全 文 ：第 42 卷第 21 期
2014 年 11 月
广 州 化 工
Guangzhou Chemical Industry
Vol. 42 No. 21
Nov. 2014
响应面分析法优化黄皮叶中生物碱的提取工艺研究*
李玉珍1，陈 芳1，李中岚1，农小梅2，黎 霜1
( 1 桂林电子科技大学生命与环境科学学院，广西 桂林 541004;
2 广西健瑞生物科技有限公司，广西 桂林 541001)
摘 要:优化了黄皮叶中提取生物碱的工艺条件。在超声波辅助条件下，采用响应面分析法，以超声时间(A)、料液比
(B)、溶媒浓度(C)等为主要影响因素，获得最佳提取工艺条件。结果表明:在超声时间 49 min，料液比 1∶14，溶媒浓度 5. 67%
的条件下，黄皮叶中生物总碱的提取率为:0. 3560%。最佳提取工艺条件可用于指导生产中黄皮叶生物总碱的提取，其超声时间
(A)、料液比(B)、溶媒浓度(C)等对生物总碱提取率的相互影响关系式为:Y = － 1. 31604 + 0. 047721A + 0. 0377930B + 0. 083515C －
1. 85000E － 005AB － 1. 24000E － 004AC － 4. 46000E － 004BC － 4. 73500E － 004A2 － 1. 25900E － 003B2 － 6. 27200E － 003C2。
关键词:响应面分析法(ＲSM) ;黄皮叶;生物碱;超声波辅助法提取工艺
中图分类号:Ｒ 文献标志码:A 文章编号:1001 － 9677(2014)021 － 0070 － 04
* 基金项目:广西自然科学基金 (项目编号:2013GXNSFAA019224) ;教育部与广西药用资源化学与药物分子工程重点实验室开放课题 项目编号:
CMEMＲ2013 － B) ;广西大学生创新计划项目 (项目编号:20121059560)。
通讯作者:黎霜，女 (1968 －) ，壮族，副教授，从事新药研究与开发的教学和科研工作。E － mail:shuangli_ guet@ 163. com
Investigation the Ultrasonic － assistant Extraction Parameters
on Total Alkaloid of Clausenae Folium by ＲSM*
LI Yu － zhen1，2，CHEN Fang1，LI Zhong － lan1，NONG Xiao －mei2，LI Shuang1
(1 School of Life and Environmental Science，Guilin University of Electronic Technology，Guangxi Guilin 541004;
2 Guangxi JianＲui Biological Technology，Co. ，Ltd. ，Guangxi Guilin 541001，China)
Abstract:The central composite design combined with response surface methodology (ＲSM)was applied to optimize
the parameter of ultrasonic － assisted extraction the total alkaloids from Clausenae Folium. The results indicated that the
maximum extract of total alkaloids was 0. 356% by using 5. 67% hydrochloric acid as solvent，extract 49 min at the rate of
material of 1∶14. Effects of the contents of hydrochloric acid，extraction of times，and the rate of material on total
alkaloids yield were Y = － 1. 31604 + 0. 047721A + 0. 0377930B + 0. 083515C － 1. 85000E － 005AB － 1. 24000E －
004AC －4. 46000E － 004BC －4. 73500E － 004A2 － 1. 25900E － 003B2 － 6. 27200E － 003C2.
Key words:ＲSM;Clausenae Folium;alkaloids;ultrasonic － assisted extraction.
黄皮叶为芸香科植物黄皮(Clausena lansium (Lour.)Skeels)
的干燥叶。具有疏风解表、除痰行气、保肝降脂、益智等功
效。常用于感冒发热、咳嗽哮喘、气胀腹痛、疟疾、小便不
利，热毒疥癞、阿尔茨海默病等症状。现收载于《广西中药材
标准》1996 年版中。主产于广西、广东、海南、福建、云南、
台湾等地［1 － 2］。
黄皮叶中富含黄皮酰胺类生物碱，这类生物碱通过抑制
COX － 2 mＲNA 及蛋白的表达起到对大鼠海马的保护作用，
在预防和治疗阿尔茨海默氏症方面展示出良好的药理活
性［3 － 5］。但是对于黄皮叶的研究多集中在种植、药理活性研
究方面。
本文对黄皮叶中总生物碱提取方法进行研究，为工业提取
黄皮叶中总生物碱提供一定的理论参考，进一步提升黄皮叶的
药用价值和食用价值。
1 植物来源及鉴定
黄皮叶于 2012 年 9 月采摘于广西省北海市合浦县，在室温
下自然晾干。经中国科学院广西植物研究所李光照研究员鉴定
为芸香科 (Ｒutaceae)黄皮属 (Clausena)黄皮树的叶。
2 试验方法
2. 1 实验仪器及试剂
仪器:玻璃板，分液漏斗，FY 130 型药物粉碎机，SK
6210LHC型超声波清洗机，WD － 9403A 型紫外分析仪，HHS
型电热恒温水锅，BSA 124S － CW 型电子天平，赛多利斯科学
仪器(北京)有限公司;SHB － B95 型循环水式多用真空泵，郑
州长城科工贸有限公司;T. G. L － 20000 － CＲ 型高速台式冷冻
离心机，上海安亭科学仪器厂;ＲE － 52B型旋转蒸发器，上海
亚荣生化仪器厂。
第 42 卷第 21 期 李玉珍，等:响应面分析法优化黄皮叶中生物碱的提取工艺研究 71
盐酸、无水乙醇、三氯甲烷、氨水、柠檬酸、柠檬酸钠、
薄层层析硅胶 G，青岛海洋化工有限公司;羧甲基纤维素钠
800 － 1200;以上试剂均为分析纯，使用前未纯化。
2. 2 总生物碱含量评价
采用薄层色谱法，以经鉴定的黄皮叶为对照药材，对提取
物中的生物碱含量进行评价［1］。结果显示:紫外光灯(254 nm)
下检视，提取物在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧
光斑点，喷以碘化铋钾试液，提取物在与对照药材色谱相应的
位置上显相同的 3 个橙色斑点，见图 1。
图 1 黄皮叶中总生物碱的薄层色谱图
2. 3 总生物碱提取方法
精密称定黄皮叶细粉约 5 g，置碘量瓶中，加入 5%的盐酸
溶液 50 mL，在设定的温度下进行超声时间提取(超声功率
280 W) ，提取液加氨水调节 pH 值为 9 ～ 10，取滤液于分液漏
斗中，加三氯甲烷 10 mL萃取 2 次，合并三氯甲烷溶液，加水
10 mL洗涤，分取三氯甲烷层，旋干，得残渣，称重。计算黄
皮叶总生物碱的提取率:
总生物碱提取率 = 提取物的质量(g)
黄皮叶细粉的质量(g)
× 100%
2. 4 单因素试验
影响超声波提取黄皮叶中总生物碱的因素较多，本试验考
察了超声时间、料液比、溶媒浓度等 3个因素对黄皮叶中总生物
碱提取率的影响，并分别计算出黄皮叶中总生物碱的提取率。
2. 4. 1 超声时间对黄皮叶中总生物碱提取率的影响
图 2 超声时间对黄皮叶中总生物碱提取率的影响
料液比为 1∶10，体积分数为 5%的盐酸作为提取溶剂，分
别选取超声时间为 30 min、40 min、50 min、60 min、70 min进
行超声提取试验，以观察并计算其对黄皮叶总生物碱提取率的
影响。结果表明:生物碱得率随着提取时间延长而增加，当超
声波提取时间达到 50min时，生物碱的得率最大，之后随超声
处理时间的延长反而下降(图 2)。分析其原因，随着时间的延
长，总生物碱降解，从而降低了提取率。
2. 4. 2 料液比对总生物碱提取率的影响
提取时间为 50 min，体积分数 5%的盐酸为提取溶剂，分
别选取料液比为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，以观察
并计算其对黄皮叶中总生物碱提取率的影响。结果见图 3，初
始，总生物碱的提取率随着料液比增加而升高，在 1∶10 时达
到最大，之后随着料液比增加而减少。生物碱的提取率随着提
取溶剂的增加而增加，原因是液料比越大，细胞内外的浓度差
越大，传质推动力也越大，内扩散的速度越大，越有利于总生
物碱的溶出。但是当液料比增大到 10 倍以后，生物碱的得率
开始减小，说明此时细胞内外生物碱已经达到溶解平衡，生物
碱已经尽可能的转入提取液中，此时如果继续增加提取剂的
量，料液比过大，提取液浓度降低，得率就会减小。
图 3 料液比对黄皮叶中总生物碱提取率的影响
2. 4. 3 溶媒浓度对总生物碱提取率的影响
提取时间为 50 min，料液比 1∶10，体积分数 5%的盐酸为
提取溶剂，分别选取盐酸的浓度为 2. 5%、5%、7. 5%、10%、
12. 5%，以观察并计算其对黄皮叶总生物碱提取率的影响。结
果见图 4，黄皮叶总生物碱的得率随着盐酸浓度的增加而升高，
当盐酸浓度达到 5%时，总生物碱的得率随着浓度的增大而减
小，盐酸浓度为 5%时，总生物碱得率最高。由于随盐酸溶液
浓度的增加，提取液结合生物碱的能力不断减弱，总生物碱提
取率减小。
图 4 溶媒浓度对黄皮叶中总生物碱提取率的影响
2. 5 黄皮叶生物总碱提取方案的设计
应用 Design Expert 8. 0. 6 软件，根据 Box － Behnken 中心组
合实验设计原理，综合单因素试验结果，可初步确定超声时间
(A)、料液比(B)、溶剂浓度(C)3 个参数的量，在此基础上采
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用 3 因素 3 水平的 Box － Behnken 试验设计法进行中心组合试
验。以黄皮叶中总生物碱提取率为响应值，通过响应面分析，
得出超声波提取黄皮叶中总生物碱的最佳提取工艺条件和方
法。实验设计因素编码及水平见表 1 (每个因素的低、中、高
水平分别记作 － 1、0、1)。
表 1 Box － Behnken试验设计因子水平表
水平
因素
(A)超声
时间 /min
(B)料液比 /
(mL∶g)
(C)溶剂
浓度 /%
－ 1 40 5 2. 5
0 50 10 5
1 60 15 7. 5
3 结果与讨论
3. 1 提取工艺参数的评价
根据单因素试验结果，采用响应面分析法对超声波辅助提
取黄皮叶中总生物碱的三个主要因素:超声时间、料液比和溶
剂浓度等进行优化。各条件下的提取率见表 2，总生物碱提取
率的二次响应面回归模型方差分析见表 3。
表 2 超声辅助提取黄皮叶总生物碱中
影响因素对提取率的影响
编号
(A)超声
时间 /min
(B)料液比 /
(mL∶g)
(C)溶剂
浓度 /%
总生物碱
得率 /%
1 40 5 5 0. 2116
2 40 10 7. 5 0. 2976
3 60 10 7. 5 0. 2837
4 50 15 2. 5 0. 3060
5 40 15 5 0. 3162
6 50 5 2. 5 0. 2057
7 60 10 2. 5 0. 2113
8 60 15 5 0. 3047
9 60 5 5 0. 2038
10 50 15 7. 5 0. 3176
11 50 5 7. 5 0. 2396
12 40 10 2. 5 0. 2128
13 50 10 5 0. 3376
14 50 10 5 0. 3407
15 50 10 5 0. 3357
16 50 10 5 0. 3387
17 50 10 5 0. 3368
表 3 方差分析结果
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P － value 显著性
模型 0. 047 9 5. 198E － 003 21. 20 0. 0003 significant
A 1. 505E － 004 1 1. 505E － 004 0. 61 0. 4591
B 0. 018 1 0. 018 75. 08 ＜ 0. 0001 ＊＊
C 5. 136E － 003 1 5. 136E － 003 20. 94 0. 0026 ＊＊
AB 3. 423E － 006 1 3. 423E － 006 0. 014 0. 9093
AC 3. 844E － 005 1 3. 844E － 005 0. 16 0. 7040
BC 1. 243E － 004 1 1. 243E － 004 0. 52 0. 4995
A2 9. 641E － 003 1 9. 440E － 003 39. 60 0. 0004 ＊＊
B2 4. 305E － 003 1 4. 171E － 003 17. 50 0. 0041 ＊＊
C2 6. 636E － 003 1 6. 470E － 003 27. 14 0. 0013 ＊＊
残差 1. 717E － 003 7 2. 452E － 004 significant
失拟检验 1. 654E － 003 3 5. 513E － 004 35. 22 0. 00025
纯误差 6. 262E － 005 4 1. 566E － 005
总误差 0. 048 16
由表 3 可以知道，模型的 F = 21. 20 ＞ 10. 16，P = 0. 0003 ＜
0. 01，说明本实验所选用的二次多项模型具有高度的显著性。
黄皮叶总生物碱 F失拟 = 35. 22 ＞ 8. 81，失拟项 P = 0. 0025 ＜
0. 05，失拟显著。模型的确定系数 Ｒ2 = 0. 9646，表明其因变量
与全体自变量之间的多元回归关系显著，即回归方程能够较好
地模拟真实曲面，该试验方法是可靠的，可以用该模型对黄皮
叶总生物碱提取率进行分析和预测。模型的调整确定系数
Ｒ2Adj = 0. 9191，意味着该模型能解释 91. 91%试验数据的变异
性。因而该模型拟合程度较好，试验误差较小，可以用此模型
来分析和预测超声波辅助提取黄皮叶总生物碱的工艺结果。
此外根据表 3 还可以得出，在总的作用因素中，回归方程
一次项、二次项及交互项 AB 均具有较高的显著性，表明提取
时间、料液比和溶剂浓度的交互作用对黄皮叶总生物碱提取率
有较显著影响，且得出各因素影响黄皮叶总生物碱提取率的显
著性顺序依次为:料液比 ＞溶剂浓度 ＞提取时间。
试验结果以总生物碱提取率为响应值，利用 Design －
Expert8. 0. 6 软件对数据进行多元回归拟合，得到黄皮叶中总生
物碱提取率(Y)对提取时间(A)、液料比(B)和溶媒浓度(C)的
二次多项回归模型:
Y = － 1. 31604 + 0. 047721A + 0. 0377930B + 0. 083515C －
1. 85000E － 005AB － 1. 24000E － 004AC － 4. 46000E － 004BC －
4. 73500E － 004A2 － 1. 25900E － 003B2 － 6. 27200E － 003C2
3. 2 超声时间、料液比、溶剂浓度对黄皮叶总生物
碱提取率的交互影响分析
利用 Design Expert软件对表 2 中的数据进行二次多元回归
拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线图如图 5 ～
图 7 所示。ＲSM的图形是特定的响应面 Y对应于因素 A、B、C
值构成的 1 个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反
映各因素对响应值的影响，从所得响应面分析图上可以分析出
其间的相互作用。若等高线形状趋向于椭圆形，表明交互项对
响应值作用显著，等高线形状趋向于圆形，则表明交互项对响
应值作用较弱。由图 5 ～图 7 可知，料液比和溶剂浓度的等高
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线形状趋于椭圆形，表明二者的交互作用明显，而提取时间和
料液比、提取时间和溶剂浓度的等高线趋于圆形，说明其交互
项对响应值影响不大。根据所得到的模型，预测超声波辅助提
取黄皮叶中总生物碱最优工艺条件为:提取时间 49. 38 min，
料液比 1∶13. 64，溶剂浓度 5. 67%，在此条件下，黄皮叶总生
物碱提取率理论上可达 0. 35990%。但考虑到实际操作的局限
性，将超声波辅助提取黄皮叶总生物碱的优化工艺参数修正
为:提取时间 49 min，料液比 1∶14，溶剂浓度 5. 7%。
图 5 超声时间和料液比对总生物碱提取率影响的
等高线图(a)和响应面图(b)
图 6 超声时间和溶剂浓度对总生物碱提取率影响的
等高线图(a)和响应面图(b)
图 7 料液比和溶剂浓度对总生物碱提取率影响的
等高线图(a)和响应面图(b)
3. 3 响应面法优化超声波提取验证试验
按照 ＲSM 优化修正工艺，在修正条件下进行 3 次平行提取
实验，得到超声波辅助提取黄皮叶总生物碱的提取率平均值为
0. 3560%。回归方程所得预测值为 0. 3599%，与验证实验平均
值 0. 3560%的误差仅为 0. 39%。因此，利用响应面分析方法优
化得到的提取工艺参数具有实用价值。
4 结 论
通过响应面分析，获得黄皮叶总生物碱的最佳提取工艺条
件为:超声时间为 49 min，料液比为 1∶14，溶媒浓度 5. 67%
的条件下，黄皮叶中生物总碱的提取率可达到 0. 3560%;超声
时间(A)、料液比(B)、溶媒浓度(C)等对生物总碱提取率的
相互影响关系式为:
Y = － 1． 31604 + 0． 047721A + 0． 0377930B + 0． 083515C －
1． 85000E － 005AB － 1． 24000E － 004AC － 4． 46000E － 004BC －
4． 73500E － 004A2 － 1． 25900E － 003B2 － 6． 27200E － 003C2
参考文献
［1］ 广西中药材标准［S］． 广西科学出版社，1996:205．
［2］ 国家中医药管理局中华本草编委会．中华本草［M］． 上海:上海科
学技术出版社，1999:867．
［3］ 李晓波，张荣，王宁生． 黄皮叶提取物对非酒精性脂肪肝大鼠的降
脂保肝作用研究［J］． 中药新药与临床药理，2012，23(04) :405 －
408．
［4］ 侯软玲，董献红，李娜娜，等． 黄皮酰胺对糖尿病大鼠海马 COX － 2
mＲNA 及蛋白质表达的影响［J］． 中国药理学通报，2010，26(6) :
807 － 810．
［5］ 张静，程勇，张均田，等． 左旋黄皮酰胺对冈田酸和 β淀粉样肽 25 －
35 神经毒性的保护作用［J］．药学学报，2007，42(9) :935 － 942．