全 文 ：食品与发酵工业 FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
106 2009 Vol.35No.4(Total256)
原生质体融合菌株 F6 酿造蜂蜜桑椹酒的发酵条件优化
陈娟 1, 2 , 阚建全1 , 杜木英 1
1(西南大学食品科学学院 , 重庆 北碚 , 400715)
2(四川工商职业技术学院轻化工程系 ,四川 都江堰 , 611830)
摘 要 通过三因素二次正交旋转回归实验 , 考察了发酵温度 、接种量和初始 pH值对原生质体融合菌株 F6酿
造蜂蜜桑椹酒品质的影响。得到了蜂蜜桑椹酒的质量与影响因素的回归方程:Y=88.649 36-6.197 32X1 +
1.491 09X2 +2.885 65X3 -4.088 17X1 2 -2.497 18X3 2 +1.625 00X1X2 +1.375 00X2X3 ,其中 X1为发酵温度 , X2为
接种量 , X
3
为 pH值;因素效应分析表明 ,发酵温度和初始 pH值对蜂蜜桑椹酒质量的影响极显著(P<0.01),接
种量对蜂蜜桑椹酒质量的影响显著(P<0.05);原生质体融合菌株 F6酿造蜂蜜桑椹酒的最佳工艺参数是发酵
温度 23℃,接种量 10%, pH值 3.5。
关键词 原生质体融合菌株 ,蜂蜜桑椹酒 ,工艺参数
蜂蜜桑椹酒是以桑椹 、蜂蜜为原料 ,采用发酵技术
酿制的纯天然含酒精饮料 ,其酒度低 、营养丰富。在当
今酒类消费所倡导的以低度酒取代高度酒 、果酒取代
粮食酒的潮流下 ,蜂蜜桑椹酒的推出 ,丰富了市场上的
果酒品种 ,迎合了当今的市场需求和消费理念 ,显示出
广阔的市场前景 。
酵母菌在果酒酿造中起着至关重要的作用 ,不同
的酵母菌生产出的果酒风味和质量有很大差异 [ 1。2] 。
在前期工作中 ,笔者分别以发酵性能优良的酿酒酵母
和风味优良的酵母(分离于自然发酵的蜂蜜桑椹汁)
为亲本菌株 ,采用原生质体融合技术 ,经逐级筛选 ,得
到了适合酿造蜂蜜桑椹酒的原生质体融合菌株 F6。
本文利用三因素二次正交旋转回归设计研究了原生
质体融合菌株 F6发酵蜂蜜桑椹酒的工艺参数 ,以建
立该菌株酿造蜂蜜桑椹酒的质量数学模型 ,为该菌株
的商业应用提供实验数据 。
1 材料与方法
1.1 试验材料
发酵菌株:原生质体融合菌株 F6。
桑椹:无核大十果桑 ,采自四川省农科院蚕业研究
所;手工挑选成熟度一致的桑椹为发酵原料 ,桑椹原汁
的糖度为 8% ～ 10%,还原糖含量为 45 ～ 58g/L, pH为
3.9 ～ 4.3,总酸含量为 4 ～ 6g/L(以柠檬酸计)。
蜂蜜:槐花蜜 ,购于重庆唐氏蜂业有限公司 。
1.2 试验仪器
恒温培养箱:HH·B11· 420-S-Ⅱ ,上海跃进
医疗器械厂。恒温振荡器:HZ-9221K, 太仓市科教
器材厂华利达实验设备公司 。气相色谱 /质谱联用
仪:GC6890/MS5972MSD, 美国惠普公司 。 75μm非
极性 CAR/PDMS萃取纤维头(部分交联):美国 su-
pelco公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蜂蜜桑椹酒的酿制方法
种子液扩培工艺:从麦芽汁试管保藏斜面转接 1
环至 10°Brix麦芽汁试管新鲜斜面上 ,在 28℃下培养
48 ～ 72 h,然后转接 1环至 10 mL糖度为 6%的无菌
蜂蜜桑椹汁中(用 100mL三角瓶盛装),在 25℃下振
荡培养 24 ～ 30h,再转入 125 mL糖度为 6%的无菌蜂
蜜桑椹汁中(用 500 mL三角瓶盛装),在 25℃下振荡
培养 20 ～ 22h,即可作为种子液添加到发酵液中。
发酵工艺流程:
第一作者:在读博士研究生(阚建全为通讯作者)。
收稿日期:2008-10-27,改回日期:2008-12-31
DOI :10.13995/j.cnki.11-1802/t s.2009.04.027
生产与科研经验
2009年第 35卷第 4期(总第 256期) 107
用蜂蜜调整桑椹汁至含糖量 220 g/L,用柠檬酸
按试验要求调整 pH值 ,按 120 mg/LSO2添加亚硫
酸 ,制成蜂蜜桑椹汁发酵液 。以容积为 1 L的三角瓶
盛装 700 mL发酵液 ,接入酵母种子液(2.2×108个 /
mL),发酵至残糖不再明显降低 ,去除酒脚 ,陈酿 20
d,供成分分析和感官评定 。
1.3.2 蜂蜜桑椹酒主要成分的测定方法
1.3.2.1 酒样的糖 、酸 、酒度和 pH值等理化指标的
测定参照文献[ 3, 4]进行
1.3.2.2 酒样中主要香气成分的定量分析方法
香气富集方法[ 5, 6] :顶空固相微萃取法。取 1个
20 mL顶空瓶 ,用无菌移液管加入 10 mL待分析的酒
样和 2.0 gNaCl,然后用微量进样器移入 20μL浓度
为 5.004 g/L的 2-辛醇内标溶液 ,加盖密封垫和铝
帽 ,压紧 。手动摇匀后 , 2-辛醇在酒样中的最终浓度
为 9.988mg/L。向顶空瓶中插入 CAR/PDMS萃取纤
维头 , 45℃水浴恒温吸附 30 min。
香气成分检测方法 [ 7, 8] :将富集后的萃取头插入
GC进样口处 ,解吸 5 min。采用的色谱柱为 HP-IN-
NOMAX, 50 m×0.25 mm×0.25 μm。色谱条件为:
进样口温度 250℃,柱温的起始温度 50℃,以 10℃/
min升至 120℃,再以 14℃/min升至 260℃,保留 5
min,载气 He,体积流量为 0.8 mL/min。质谱条件:
电离方式 EI,电离电压 70eV,连接杆温度 260℃,扫
描范围为 20 ～ 450 u。
定性定量方法:各组分的质谱经人工通过计算机
在 NIST图谱库中进行检索分析定性。定量法采用内
标法 ,具体步骤为:首先通过定性分析确定蜂蜜桑椹
酒含有的代表性酯类和醇类物质 ,然后准确配制待测
香气物质的混合标准溶液 ,并准确加入一定量内标物
质 ,通过 GC分析 ,以质量与峰面积之比计算出每种
香气物质及内标物质的绝对校正因子 ,再以每种香气
物质的绝对校正因子与内标物质的绝对校正因子之
比作为该种香气物质相对于内标物质的相对校正因
子 。对酒样进行测定时 ,准确加入一定量内标物质 ,
以每种香气物质的相对校正因子及内标物质的已知
浓度求出该种香气物质在酒样中的含量。
1.3.3 蜂蜜桑椹酒的感官评分方法
评价组由 10名经过相关培训的师生组成 ,按表
1对各个酒样进行评分。
1.3.4 蜂蜜桑椹酒的发酵试验设计
在大量预备试验的基础上 ,选取发酵温度(X1)、
接种量(X2)和 pH值(X3)3个因素作为试验考察因
素 ,以酒样的感官综合评分为因变量 (Y),采用三因
素二次正交旋转回归设计方法进行试验设计 ,因素水
平见表 2。
表 1 蜂蜜桑椹酒感官综合评分表
项目 评分标准 评分
色泽
(满分 20分)
澄清 ,透明 ,有光泽 ,紫红色 ,悦目协调
澄清 ,透明 ,有光泽 ,紫红色
澄清 ,无夹杂物 ,红褐色
略微混浊 ,失光
18～ 20
16～ 18
14～ 16
14分以下
香气
(满分 30分)
果香 、酒香浓郁幽雅 ,协调悦人
果香 、酒香良好 ,尚悦人
果香 、酒香较淡 ,但无异香
果香不足 ,或不悦人 ,或有异香
香气不良 ,使人厌恶
27～ 30
24～ 27
21～ 24
18～ 21
18分以下
滋味
(满分 40分)
酒体丰满 ,醇厚协调 ,舒适爽口 ,回味绵延
酒质柔顺 ,柔和爽口 ,酸甜适口
酒体协调 ,纯正无杂
略酸 ,略苦 ,欠浓郁
酸 ,涩 ,苦 ,平淡 ,有异味
36～ 40
32～ 36
28～ 32
24～ 28
24分以下
风格
(满分 10分)
典型完美 ,风格独特 ,幽雅无缺
典型明确 ,风格良好
有典型性 ,不够怡雅
缺乏典型性
9～ 10
8～ 9
7～ 8
7分以下
表 2 试验因素水平编码表
因素 发酵温度(X1)/℃
接种量
(X2)/%
pH值
(X3)
上星号臂(+1.682) 29 10.4 3.64
上水平(+1) 27 9.0 3.5
零水平(0) 24 7.0 3.3
下水平(-1) 21 5.0 3.1
下星号臂(-1.682) 19 3.6 2.96
■j 3 2 0.2
2 结果与分析
2.1 三因素二次正交旋转回归设计试验
三因素二次正交旋转回归设计的试验方案与结
果见表 3。
表 3 试验方案与结果
实验号 X1 X2 X3 Y
1 1 1 1 86
2 1 1 -1 73
3 1 -1 1 75
4 1 -1 -1 69
5 -1 1 1 93
6 -1 1 -1 85
7 -1 -1 1 90
8 -1 -1 -1 86
9 -1.682 0 0 87
10 1.682 0 0 67
11 0 -1.682 0 86
12 0 1.682 0 88
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续表 3
实验号 X1 X2 X3 Y
13 0 0 -1.682 79
14 0 0 1.682 84
15 0 0 0 91
16 0 0 0 88
17 0 0 0 90
18 0 0 0 87
19 0 0 0 87
20 0 0 0 89
21 0 0 0 88
22 0 0 0 90
23 0 0 0 91
2.2 原生质体融合菌株 F6酿造蜂蜜桑椹酒质量预
测模型的建立
通过 DPS数据处理软件对试验数据进行二次多
项式逐步回归 ,拟合得到初步回归方程和方差分析结
果:
Y= 88.98435 - 6.19732X1 +1.49109X2 +
2.88565X3 -4.09202X1 2 -0.55649X2 2 -2.50103X3 2
+1.62500X1X2 +0.87500X1X3 +1.37500X2X3。
表 4 试验结果方差分析表
变异
来源 平方和 自由度 均方 F
显著水平
P
X1 524.5153 1 524.5153 136.1385 0.0001
X2 30.3639 1 30.3639 7.8810 0.0148X3 113.7207 1 113.7207 29.5163 0.0001
X12 266.0616 1 266.0616 69.0566 0.0001
X22 4.9206 1 4.9206 1.2771 0.2789X
3
2
99.3904 1 99.3904 25.7969 0.0002
X1X2 21.1250 1 21.1250 5.4830 0.0358X1X3 6.1250 1 6.1250 1.5898 0.2295
X2X3 15.1250 1 15.1250 3.9257 0.0691
回归 1078.3483 9 119.8165 F回归 =31.0985 0.0001
剩余 50.0865 13 3.8528
失拟 30.0865 5 6.0173 F失拟 =2.4069 0.0938
误差 20.0000 8 2.5000
总和 1128.4348 22
在表 4方差分析中 , F检验结果表明 , F回归在 P<
0.01水平上极显著 , 说明二次回归方程的回归是极
显著的 。F失拟
下 ,回归方程中 X2 2和 X1X3两项不显著 ,因此 ,进一
步对原数据进行逐步回归 ,剔除上述不显著项后得到
简化的回归方程为:
Y=88.649 36 -6.197 32X1 +1.491 09X2 +
2.885 65X3 - 4.088 17X1 2 - 2.497 18X3 2 +
1.625 00X1X2 +1.375 00X2X3。
简化的回归方程中各项的偏相关系数分析见表
5,结果表明 ,除了交互项 X2X3的系数以外 ,各个系数
在 p<0.05水平上显著 ,表明试验设计中选取的影
响因素对试验结果影响显著 ,本试验中得出的因子变
化与试验结果之间的影响关系真实可靠。
表 5 偏相关系数分析
偏相关系数 t检验值 显著水平 P
r(y, X1)=-0.946 4 11.344 6 0.000 1
r(y, X2)=0.576 1 2.729 5 0.014 8
r(y, X3)=0.806 5 5.282 4 0.000 1
r(y, X12)=-0.901 6 8.072 4 0.000 1
r(y, X32)=-0.786 4 4.930 9 0.000 2
r(y, X1X2)=0.506 8 2.276 7 0.036 9
r(y, X2X3)= 0.445 4 1.926 5 0.072 0
由简化后的回归方程预测试验方案中的因变量 ,
然后与试验观测值进行回归分析。由回归分析得到
的预测值与观测值的关系见图 1。回归分析的结果
表明 R2 =0.945 8,调整后的 R2 =0.943 2,标准误差
为 1.811 1。进一步对回归方程中随机误差之间的相
关性进行 Durbin-Watson检验 ,统计量 d=2.699 6,表
明随机误差序列不存在一阶自相关。
图 1 预测值与观测值的关系图
综合上述统计学指标结果 ,表明建立的回归方程
拟合很好 ,且回归显著 。
2.3 因素效应分析
由方差分析表 4,可以看出 X1 , X3 , X1 2 , X3 2在 P
<0.01水平上极显著 , X2 , X1X2在 P<0.05水平上
显著 。因此 ,温度 、pH值和接种量对酿造蜂蜜桑椹酒
的质量均有显著影响。回归方程的一次项系数表明
主因素的效应大小为 X1 >X3 >X2 ,即发酵温度 >pH
值 >接种量 。回归方程的偏相关系数分析结果表 5
也表明效应影响大小为 X1 >X3 >X2 >X1X2 >X2X3。
2.4 因素水平的优化组合
根据建立的回归方程 ,通过计算机模拟寻优 。每
个因素取 5个水平:±1.682, ±1和 0,对相应的 125
个方案寻优 ,得出预测 Y>90的 17个方案中各变量
取值与频率分布见表 6。由表 6可知 ,当 3个因素分
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别在 X1(-0.874 ～ -0.420)、X2(0.231 ～ 1.229)、X3
(0.427 ～ 1.070),即温度为 21.4 ～ 22.7℃,接种量为
7.5 ～ 9.5, pH值为 3.39 ～ 3.51时 , 则因变量 Y有
95%的可能高于 90。
表 6 预测值 >90.00的 17个方案中各个因子频率表
编码 因素频数X1 频率 X2 频率 X3 频率
-1.682 0 0.000 0 1 0.058 8 0 0.000 0
-1 11 0.647 1 2 0.117 6 0 0.000 0
0 6 0.352 9 2 0.117 6 7 0.411 8
1 0 0.000 0 6 0.352 9 6 0.352 9
+1.682 0 0.000 0 6 0.352 9 4 0.235 3
加权均数 -0.647 0 0.730 0 0.749 0
标准误 0.116 0 0.255 0 0.164 0
95%的分
布区间
-0.874～
-0.420
0.231 ～
1.229
0.427～
1.070
取值范围 21.4～ 22.7 7.5～ 9.5 3.39 ～ 3.51
由回归方程预测可得最优水平各个因素组合为:
当 X1的编码水平 -0.4251, X2的编码水平 1.6818,
X3的编码水平 1.047 2时 , Ymax=94.6。将各因素的
编码水平换算为自然变量数字 , 并结合实际操作情
况 ,当温度 23℃,接种量 10%(V/V)和 pH值 3.5时 ,
可以获得综合质量较优的蜂蜜桑椹酒 。
2.5 质量预测模型的验证
为进一步验证回归方程的可行性 ,以预测最优水
平组合温度 23℃,接种量 10%(V/V)和 pH值 3.5为
发酵条件 ,对融合子 F6和 2亲本进行多次酿酒试验 ,
所得酒样的成分分析和感官评定结果如下 。
2.5.1 蜂蜜桑椹酒的理化指标分析
由表 7知 ,在优化条件下 ,融合子发酵得到的蜂
蜜桑椹酒 ,残糖量很低 ,满足干型果酒的标准;含酸量
与国内生产的众多葡萄酒[ 9]相比:与干白葡萄酒相
当但略低于干红葡萄酒的含酸量;酒精度大于 12%
(V/V),符合一般果酒酒精度 7% ～ 14%的要求。
表 7 蜂蜜桑椹酒的理化指标测定结果
菌株 乙醇体积分数 /%
总糖
/g· L-1
总酸(柠檬
酸计)/g· L-1 pH值
亲本 1 12.5±0.21 4.0±0.10 7.65±0.11 3.5±0.12
亲本 2 10.0±0.16 42.6±0.12 7.32±0.10 3.5±0.10
融合子 F6 12.6±0.20 3.2±0.10 7.60±0.14 3.5±0.17
2.5.2 蜂蜜桑椹酒的香气成分分析和感官评价
1:乙酸乙酯;2:正丁醇;3:丁酸乙酯;4:异丁醇;5:异戊醇;6:己酸乙酯;7:乳酸乙酯;8:辛酸乙酯;9:2, 3
-丁二醇;10:异丁酸;11:癸酸乙酯;12:己酸;13:苯乙醇;14:辛酸;15:丁二酸单乙酯;16:4-羟基苯乙醇
图 2 蜂蜜桑椹酒香气成分的 GC-MS总离子流色谱图(顶空固相微萃取)
表 8 蜂蜜桑椹酒的主要香气成分测定结果 mg/L
主要酯类 主要醇类
物 质 亲本 1 亲本 2 融合子 F6 物 质 亲本 1 亲本 2 融合子 F6
乙酸乙酯 13.40 26.21 30.57 正丁醇 1.53 2.89 2.37
丁酸乙酯 2.20 8.0 7.02 异丁醇 13.6 30.23 35.78
己酸乙酯 2.01 5.32 5.68 异戊醇 26.32 43.68 42.6
乳酸乙酯 0.70 1.63 1.80 2, 3-丁二醇 0.55 1.00 1.03
辛酸乙酯 11.55 22.12 22.78 苯乙醇 15.34 24.27 25.67
癸酸乙酯 4.54 13.34 12.90 4-羟基苯乙醇 0.82 1.34 1.78
丁二酸单乙酯 1.20 3.01 3.20
总量 35.6 79.63 83.95 总量 58.16 103.41 109.23
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通过顶空固相微萃取与气相色谱质谱联用 ,分别
对两亲本和融合子发酵的蜂蜜桑椹酒中主要香气成分
进行了分析测定 , 7种酯和 6种醇类物质的含量见表
8。酯类物质中以乙酸乙酯 、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量
较高 ,酯类具有愉快的花 、果香;醇类物质中以异丁醇 、
异戊醇和苯乙醇含量较高 ,异丁醇 、异戊醇具有青草 、
植物香气 ,苯乙醇具有玫瑰香 、紫罗兰香和茉莉香 。这
些物质共同构成了蜂蜜桑椹酒香气的基本骨架。
对融合子发酵的蜂蜜桑椹酒进行感官综合评定 ,
酒样澄清 、透明 、紫红色 ,有悦人的果香和酒香 ,滋味
柔顺协调 ,具有蜂蜜桑椹酒的典型性 , 综合评分为
92.8分 ,与回归方程最优水平预测结果(94.6分)比
较 ,经统计假设检验 ,发现差异不显著(P>0.05),进
一步验证了回归方程的可行性 。
3 结论
(1)蜂蜜桑椹酒的质量与发酵温度(X1)、接种量
(X2)和 pH值(X3)3个影响因素间的回归方程为:Y
=88.649 36-6.197 32X1 +1.491 09X2 +2.885 65X3
-4.088 17X1 2 -2.497 18X3 2 +1.625 00X1X2 +
1.375 00X2X3。并且 ,因素影响的效应大小为:发酵温
度 >pH值 >接种量。
(2)利用酵母原生质体融合菌株 F6发酵蜂蜜桑
椹酒的优化工艺参数为:发酵温度 23℃, 接种量
10%, pH值 3.5,在这样的条件下 ,可以获得综合质
量较好的蜂蜜桑椹酒 。
(3)对酒样的成分分析和感官评价表明 ,原生质
体融合菌株 F6在适宜的发酵条件下能酿造出高品质
的蜂蜜桑椹酒 。
参 考 文 献
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OptimizationoftheFermentationConditionsof
Honey-mulberryWinewithFusantF6
ChenJuan1, 2 , KanJianquan1 , DuMuying1
1(CollegeofFoodScience, SouthwestUniversity, Chongqing400715, China)
2(LightIndustryChemistryDepartment, SichuanTechnologyandBusinessColege, Dujiangyan611830, China)
ABSTRACT Throughthree-factorquadricorthogonalregresioncompositeexperimentaldesign, theinfluencesof
fermentationtemperature, inoculumvolumeandpHvalueonthequalityofhoney-mulberywinewithfusantF6 werein-
vestigated.Aregresionequationwithhighreliabilitywasobtained, whichwasY =88.649 36 - 6.197 32 X1 +
1.491 09X2 +2.885 65X3-4.088 17X1 2-2.497 18X3 2 +1.625 00X1X2 +1.375 00X2X3 , X1 wasfermentationtem-
perature, X2 wasinoculumvolume, X3 waspHvalue;Analysisoffactorsefectshowedthatfermentationtemperature
andpHvaluehadverysignificantinfluenceonwinequality(P<0.01), andinoculumvolumehadsignificantinflu-
enceonwinequality(P<0.05).TheoptimumtechnologyparametersforfusantF6 were23℃ offermentationtempera-
ture, 10%ofinoculumvolumeand3.5ofpHvalue.
Keywords fuant, honey-mulberywine, technologyparameter