全 文 ：食品工业科技 研究与探讨
ScienceandTechnologyofFoodIndustry
110　 2009年第 01期
黄皮叶不同溶剂提取物抗过敏活性研究
赵丰丽 ,李洁荣 ,杨健秀
(广西师范大学生命科学学院 ,广西桂林 541004)
摘　要:研究了黄皮叶的化学成分和抗过敏活性 ,用不同溶剂提取黄皮叶活性成分 ,并进行化学成分预实验和 HPLC
分析 ,通过透明质酸酶抑制实验法评价其抗过敏活性 ,并对水提物抗过敏活性的剂量-效应关系进行分析 。结果显示 ,
提取物中含有酚类 、黄酮 、生物碱 、有机酸 、香豆素等成分 。水和乙醇提取物对透明质酸酶的抑制率分别为 89.3%和
75.3%,石油醚提取物没有抑制作用 。纯化物 A1和 B1的抑制率分别为 92.6%和 95.9%,且 B1在 0.5～ 8.0mg/mL浓度
范围内 ,随浓度增加 ,抗过敏作用加强 ,呈明显的剂量-效应关系。与广西甜茶相比 ,抗过敏活性明显高于甜茶 。 HPLC
分析显示 ,抗过敏主要成分为酚类和黄酮。
关键词:黄皮叶 ,化学成分 ,预实验 , HPLC,抗过敏
StudyonantialergicactivityofClausenalansium
(Lour.)Skeelsleavesextractswithdifferentsolvent
ZHAOFeng-li, LIJie-rong, YANGJian-xiu
(ColageofLifeScience, GuangxiNormalUniversity, Guilin541004 , China)
Abstract:ThechemicalcompositionandantialergicactivityofClausenalansium(Lour.)Skeelsleaveswere
studied.Activitycompositionwasextractwithdiferentsolvent.HPLCanalysisandthepre-experimentofchemical
compositionwithdiferentsolventextractionwereprosecution.Antialergicactivitiesofextractswereinvestigatedby
measuringtheirinhibitoryefectsonhyaluronidase.Theactivecomponentsofaqueousextracts, dose-efect
relationshiphadalsobeenstudied.Theresultshowedthatextractscontainedphenolic, flavones, alkaloid, organic
acid, coumarins, etc.TheanalysisofHPLC demonstratedthattheantialergiccomponentsmainlycontained
phenolicandflavones.Theinhibitoryratesofaqueousextractsandethanolextractsonhyaluronidasewere89.3%,
75.3%.Thepetroleumetherextractsdidnothaveinhibitoryeffect.TheinhibitoryrateofpurificationA1 andB1 on
hyaluronidasewere92.6%, 95.9%.AntialergicactivityofB1 wasincreasedwithconcentrationat0.5～8.0mg/mL.of
Therewasastrikingdose-efectrelationshipandantialergicactivitywasstrongerthantheextractofsweettea.The
aqueousextractsofClausenalansium(Lour.)Skeelsleafhadapreferableefectofantialergicactivity, soitcanbe
empolderedastheantialergicactivityproduction.
Keywords:Clausenalansium(Lour.)Skeelsleaf;chemicalcomposition;pre-experiment;HPLC;antialergicactivity
中图分类号:TS201.2　　　　文献标识码:A　　　　文 章 编 号:1002-0306(2009)01-0110-04
收稿日期:2008-05-20
作者简介:赵丰丽(1961-),女 , 硕士 ,副教授 ,研究方向:发酵工程及
生物活性物质的研究与利用。
　　过敏反应是指一部分人对某些食物 、动物皮毛 、
花粉 、化学物质等有异常的免疫反应。根据免疫反
应机制 ,过敏反应分为 Ⅰ型 、Ⅱ型 、Ⅲ型和Ⅳ型 ,大多
数过敏反应是与体内透明质酸酶活性有关的 Ⅰ型过
敏反应 [ 1 , 2 ] 。目前药物治疗主要采用抗组胺药及过
敏介质阻释剂 ,但有嗜睡 、口干 、恶心等不良反应 。
因此 ,从天然产物中发现和筛选对人体无副作用的
抗过敏成分越来越受到人们的青睐 。目前已有对甜
茶 、紫苏 、地榆与桂枝等天然抗过敏物质的研究 [ 1, 3, 4 ] 。
黄皮 [ Clausenalansium(Lour.)Skeels]属芸香科植物 ,
原产我国南部。黄皮叶苦 、辛 、性平 ,有解表散热 、顺
气化痰的功能 , 用于感冒 、流感 、疟疾 、支气管炎
等 [5 , 6 ] 。目前有关黄皮的研究内容多集中在抑菌方
面 [7 , 8 ] ,而有关抗过敏的研究尚未见报道。本研究以
透明质酸酶抑制率为指标 ,对黄皮叶不同溶剂提取
物进行抗过敏作用初探。在此基础上对提取物进行
纯化和定性鉴定 ,并进行抗过敏量效活性研究 ,同时
与甜茶抗过敏效果进行比较 ,以期为植物源抗过敏
药物的开发和黄皮叶的综合利用提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
黄皮叶　采于广西桂林市郊;乙醇 、石油醚 、硝
酸铋 、氯化汞 、碘化钾 、镁粉 、三氯化铝 、氢氧化钠 、三
氯化铁 、溴酚蓝 、香草醛 、碘 、盐酸 、浓氨水 、磷钼酸 、
浓硫酸 、氯仿等 　均为分析纯;D101、DM130大孔
树脂 。
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2009.01.097
研究与探讨 食品工业科技
Vol.30 , No.01 ,2009
2009年第 01期 111　
Waters515高效液相色谱仪 , KQ-500DE型数控
超声波清洗器 , UV-1201紫外可见分光光度计 ,
HWS26型电热恒温水浴锅 , TDL-40B型台式离心
机 , RE-52A旋转蒸发仪 , LGJ-10冷冻干燥机等 。
1.2　实验方法
1.2.1　黄皮叶活性物质的提取　黄皮叶中不同极性
活性物质的提取 ,按化学成分预实验法 [ 9] ,分别采用
水 、乙醇 、石油醚为提取溶剂。
黄皮叶干燥 、粉碎 、过 40目筛 。取 10g置于三角
瓶中 ,按料液比 1∶15分别加入不同溶剂 ,在超声功率
为 300W、时间 20min、室温的条件下 ,超声提取两次 ,
过滤 、合并滤液 ,减压蒸馏回收溶剂 ,得浸膏 ,用水定
容至 100mL,备用(用于抗过敏实验)。广西甜茶抗
过敏物质用水提取 ,工艺同上。
1.2.2　不同溶剂提取物化学成分的初步鉴定　采用
化学成分预实验的方法对提取物的化学成分进行初
步鉴定 [ 9] 。采用试管法对黄酮 、酚类 、有机酸 、生物
碱 、甾体 、萜类 、挥发油 、香豆素等成分进行定性
鉴定。
1.2.3　抗过敏活性的评价
1.2.3.1　抗过敏活性的测定　黄皮叶 、甜茶提取物抗
过敏活性的测定均采用透明质酸酶体外抑制实验
法 , 即 E1son-Morgan法 (Blix修改法)[ 10 , 11 ] 。将
0.1mL的 2.5mmol/LCaCl2 加入 0.5mL透明质酸酶
(500U/mL)中 , 37℃保温 20min;加入样品液 0.5mL,
37℃保温 20min;加入透明质酸钠(0.4mg/mL)2mL,
37℃保温 40min, 加入乙酰丙酮溶液 (乙酰丙酮
1.5mL,溶于 50mL1.25mol/L碳酸钠溶液中 ,用时配)
1mL, 90℃保温 1h,用水冷却 ,慢慢加入 96%的乙醇
10mL,然后加入 Ehrlich试剂(1.6gDMAB溶于 30mL
浓盐酸和 30mL96%乙醇中)1.0mL,混合均匀 ,室温
放置 1h后 ,于 530nm处测定吸光值 。
透明质酸酶抑制率 (%)=[ (A-B)-(C-D)] /
(A-B)×100%
式中:A—对照溶液(去离子水代替样品)的 OD
值;B—对照空白溶液(酶钝化 、去离子水代替样品)
的 OD值;C—试样溶液的 OD值;D—试样空白(酶
钝化 、各种试剂)的 OD值 。
1.2.3.2　抗过敏能力的评价　为便于对样品抗过敏
活性进行评价 ,参照国际标准 [ 10 ] ,将抗过敏作用分为
以下 4级:抑制率≥70%为强抗过敏作用;抑制率≥
50%为中等抗过敏作用;30%≤抑制率 <50%为弱
抗过敏作用;抑制率 <30%为无抗过敏作用。
1.2.4　抗过敏有效成分的纯化　对透明质酸酶抑制
率最高的水提液 ,根据化学成分预实验结果 ,可知其
抗过敏成分是酚类和黄酮 [ 12 , 13 ] ,选择合适型号的大孔
树脂 (DM130和 D101), 对多酚 [ 12 ]和黄酮 [13] 进行
纯化。
1.2.4.1　样品的提取　取 5g黄皮叶 ,按 1.2.1方法提
取 ,得水提物浸膏 , 用洗脱剂 (70%乙醇 )定容至
50mL,备用。
1.2.4.2　层析柱的制备及洗脱 [ 12, 13] 　DM130和 D101
型大孔吸附树脂层析柱的制备参考文献 [ 12, 13] 。
洗脱:分别取 10mL水提取液上柱 ,依次用蒸馏水 、
70%乙醇梯度洗脱 ,洗脱体积分别为 3、2BV,流速为
1BV/h。自动部分收集器收集 , 2min/管 。依次收集
洗脱组分 ,并用 1%的三氯化铁(紫色为多酚的显色
反应)和盐酸镁粉(紫褐色为黄酮的显色反应)检测
流出物 ,呈现不同颜色反应的分开接 ,至流出液无多
酚 、黄酮的特征反应(其中流出物多酚为 A1、黄酮
B1)。减压浓缩 ,冷冻干燥得纯品。
1.2.5　洗脱物含量的测定
1.2.5.1　多酚含量的测定 　以单宁酸为标样 ,采用
Folin-Ciocaltea法测定酚类含量 [ 14] 。在 760nm下测
吸光值 ,根据标准曲线计算总酚含量。
1.2.5.2　黄酮含量的测定　以芦丁为标样 ,采用络合
分光光度法在 510nm下测吸光值 , 测得总黄酮
含量 [ 15 ] 。
1.2.6　纯化物抗过敏实验　取洗脱物 A1、B1各 0.8g,
溶于 100mL去离子水中 , 分别稀释为 8、 4、 2、 1、
0.5mg/mL等不同浓度的供试溶液 ,采用 1.2.3中方法
进行抗过敏实验。
1.2.7　抗过敏活性成分的 HPLC分析及外标法鉴定
1.2.7.1　样品前处理及测定　黄皮叶的提取同 1.2.1,
取提取液 10mL,用流动相(甲醇-水为 8∶2)定容到
100mL,经 0.45nm微孔滤膜过滤 、超声脱气后进样测
定 ,以标准溶液峰的保留时间定性 。
1.2.7.2　色谱条件　SunFireC18(4.6 ×25mm, 5μm)
色谱柱 ,流动相甲醇-去离子水(8∶2),梯度洗脱 ,流
速 1.0mL/min,进样体积 10.0μL,柱温 25℃,检测波
长 275nm。
以同样的条件测定标准品没食子酸 、单宁酸和
黄酮 。
2　结果与分析
2.1　不同溶剂提取物化学成分的初步鉴定
水 、乙醇 、石油醚提取物化学成分预实验的结果
见表 1。
表 1　提取物化学成分预实验结果
提取液 检查项目 试管预实验法 结果
乙醇
乙醇
乙醇
乙醇
乙醇
石油醚
石油醚
石油醚
水
水
水
水
生物碱
黄酮
酚类
有机酸
香豆素
挥发油
甾体
萜类
酚类
生物碱
有机酸
黄酮
碘化铋钾实验
三氯化铝
三氯化铁
溴酚蓝反应
氢氧化钠—盐酸法
磷钼酸乙醇法
氯仿-浓硫酸法
磷钼酸乙醇法
香草醛—盐酸反应
碘化碘钾实验
溴酚蓝反应
盐酸镁粉实验
++
+
+
++
++
+
++
+
++
+
+
++
注:+表示有;++表示有并且含量多;没有的不列出。
　　表 1结果显示 ,黄皮叶乙醇提取物中含有较多
的生物碱 、有机酸和香豆素;石油醚提取物中主要含
有挥发油 、甾体和萜类等物质;水中含有较多的酚类
和黄酮类物质 。
2.2　黄皮叶不同溶剂提取物 、甜茶提取物抗过敏实
验结果
食品工业科技 研究与探讨
ScienceandTechnologyofFoodIndustry
112　 2009年第 01期
表 2　黄皮叶 、甜茶提取物抗过敏实验结果
提取溶剂 水 乙醇 石油醚 甜茶水提取物
抑制率(%) 89.3 75.3 -23.3 61.2
　　表 2结果显示 ,几种提取物抗过敏作用大小的
顺序为:水 >乙醇 >甜茶水提取物 ,而石油醚提取物
则没有抗过敏作用。说明黄皮叶抗过敏活性多为极
性较大的物质 ,并且比甜茶的抗过敏活性高 。由 2.1
可知 ,水提取物中酚类和黄酮类物质含量较高 ,而这
两类物质是具有抗过敏作用的物质 [ 3, 4 ] ,因此 ,对它们
进行分离纯化 ,并进行进一步的实验 。
2.3　抗过敏成分纯化 、含量测定及抗过敏实验
水提取物分别用大孔树 DM130和 D101进行分
离纯化 ,得到 2种组分 ,命名为 A1 和 B1。经测定 , A1
酚类含量为 141.62mg/L, B1 黄酮含量为 212.71mg/L。
透明质酸酶抑制率的测定结果 A1 为 92.6%、B1 为
95.9%。
2.4　水提纯化物组分 B1抗过敏量效实验结果
选择抗过敏作用较强的 B1进行抗过敏量效实
验 ,结果见图 1。
图 1　抗过敏量效实验结果
图 1结果表明:黄皮叶水提物的抗过敏作用在
0.5～ 8mg/mL范围内 ,随浓度的增加 ,对透明质酸酶
的抑制作用增大 ,最大清除率可达 93.3%。对其曲
线采用 Excel的多项式回归得到回归方程:y=
-1.5562x2 +22.578x+12.082, R2 =0.9938。式中 ,
y:抑制率(%);x:浓度(mg/mL),说明抑制率与浓度
线相关性较好。经计算 , IC50 =1.94mg/mL,表明抗过
敏活性显著 。
2.5　抗过敏活性成分的 HPLC分析及外标法鉴定
用 HPLC色谱法定性鉴定水提物 、没食子酸 、单
宁和芦丁标准品 ,结果见图 2～图 5。
图 2　没食子酸的色谱图
由图 2 ～图 5可以看出 , 标准芦丁的 tR =
2.918min、标准没食子酸的 tR=3.151min、单宁酸 tR =
4.210min,没有经过纯化的样品分离出 6个组分峰 ,
保留时间依次为 2.382、 2.557、 2.845、 3.504、 3.669、
3.969min。根据外标法原理 ,其鉴定规则为:t标 =t样 ,
即样品峰的保留时间与标准品的出峰的保留时间一
致 ,则说明样品中极可能含有标准品这种物质。比
较标准品和样品的保留时间 ,可以发现本实验样品
分离的三个组分与芦丁 、没食子酸和单宁酸的保留
时间极为相似 。因此 ,可以认为样品中含有这三类
物质 ,而其它几种成分目前尚未找到合适的标准品
来定性 ,故为未知组分。
3　结论
3.1　实验结果表明 ,水 、乙醇粗提取物都具有较强的
抗过敏作用 , 对透明质酸酶的抑制率分别达到了
89.3%和 75.3%,而石油醚提取物无抗过敏作用。水
提物纯化后抑制率进一步提高 ,组分 A1为 92.6%、组
分 B1为 95.9%。同时与甜茶抗过敏结果进行比较 ,
甜茶为 61.2%,表明黄皮叶提取物的抗过敏作用显
著。与其他具有抗过敏天然产物相比 [2 ]含量高 ,因
此 ,具有较好的开发前景 。
3.2　纯化物抗过敏量效实验结果表明 ,黄皮叶水提纯
化物抗过敏活性随剂量增加 ,抗过敏活性显著提高。
3.3　化学成分预实验 、HPLC色谱定性鉴定以及大
孔树脂纯化物抗过敏实验可知 ,主要抗过敏成分为
酚类和黄酮类物质 。
3.4　黄皮叶提取物抗过敏作用及有效成分已初步确
定 ,但抗过敏的单一成分提取优化条件尚未进行 ,乙
醇提取物的抗过敏的单一成分还没有确定 ,今后将
继续这方面的研究工作 ,以期最终走向实际应用 。
(下转第 115页)
研究与探讨 食品工业科技
Vol.30 , No.01 ,2009
2009年第 01期 115　
表 6。常温保藏 5d后 ,分别以感官评分及检测糊化
度来评价 ,结果见表 7。
表 6　L9(34)正交实验因素水平表
水平
因素
A淀粉量
(g)
B水量
(mL)
C明矾量
(g)
D变性淀粉量
(g)
1 40 175 0.25 5
2 50 200 0.30 6
3 60 225 0.35 7
表 7　正交实验结果分析
实验号 A B C D 感官评分(分)
糊化度
(%)
1 1 1 1 1 86 84
2 1 2 2 2 82 85
3 1 3 3 3 95 87
4 2 1 2 3 78 92
5 2 2 3 1 89 92
6 2 3 1 2 92 90
7 3 1 3 2 69 96
8 3 2 1 3 68 95
9 3 3 2 1 80 96
感 k1 87.667 77.667 82.000 85.000
官 k2 86.333 79.667 80.000 81.000
评 k3 72.333 89.000 84.333 80.333
分 R 15.334 11.333 4.333 4.667
糊
化
度
k1 85.333 90.667 89.667 90.667k2 91.333 90.667 91.000 90.333k3 95.667 91.000 91.667 91.333
R 10.334 0.333 2.000 1.000
　　根据表 7感官评价的直观分析可知 ,各因素对
绿豆凉粉的影响顺序为:A>B>D>C;最佳配方组
合为 A1B3C3D1 。而根据检测糊化度的直观分析可
知 ,各因素对绿豆凉粉的影响顺序为:A>C>D>C;
最佳配方组合为 A3B3C3D3 。综合考虑确定最佳配方
组合为 A2B3C3D1 ,即绿豆淀粉 50g,水 225mL,明矾
0.35g,变性淀粉 5g。
2.6　产品标准
制成的凉粉要求色泽清白 ,软中有韧 ,清凉 ,咸
香 ,爽口 。
3　结论
通过单因素实验和正交实验 ,并进行综合考虑
确定最佳配方组合为 A2B3C3D1 ,即绿豆淀粉 50g,水
225mL,明矾 0.35g,变性淀粉 5g。制得的成品形态美
观 ,色泽良好 ,晶莹透亮 ,软硬适度 ,口感润滑;并且
其货架期在常温下可由 1d延长到 5d。
参考文献:
[ 1]谢英彪 ,颜培增 ,刘光隆 .食物营养与食疗宝典 [ M] .北
京:北京人民军医出版社 , 2007.
[ 2]胡国华 .食品添加剂在豆制品中的应用 [ M] .北京:化学
工业出版社 , 2005, 8.283.
[ 3]陈开元 .食疗处方百科大全 [ M] .河北:河北科学技术出
版社 , 2005.394.
[ 4]蔡育发 .新潮调味品和港式海派菜 [ M] .上海:上海科学
出版社 , 2001.72.
[ 5]王抒 .食物性能歌括 400味 [ M] .长春:吉林科学技术出
版社 , 2002.287.
[ 6]张友松 .变性淀粉生产与应用手册 [ M] .北京:中国轻工
业出版社 , 1999.322～ 323.
[ 7]肖桂林 .美味豆制品菜 600款 [ M] .北京:原子能出版
社 , 2003.287.
[ 8]张燕萍 .变性淀粉制造与应用 [ M] .北京:北京化学出版
社 , 2007.
[ 9]张水华 .食品分析 [ M] .北京:中国轻工业出版
社 , 2004.143.
[ 10]王钦德 , 杨坚 .食品实验设计与统计分析 [ M] .北京:中
国农业大学出版社 , 2003.
(上接第 112页)
参考文献:
[ 1] 王永奇 , 梁文波 ,邢福有 , 等 .紫苏抗过敏 ·炎症的研究
[ J] .大连大学学报 , 2000, 21(4):72～ 76.
[ 2] 苏学素 , 陈宗道 ,焦必林 , 等 .我国常见食物及其成分的
抗过敏作用研究 [ J] .西南农业大学学报 , 2002, 22(1):
77～ 80.
[ 3] 韦保耀 , 高程海 ,滕建文 .广西甜茶中抗过敏性成分的研
究 [ J] .食品科技 , 2006(5):139～ 142.
[ 4] 黄丽 , 冯志臣 ,韦保耀 ,滕建文 .地榆与桂枝抗过敏作用
的研究 [ J] .食品科技 , 2007(6):135～ 138.
[ 5] 吴征镒 , 周太炎 ,肖培根 .新华本草纲要(第 2册)[ M] .
上海:上海科学技术出版社 , 1988.
[ 6] 肖培根 , 连文琰 .中药植物原色图鉴 [ M] .北京:中国农
业出版社 , 1999.
[ 7] Chakraborty A, Saha C, Podder G, etal.Carbazole
AlkaloidwithAntimicrobialActivityfromClausenaheptaphylla
[ J] .Phytochemistry, 1995, 38(3):787～ 789.
[ 8] 刘序铭 ,万树青.黄皮不同部位(E)-N-(2-苯乙基)肉
桂酰胺的含量及杀菌活性 [ J] .农药 , 2008, 47(1):15～ 16.
[ 9] 裴月湖 .天然药物化学实验 [ M] .北京:人民卫生出版
社 , 2007.134～ 146.
[ 10] YuminMaeda, etal.Inhibitoryefectofteaextractson
hyaluronidase[ J] .FoodHygSocJapan, 1990, 31(3):233～ 237.
[ 11] 张惟杰 .糖复合物生化研究技术 [ M] .浙江大学出版
社 , 2006.18～ 19.
[ 12] 黄绍华 , 严慧和 ,孙健 .单宁的提取与纯化 [ J] .南昌大
学学报 , 2000(6):31.
[ 13] 成晓迅 , 杨峻山 ,任风芝 , 等 .柿叶总黄酮的大孔树脂分
离纯化工艺研究 [ J] .河北化工 , 2006, 29(8):59～ 61.
[ 14] 杨秀平 , 尉芹 ,辛转霞 , 高爱琴 .单宁提取与测定实验的
改进 [ J] .科教文汇 , 2007(2):100.
[ 15] 毛根年 , 许牡丹 .功能食品生理特性与检测技术 [ M] .
北京:化学工业出版社 , 2005.557～ 558.