句容人,扬州大学副教授、博士,主要从事植物病害防控及分子植病研究。
* 通信作者,E-mail:jyxu@yzu.edu.cn
第34卷第4期 扬州大学学报(农业与生命科学版) Vol.34No.4
2013年12月 Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition) Dec.2013
书损失20%~60%,给桃农造成严重经济损失。该病害主要为害新梢,通常在新梢基部出现环状缢缩性
褐斑,导致叶片枯萎、变黄和脱落;枝条发病部位一般伴有流胶产生,随着病情的发展,整个枝条当年或
翌年枯萎、枯死,幼果随枯枝干枯、脱落。少数病斑也可出现在叶痕上,使刚萌发的叶芽枯死。据文献
[1-2]报道,美国东部沿海地区也曾发生此病,症状相同,称桃“缢缩性溃疡病(constriction canker)”或
“枝枯病(shoot blight)”,病原为桃拟茎点霉[Phomopsis amygdali(Del.)Tuset &Portila]。但是,在
浙江和江苏两地发生的桃枝枯病病原是否与美国相同尚不清楚。为明确该病病原及提出有效防治方
法,本研究采集浙江嘉兴市和江苏无锡市桃枝枯病病枝样本,进行病原菌分离纯化和致病性测定工作,
并根据病原菌的形态学特征,结合rDNA内转录间隔区(ITS)序列分析等分子学方法,对该病原菌进行
鉴定。
1 材料与方法
1.1 供试材料
桃树病枝分别采自浙江嘉兴市南湖区凤桥镇和江苏无锡市惠山区阳山镇桃园,用于病原菌分离。
1.2 病菌分离纯化
采用组织分离法[3]进行病原菌分离,分离物纯化后接种于PSA斜面试管,4℃保存备用。
1.3 致病性测定
1)室内离体接种:选取嘉兴南湖和无锡惠山分离的代表菌株进行离体致病性测定。将长满平板
的3皿菌落与120mL灭菌水混合,用组织捣碎机打碎成匀浆,再补足灭菌水至160mL。每三角瓶加
入40mL菌丝匀浆液,每瓶插入一枝一年生新梢枝条(新白凤,8年树龄),重复4次。设清水为对照,共
3个处理。接种后枝条置于模拟正常日照的25℃恒温室中,观察发病情况,并对接种后发病枝条进行
病菌再分离。
2)田间接种:选取嘉兴南湖和无锡惠山分离的代表菌株进行田间活体致病性测定。将直径6mm
的病菌菌饼接种于桃树新梢(新梢长度基本一致,20cm左右)基部人造伤口上,保湿48h后揭去保湿
膜和脱脂棉。每菌株接种20枝新梢,设清水为对照。定期观察接种部位发病情况,并对接种后发病枝
条进行病菌再分离。
1.4 病原菌形态特征观察
观察分离菌株在PSA平板上的菌落形态特征,并用数码相机记录菌落形态特征。在光学显微镜下
观察分离菌株在PSA平板上形成的分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子的形态特征,显微拍照并测量
孢子大小。参照文献[4]方法进行病原菌初步鉴定。
1.5 病原菌rDNA-ITS序列扩增与分析
1)基因组DNA提取:在新倒、刚要凝固的PSA平板上,将灭菌玻璃纸铺在平板表面,待培养基凝
固后将纯化的分离菌株接种到玻璃纸上,25℃培养3d,用无菌刀片轻轻刮取玻璃纸上菌丝。采用
CTAB法提取菌株基因组,并用琼脂糖凝胶电泳和分光光度法检测gDNA质量,-20℃保存备用。
2)ITS序列扩增:采用真菌ITS序列通用引物[5]ITS4(28S)和ITS5(18S)扩增整个ITS区序列,
包含其两端的18SrDNA、28SrDNA的部分序列和中间的ITS1区、5.8SrDNA、ITS2区的完整序列。
引物序列:ITS4为5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,ITS5为5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-
3′。PCR扩增程序:95℃预变性5min;95℃变性45s,51℃退火45s,72℃延伸40s,共30个循
环;72℃延伸10min。采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
3)PCR产物回收与纯化:目的片段凝胶条带用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒回收和纯化,纯化
片段送上海生工生物工程公司测序。
4)病原菌rDNA-ITS序列同源性比较:对测得的供试菌株rDNA-ITS 区段的序列,分别用
GenBank数据库中BLAST工具软件,在DNA序列数据库中搜索同源DNA序列并进行比较分析,根据
BLAST搜索和比较结果,判断菌株种类及其近缘物种。
59第4期 纪兆林等:桃枝枯病病原鉴定
2 结果与分析
2.1 病害症状
图1 桃枝枯病症状
Fig.1 Symptoms of peach shoot blight
桃树上形成的病害症状主要有2种:一种在新
梢枝条基部形成褐色环绕病斑,枝条感病部位初期
肿胀,后干枯凹陷缢缩,有时伴有流胶,后期新梢枯
萎甚至死亡;另一种在叶痕上形成褐色长椭圆形病
斑,有明显或不明显轮纹,抽出的叶芽枯死(图1)。
2.2 病原菌的致病性
室内离体接种试验表明,接菌枝条3d后产生
褐色病斑,并不断向上扩展(图2)。田间接种显示,
接菌后接种部位枝条产生褐色环绕病斑,后向两端
扩展,病部有时伴有少量流胶(图3)。在室内或田
间接种试验中,对照组均不发病。对接种发病后的
病斑再分离,均能获得与原分离菌株一致的病原菌。
根据柯赫氏法则,接种的菌株均为桃枝枯病致病菌。
图2 分离菌株接种离体新梢的发病情况
Fig.2 Symptoms of peach twigs
inoculated by isolate in vitro
上枝条为清水对照,下枝条为接种处理
2.3 病原菌的形态特征
PSA平板上菌落灰白色、绒毛状、平伏,周边新生菌丝稀薄,
中央区域菌丝浓密,霉层密实,菌落背面可见褐色色素,呈轮纹
状。后期平板上形成黑褐色子座,内生分生孢子器(图4)。分生
孢子器黑色,器壁革质,多分隔为不规则多腔,少数呈圆球形,有
明显的颈部突出。分生孢子梗短,不分枝。分生孢子器内产生甲、
乙型2种分生孢子。甲型分生孢子:梭形,两端略尖,单胞,无色,多含
2个油球,大小为(5.5~8.9)μm×(0.9~3.2)μm。数量多,常组成黄
色黏液从器口泌出。乙型分生孢子:线形,单胞,无色,大小为(21.7~
图3 分离菌株田间接种活体新梢的发病情况
Fig.3 Symptoms of peach twigs inoculated by isolate in vivo
a.清水对照;b.接种处理
32.6)μm×(0.2~0.3)μm(图5)。根据形态学
特征,初步确定该病原菌为桃拟茎点霉。
2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析
利用引物ITS4和ITS5对浙江分离物代
表菌株ZN32和江苏分离物代表菌株JH12进
行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测,均获得
1条600bp大小的清晰条带(图6),经测序分
别得到大小为580和575bp的片段,序列已登
录在 GenBank (登录号分别为JX081273和
JX182974)上。将该序列与GenBank中相关菌株ITS序列进行同源性比较,结果表明,菌株ZN32和
JH12序列与桃拟茎点霉的相似性均为99%,从而支持分离菌株为桃拟茎点霉。
2.5 病原菌种类确定
根据桃枝枯病分离菌株致病性、形态特征及rDNA-ITS序列分析结果,参照文献[4,6]及 Tuset
等[2]研究结果,确定桃枝枯病病原为半知菌类拟茎点霉属桃拟茎点霉。
3 讨论
对桃拟茎点霉(P.amygdale)进行文献检索,结果发现该病原菌与壳梭孢属(Fusicoccum)真菌F.
69 扬州大学学报(农业与生命科学版) 第34卷
图4 分离菌株在PSA培养基上的形态
Fig.4 Morphology of isolate on PSA
a.菌落正面;b.菌落背面;c.子座(内生分生孢子器)
amygdali为同物异名,建议采用
“P.amygdali (Del.)Tuset &
Portila”学名[2]。该病菌引起桃树
病害的报道最早可追溯到1905年,
法国学者 Delacroix[7]首次报道了
F.amygdali引起的桃树溃疡病。
20世纪50年代,美国大西洋沿岸地
区该病严重流行[1,8-11],称此病为
“缢缩性溃疡病”或“枝枯病”。该病
图5 分离菌株的分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子
Fig.5 Pycnidia,conidiophores and conidia of isolate
a.圆锥形分生孢子器(具一长颈)(×40);b.长颈顶端(×100);c、d.不规则分生孢子器腔(×100);
e.分生孢子梗(×400);f.甲型分生孢子(梭形)(×400);g.乙型分生孢子(线形)(×400)
图6 病菌rDNA ITS序列PCR扩增电泳图谱
Fig.6 PCR amplification pattern of rDNA-
ITS sequences of isolate ZN32and JH12
原菌引起的桃树病害,主要在欧洲、美国、北大西洋等地流行,
造成较大的经济损失。本研究中该病的典型症状是在新梢基
部出现一环形凹陷褐色病斑,而后枝条逐渐枯萎死亡,这与国
外报道结果相一致。
我国对P.amygdali引起的桃溃疡病或枝枯病的研究报
道较少。1989年严东辉[12]最早报道了云南昆明地区由扁桃
壳梭孢F.amygdali(P.amygdali的同物异名)侵染引起的
桃树溃疡病,并对侵染循环进行了研究。该病主要症状是一
年生枝条叶痕和基部形成深褐色病斑,这与本研究枝枯病的
症状相同。此后该病鲜见报道。2011年以来,云南昆明[13]、
浙江嘉兴[14]和上海南汇[15]等地相继报道了桃拟茎点霉引起
的桃溃疡病,病原和病害症状与本研究结果一致,但均以溃疡病进行报道。国外对该病以缢缩性溃疡病
79第4期 纪兆林等:桃枝枯病病原鉴定
或枝枯病进行报道,其原因是该病初期主要症状是在新梢基部形成缢缩性溃疡斑,而在病害发展后期形
成新梢枯死。江苏无锡等地桃农起初称其为“茎基腐病”,但这一称谓易引起歧义,本研究认为采用桃枝
枯病这一中文病害名称更加形象、直观,体现了病害发展后期的症状特点,且与美国现今报道的“枝枯
病”相吻合。由其他病菌引起的桃溃疡病国内也有过报道,吴洵耻等[16]曾报道山东泰安地区由柱枝双
胞霉(Cylindrocladium scoparium Morgan)引起的桃溃疡病,其主要症状是在水蜜桃桃果上形成一种
浅褐色凹陷的溃疡斑。因此作者认为选用桃枝枯病作为中文病害名称较为合适,以便于与其他病原引
起的桃溃疡病相区别。
本研究从嘉兴凤桥镇采集的病样中分离的病菌鉴定结果与方丽等[14]从嘉兴病枝分离物的鉴定结
果相一致,均为桃拟茎点霉。此外,作者在江苏也发现了桃拟茎点霉危害桃树,引起桃枝枯病。为有效
防控桃枝枯病,桃枝枯病菌的生物学特性、发生规律,包括病菌的越冬越夏情况、初侵染、再侵染、传播途
径和方式以及综合治理技术等均需进一步研究。
参考文献:
[1] Lalancette N,Polk D F.Estimating yield and economic loss from constriction canker of peach[J].Plant Disease,
2000,84(9):941-946.
[2] Tuset J J,Portila M T.Taxonomic status of Fusicoccum amygdali and Phomopsis amygdalina [J].Canadian
Journal of Botany,1989,67(5):1275-1280.
[3] 纪兆林,张建军,徐敬友,等.抗腐霉利的灰葡萄孢菌株特性及其竞争能力 [J].扬州大学学报:农业与生命科学
版,2007,28(2):65-68.
[4] 魏景超.真菌鉴定手册 [M].上海:上海科学技术出版社,1979:424-425.
[5] White T J,Bruns T,Lee S.Analysis of phytogenetic relationships by amplification and direct sequencing of riboso-
mal RNA genes[C]//Innis M A.PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications.New York:New York
Academic,1990:315-322.
[6] 戚佩坤,姜子德,向梅梅.中国真菌志:第34卷拟茎点霉属 [M].北京:科学出版社,2007.
[7] Delacroix G.Sur une maladie des amandiers en Provence[J].Buletin Trimestriel de la SociétéMycologique de
France,1905,21(3):180-185.
[8] Daines R H,Dohoon D F,Leone I,et al.Control of Fusicoccumcanker of peach by nutrition,defoliation and pro-
tective fungicides[J].Phytopathology,1958,48:400-407.
[9] Farr D F,Castlebury L A,Pardo-Schultheiss R A.Phomopsis amygdali causes peach shoot blight of cultivated
peach trees in the Southeastern United States[J].Mycologia,1999,91(6):1008-1015.
[10] Uddin W,Stevenson K L,Pardo-Schultheiss R A.Pathogenicity of a species of Phomopsis causinga shoot blight
on peach in Georgia and evaluation of possible infection courts[J].Plant Disease,1997,81(9):983-989.
[11] Lalancette N,Robison D M.Effect of fungicides,application timing,and canker removal on incidence and severity
of constriction canker of peach[J].Plant Disease,2002,86(7):721-728.
[12] 严东辉.桃树溃疡病侵染循环的研究 [J].西南林学院学报,1989,9(2):153-161.
[13] 尹良芬,马琼瑶,陈 育.桃溃疡病的鉴定 [J].西南农业学报,2011,24(5):1748-1752.
[14] 方 丽,熊彩珍,任海英,等.浙江首次发现桃溃疡病 [C]//郭泽建,侯明生.中国植物病理学会2011年学术
年会论文集.北京:中国农业科学技术出版社,2011:177-180.
[15] Dai F M,Zeng R,Lu J P.First report of twig canker on peach caused by Phomopsis amygdali in China[J].
Plant Disease,2012,96(2):288.
[16] 吴洵耻,吕士恩.桃溃疡病病原的研究 [J].山东农业大学学报,1986,17(3):63-66.
(责任编辑 张立元)
89 扬州大学学报(农业与生命科学版) 第34卷