全 文 ：超声波辅助法提取细叶黄皮叶总黄酮及其
清除羟自由基活性的测定
苏秀芳1 , 　郭　青2 , 　甘海妹1 , 　黄智想1
(1.广西民族师范学院化学与生物工程系 , 广西崇左 532200;2.江苏省食品药品检验所 , 江苏南京 210008)
摘　要:对超声波法提取细叶黄皮叶中黄酮类物质进行了研究 ,通过单因素及 L 9(34)正交实验 ,最
佳提取工艺条件为 A1B 3C3D3 ,即:温度 60 ℃,乙醇浓度60 %,超声波功率90 W ,料液比 1∶25 ,提
取时间 70 min 。此条件下细叶黄皮叶总黄酮提取率达 5.730 %。在设置的 5个质量浓度梯度下 ,
总黄酮提取液对羟自由基的清除效果与其质量浓度呈正相关 ,当样品质量浓度为 0.694 g/L 时 ,其
清除率达 49.1 %。
关键词:细叶黄皮叶;总黄酮;超声波辅助提取;羟自由基
中图分类号:O 657 .32　　　文献标志码:A
文章编号:0367-6358(2011)07-0420-04
Ultrasonic-assisted Ex traction Technology and Hydroxy Radical Scavenging
Activity of T otal Flavonoids from the Leaves of Clausena Anisum-olens
SU Xiu-fang1 , 　GUO Qing 2 , 　GAN Hai-mei1 , 　HUANG Zhi-xiang 1
(1 .Depar tment o f Chemistr y and B iolog ica l Eng ineering , Guang xi Normal Universty for
Nationa li t ies , Guang xi , Chong zuo532200 , Ch ina;
2 .J iang su In sti tu te for Food and Drug Contro l , J ian gsu Nanj ing 210008 , Ch ina)
Abstract:The ult rasonic-assisted ex t raction of f lavonoids in the leaves of Clausena anisum-olens was
studied.The single facto r and orthogonal design methods L9(34)we re applied for obtaining the optimal
techno logical conditions:temperature at 60 ℃,60 % e thanol , ratio of material to liquid=1 ∶25 , powe r o f
90 W , and ex t ract ion time of 70 min.U nde r the optimal conditions , the ext ract ion percent of to tal
f lavonoids w as about 5.730 % f rom the leaves of Clausena anisum-olens .The re w as a po sitive correlation
betw een hydro xy l radical scavenging activity and concentration of total f lavonoids f rom the leaves o f
Clausena anisum-olens .The hydroxy l radical scavenging rate at the concentration level of 0.649 g/ L w as
49 .1%.
Key words:leaves of Clausena anisum-olens ;total f lavonoids;ult rasonic-assisted ex t raction;hydroxy f ree
radical
收稿日期:2010-10-18
基金项目:广西自然科学基金项目(2010GXNSFA013050)
作者简介:苏秀芳(1971～ ),女 ,壮族 ,广西扶绥人 ,副教授 ,硕士 ,主要从事天然产物活性成分的提取 、分离 、鉴定及药理活性研究。
E-mai l:suxiu fang 88@sina.com
　　芸香科柑桔亚科黄皮属细叶黄皮 Clausena
anisum-olens (Blanco.)Merr ,为多年生常绿大灌木
或小乔木 ,我国广西西南部 、云南南部 、广东有分布 ,
国外主要分布于菲律宾[ 1] 。细叶黄皮为广西西南部
近几年大力推广种植的经济树种 ,龙州县为主要产
区。其果实可食用 ,具有消积去滞 、祛痰化气 、疏通
·420· 化　　学　　世　　界　 2011 年
肠胃等作用 ,枝叶可作草药 ,祛风除湿[ 1] 。
研究表明 ,细叶黄皮植物含有酸类 、黄酮类等成
份 。汪云松[ 2] 等从细叶黄皮中提取分离了 5个化合
物 ,分别为 4-(3-甲氧苯基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)-
2-丁酮 , 3-(4-羟基苯)-2-丙烯酸 , 3-(3-甲氧苯基-4-
羟基)-2-丙烯酸 , 3-(3 ,4-二羟苯基)-2-丙烯酸甲酯 ,
3-羟基-4-甲氧基苯甲酸。Wang[ 3] 等从细叶黄皮中
提取到 7个化合物 ,分别为异莨菪亭 、伞形花内酯 、
葡萄内酯 、7-[ (E)-7-羟基-3, 7-二甲基-2,5-二烯氨
基 ] 香 豆 酰 、 anisuma rin 、 anisocoumarin H 及
capnolactone。
苏秀芳[ 4 , 5] 等研究表明 ,细叶黄皮各个部位均
含有丰富的挥发油 ,其主要成分为:芳香类 、烯类及
酸类 ,细叶黄皮果仁还具有较强的清除自由基的作
用 。有关细叶黄皮叶总黄酮的提取及其清除自由基
的研究作者鲜见报道 ,本文对细叶黄皮叶中的总黄
酮进行超声波提取工艺及清除自由基·OH 的实验
研究。
1　实验部分
1.1　材料和仪器
UV-1601型紫外可见分光光度计(北京瑞利分
析仪器公司);JA1003N 电子天平(上海精密科学仪
器有限公司);SG2200HPT 型超声波洗涤机(上海
冠特超声仪器有限公司)。
芦丁(生化试剂 ,上海晶纯试剂有限公司);乙
醇 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠 、过氧化氢 、水扬酸
及硫酸亚铁等化学试剂均为分析纯。
细叶黄皮叶于 2010 年 5月 8日摘于广西龙州
县响水镇 ,实验所用的样品均经该院植物分类学黄
秋婵副教授鉴定为 Clausena anisum-olens 。
1.2　测定方法
1.2.1　标准品溶液的配制
准确称取芦丁标准品 25.00 mg 于 100 mL 容
量瓶中 ,加入少量 70 %(体积分数 ,以下同)乙醇 ,溶
解后定容至刻度 ,摇匀 , 得芦丁标准液 ,浓度为 0.
2500 g/ L。
1.2.2　测定波长选择
精密量取芦丁对照液 1 mL ,置 10 mL 比色皿
中 ,加入 5 %(质量分数)NaNO 2 的水溶液 0.4 mL ,
摇匀 ,放置 6 min ,加 10 %(质量分数)Al(NO3)3 溶
液 0.4 mL ,摇匀 ,放置 6 min ,加 4 %(质量分数)
NaOH 溶液 4 mL , 再加水至刻度 , 摇匀 , 放置 15
min ,在波长 300 ～ 600 nm 之间测定吸光度 ,确定最
大吸收波长为 510 nm 。
1.2.3　标准曲线的绘制
精确量取芦丁标准品溶液 0.0 、0.5 、1.0 、1 .5 、
2.0 mL 分别置于 10 mL 比色管中 ,其余步骤如 1.
2.2 ,以试剂空白为参比 ,在 510 nm 处测吸光度 ,测
得结果作芦丁质量浓度-吸光度标准曲线 ,得回归方
程:A=9 .48C-0.0031 , R2 =0.9997 ,在考查范围
内呈良好的线性关系 。
1.2.4　总黄酮的测定及其得率的计算
细叶黄皮叶阴干 ,粉碎 ,过 60目筛 ,加入一定量
的乙醇 ,超声波作用提取 ,过滤 ,定容至 50 mL ,吸取
1 mL ,在 510 nm 处的波长下测定吸光度 ,计算总黄
酮提取率(%),公式为:
总黄酮提取率%=
　提取液质量浓度×体积×稀释倍数原料质量 ×100%
1.2.5 　细叶黄皮叶总黄酮提取液清除羟自由基
(·OH)实验
在比色管中依次加入 9.0 mmol/ L 水扬酸-乙
醇溶液 0.5 mL ,总黄酮提取液 0 .5 mL , 9 mmol/ L
Fe2+溶液 0.5 mL , 3 .5 mL 蒸馏水 , 再加入 88
mmo l/L H 2O 2 溶液 5.0 mL ,摇匀后放置一定时间 ,
在 510 nm处测定吸光度 A1 ;取 0.5mL 蒸馏水代替
Fe2+溶液所测得的吸光度为 A2 ,取 0.5 mL 蒸馏水
代替总黄酮提取液所测得的吸光度为 A3 ,测定三
次 ,按以下公式计算羟自由基(·OH)的清除率 P
(%),并计算平均值 。
P/ %= 1 -A1 -A2
A3
×100
2　结果
2.1　单因素的影响
2.1.1　乙醇浓度对黄酮提取率的影响
称取物料 1.000 g , 加入 20 mL 乙醇 ,超声功率
60W ,在 50℃提取 30 min ,改变乙醇浓度 ,结果如表
1。
表 1　乙醇体积分数对提取率的影响
乙醇体积分数/ % 30 40 50 60 70 80 90
吸光度 A 0.748 0.856 0.881 0.931 1.037 0.884 0.879
　　由表 1可见 ,乙醇体积分数为 70%时吸光度最
大 ,由回归方程可知 ,提取率与吸光度为正相关的关
系 ,因此最佳提取浓度为 70 %。
2.1.2　超声功率对黄酮提取率的影响
乙醇浓度 70 %,其余方法如 2.1.1 ,改变功率 ,
实验结果如表 2。
　　由表 2 可以看出 ,细叶黄皮叶吸光度在 80 W
时达到最大 ,因此 80 W为最佳提取功率 。
·421·第 7期 化　　学　　世　　界 　
表 2　超声波功率对提取率的影响
功率/W 40 50 60 70 80 90
吸光度 A 0.981 1.031 1.038 1.022 1.041 0.981
2.1.3　液料比对黄酮提取率的影响
功率 80 W ,其余如 2 .1 .2 方法进行实验 ,改变
液料比 ,结果见表 3。
表 3　料液比对提取率的影响
料液比 1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 1∶30 1∶35
吸光度 A 0.825 0.837 0.980 0.945 0.950 0.879
　　由表 3可见 ,当料液比为 1∶20时吸光度最大 ,
因此 1∶20为最佳料液比。
2.1.4温度对黄酮提取率的影响
方法如 2.1.3 ,改变温度 ,结果见下表 4。
表 4　温度对提取率的影响
温度/ ℃ 30 40 50 60 70 80
吸光度 A 0.918 0.937 0.989 1.073 1.034 1.023
　　由表 4可见 ,温度为 60℃时吸光度最大 , 60℃
为最佳提取温度。
2.1.5　提取时间对黄酮提取率的影响
温度为 60 ℃,其余方法如 2.1 .4 ,改变提取时
间 ,结果见表 5 。
表 5　提取时间对提取率的影响
时间/min 20 30 40 50 60 70
吸光度 A 0.925 0.935 0.958 1.019 1.026 0.925
　　由表 5 可见 ,在 60 min 时黄酮提取率达到最
大 ,60 min为最佳提取时间。
2.2　正交实验
2.2.1　正交实验因素
从以上单因素实验可知 ,总黄酮提取率受到乙
醇浓度(A)、超声波功率(B)、料液比(C)、提取时间
(D)这四个因素的影响较大 ,为了全面考察这四个
因素的影响 ,进行四因素三水平的正交实验。以下
各个实验均在60 ℃下进行 ,正交实验因素水平设计
见表 6。
表 6　因素水平表
水平 A乙醇浓度/ %
B
超声波功率/W
C
料液比
D
提取时间/min
1 60 70 1∶15 50
2 70 80 1∶20 60
3 80 90 1∶25 70
2.2.2　正交实验结果
通过正交实验对细叶黄皮叶总黄酮的提取工艺
参数进行优化 ,实验结果见表 7 ,方差分析结果见表
8。
表 7　实验结果与极差分析
实验号 因素
A B C D
吸光度 提取率/ %
1 1 1 1 1 1.041 5.489
2 1 2 2 2 0.965 5.103
3 1 3 3 3 1.085 5.721
4 2 1 2 3 1.019 5.388
5 2 2 3 1 1.052 5.547
6 2 3 1 2 1.023 5.409
7 3 1 3 2 0.884 4.661
8 3 2 1 3 1.016 5.372
9 3 3 2 1 1.050 5.536
K 1 16.313 15.538 16.269 16.572
K 2 16.343 16.022 16.027 15.173
K 3 15.569 16.666 15.929 16.480
k1 5.438 5.179 5.423 5.524
k2 5.448 5.341 5.342 5.058
k3 5.190 5.555 5.310 5.493
R 0.258 0.376 0.113 0.466
表 8　方差分析结果
变异来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 显著水平
A 0.128 2 0.064 6.252
B 0.213 2 0.107 10.428 ＊
C 0.020 2 0.010 1
D 0.408 2 0.204 19.943 ＊＊
　　由 L9(34)正交实验及极差分析结果表明 ,影响
细叶黄皮叶总黄酮得率的主次因素为 D>B> A >
C ,即提取时间>超声波功率>乙醇浓度>料液比;
方差分析表明 ,提取时间与超声波功率对总黄酮得
率具有显著性影响;而乙醇浓度与料液比在考察范
围 内 影 响 不 显 著。 最 佳 提 取 工 艺 条 件 为
A1B 3C3D3 ,即:温度 60 ℃,乙醇浓度 60 %,超声波
功率 90 W ,料液比 1 ∶25 ,提取时间 70min 。
2.3　重复性实验
取 3份试样 ,按最佳提取工艺进行提取 ,提取率
分别为 5.721%、5.714 %、5 .731 %,重现性较好 。
2.4　回收率的测定
精密吸取 1.0 mL 提取液 5 份 , 分别置于 10
mL 比色皿中 ,加入芦丁对照品 1.0 mL ,按 1 .2.3
处理 ,平均回收率为 100%, RSD为 0.07%。
(下转第 431 页)
·422· 化　　学　　世　　界　 2011 年
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(上接第 422页)
2.5　不同产地及季节细叶黄皮叶总黄酮含量的测
定
称取广西不同产地及季节的细叶黄皮叶 1.000
g ,按最佳提取工艺进行提取 ,按 1 .2.3进行测定 ,结
果见表 9。
表 9　不同产地及季节总黄酮含量
产地 龙州县 龙州县 崇左市区 大新县 扶绥县 扶绥县
采摘时间/月 5 7 4 4 4 12
总黄酮/ % 5.730 4.853 5.196 1.461 2.638 3.239
2.6　细叶黄皮总黄酮提取液清除羟自由基(·OH)
实验
按 1.2.5操作 ,结果表明 ,细叶黄皮叶总黄酮提
取液对羟自由基(·OH)的清除率随着样品液质量
浓度的增加 ,清除率能力增强。当样品质量浓度为
0.694 g/L 时 ,其清除率为 49.1 %,表明细叶黄皮叶
总黄酮提取液具有较强的清除羟自由基的能力 ,实
验结果如表 10 。
表 10　总黄酮提取液质量浓度与羟自由基(·OH)
清除率关系
总黄酮提取率质量浓度/ g· L -1
实验组 0.694 0.347 0.174 0.116 0.087
P/ % 49.1 41.7 29.7 21.7 17.9
3　结　论
通过 L 9(34)正交实验 ,用超声波法提取细叶黄
皮叶总黄酮的最佳提取工艺条件为:温度 60 ℃,乙
醇浓度 60 %,功率 90W ,料液比为 1∶25 ,提取时间
70 min。
不同产地及季节的细叶黄皮叶总黄酮含量相差
较大 ,同一季节的几个产区中 ,龙州县总黄酮含量最
高。而同一产地的细叶黄皮叶 ,扶绥县的冬季比春
季总黄酮含量高 ,龙州县的春季比夏季的总黄酮含
量高 。
细叶黄皮叶总黄酮提取液具有一定的清除羟自
由基的能力 ,具有较大的开发价值 ,应提高综合利
用。
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