全 文 ： 2009, Vol. 30, No. 19 食品科学 ※生物工程166
原生质体融合法构建蜂蜜桑椹酒酿造酵母的研究
陈 娟 1,2，阚建全 1,*，杜木英 1
(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715； 2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)
摘 要：以发酵性能优良的酿酒酵母Y1和风味优良的酿酒酵母HM为亲本菌株，通过对原生质体融合中各种技术
条件进行研究，结果表明：含 2.0mg/ml CuSO4的完全培养基为区别两亲本 Y1(n)和HM(n)的选择性培养基；在最
佳酶解条件下，亲本Y1(n)原生质体的形成率和再生率为 94.2%和 27.1%，亲本HM(n)原生质体的形成率和再生率
为 95.4%和 22.2%；将Y1(n)原生质体在 60℃水浴中灭活 20min，可完全抑制其活性；对融合子酿造蜂蜜桑椹酒的
感官品质和主要香气成分进行分析，采用模糊综合评判法，最终优选出了融合子 F6和 F10；并对融合子进行了细
胞体积、DNA含量和抗药性能方面的鉴定。融合子 F6和 F10具有发酵能力强、风味优良的双亲优点，为适合酿
造蜂蜜桑椹酒的酵母菌株。
关键词：酿酒酵母；原生质体融合技术；融合子；蜂蜜桑椹酒酿造酵母
Construction of Yeast Brewing Honey-mulberry Wine by Protoplast Fusion Technique
CHEN Juan1,2，KAN Jian-quan1,*，DU Mu-ying1
(1.College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；
2. College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)
Abstract ：Saccharomyces cerevisiae Y1 with excellent fermentation capability and Saccharomyces cerevisiae HM with good
flavor-producing capability were used as parental strains to construct yeast brewing honey-mulberry wine through protoplast
fusion technique. Optimal protoplast fusion conditions were systematically investigated. Results revealed that complete culture
medium containing 2.0 mg/ml CuSO4 could be as the selective culture medium for differentiating parental strains Y1 (n) and HM
(n). Under optimal enzyme treatment conditions, protoplast formation rate and regeneration rate of Y1 (n) were 94.2% and
27.1%; protoplast formation rate and regeneration rate of HM (n) were 95.4% and 22.2%, respectively. The protoplast of Y1 (n)
could be completely inactivated by 60 ℃ water bathing for 20 min. Through sensory quality, principal aromatic component analysis
and comprehensive evaluation of different honey-mulberry wines fermented by fusants and parental strains, the optimal fusants
were identified to be F6 and F10. Cell volume, DNA content and drug resistance property for fusants were identified. These results
suggested that fusants F6 and F10 have both parents’advantages and are suitable for brewing honey-mulberry wine.
Key words：Saccharomyces cerevisiae；protoplast fusion technique；fusant；yeast brewing honey-mulberry wine
中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)19-0166-07
收稿日期：2008-09-04
基金项目：国家 2003年度三峡科技移民开发专项项目(2003EP090013)
作者简介：陈娟(1980－)，女，博士研究生，主要从事果酒发酵研究。E-mail：chenj1221@126.com
*通讯作者：阚建全(1965 －)，男，教授，博士，主要从事食品化学与营养学和食品生物技术研究。
E-mail：ganjq1965@163.com
原生质体融合技术又称为细胞融合技术，起源于 20
世纪 50年代。至今，国内外关于此技术的研究与取得
的成果已有很多。在工业微生物领域，1978年该技术
作为一种新的基因重组手段被提出并开始运用于工业菌
株的选育工作中，极大地推动了微生物研究的进程。例
如在果酒酿造工业上，原生质体融合技术成功的构建和
改造出了许多生产及经济性状优良的工业菌株，包括降
酸酵母[1]、增香酵母[2-3]和嗜杀酵母[4-5]等，这些融合菌株
对果酒产业的发展起到了积极的作用。
大量的研究和生产实践表明，在选育优良果酒专用
菌株时，应努力做到既保证有良好的发酵能力又能适合
每种水果自身特性进行发酵。因此，蜂蜜桑椹酒酿造
酵母的选育也不例外。本研究为了改善前期工作中分离
筛选得到的一株对蜂蜜桑椹酒的风味贡献大但发酵能力
167※生物工程 食品科学 2009, Vol. 30, No. 19
欠佳的菌株的性能，将该菌株与起酵快、发酵彻底、
絮凝性好的酿酒酵母AS2.399进行原生质体融合，以期
望获得一株发酵性能好，发酵酒的香气协调、悦人，
遗传性能稳定的兼具有两亲本优良性状的蜂蜜桑椹酒酿
造酵母菌株。
1 材料与方法
1.1 菌种
酿酒酵母AS2.399 Y1购于中科院微生物研究所。
酿酒酵母 H M 从自然发酵的蜂蜜桑椹汁中分离得
到，经初步鉴定为酿酒酵母。
1.2 培养基
产孢培养基[6 ]：葡萄糖 0.1%、酵母膏 0.25%、醋
酸钠 0.82%、氯化钾 0.18%(固体加琼脂 2%)；完全培养
基(YEPD)[6]：葡萄糖 2%、蛋白胨 2%、酵母膏 1%(固体
加琼脂 2%)；选择性培养基：葡萄糖 2%、蛋白胨 2%、
酵母膏 1%、加入一定浓度的化学抑制剂(固体加琼脂
2%)；再生完全培养基(YPDS)：在完全培养基中加入
17%蔗糖；再生选择性培养基：在选择性培养基中加入
17%蔗糖；桑椹汁培养基：用蜂蜜调整桑椹汁至含糖量
为 150g/L，用于制备种子液；上述培养基均在 115℃下
灭菌 20min；桑椹汁发酵培养基：用蜂蜜调整桑椹汁至
含糖量 220g/L，用柠檬酸调整 pH值至 3.5，按 100mg/L
SO 2 添加亚硫酸。
1.3 试剂与溶液配制
高渗缓冲溶液(CPBS)：pH5.9的柠檬酸 -磷酸氢二
钠缓冲溶液，含 0.7mol/L KC1。
预处理剂溶液：0.1%、0.2%的β-巯基乙醇(BME)，
10、20mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)，0.1mol/L EDTA用
CPBS配制，β-巯基乙醇和二硫苏糖醇购自国贸集团化
学试剂有限公司。
酶解溶液：工具酶为蜗牛酶，购自北京鼎国生物技
术有限责任公司，用CPBS配制成一定浓度，经 0.22μm
膜过滤除菌。
原生质体悬浮液：0.01mol/L CaCl2，用CPBS配制，
经 0.22μm膜过滤除菌。
促融剂溶液：6000-PEG 35%(m/V)，0.01mol/L
CaCl2，用 CPBS配制，经 0.22μm膜过滤除菌。
乙二胺四乙酸钠、硫酸铜、结晶紫、氯化锂、重
铬酸钾等均为实验室常规试剂。
1.4 仪器与设备
XSP-C生物显微镜 重庆光电仪器有限公司；SW-
CJ-1FD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；HH-
2型数显恒温水浴锅 上海帅佳电子科技有限公司；LD5-
2A低速离心机 北京医用离心机厂；HH·B11·420-
S-Ⅱ恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HZ-9221K恒
温振荡器 太仓市科教器材厂华利达实验设备公司；
GC6890-MS5972MSD气相色谱 -质谱联用仪 美国惠普
公司。
1.5 方法
1.5.1 诱导单倍体
采用文献[6]中单倍体的制备和验证方法。
1.5.2 抗药性标记筛选
分别制备硫酸铜、氯化锂、重铬酸钾、结晶紫和
放线菌酮的不同浓度梯度的选择性培养基平板，将 1.5.1
节中得到的亲本菌株的单倍体Y1(n)和HM(n)制备成菌悬
液，点接种平板，培养 2～3d 后，筛选出两亲本生长
差异的平板，进一步涂布检验，确定最终的抗药性选
择培养基。
1.5.3 原生质体的融合
原生质体的制备与再生：操作过程按文献[6]的方法
进行。原生质体形成率和再生率用平板菌落法测定，计
算公式为：

A－B C－B
F(%)＝————× 100 R(%)＝———× 100

A A－B
式中：F 为原生质体形成率；R 为原生质体再生
率；A为酶处理前YEPD 活菌计数；B为酶处理后YEPD
活菌计数；C 为酶处理后 YPDS 活菌计数。
亲本Y1(n)的原生质体热灭活时间确定：将制备好的
亲本Y1(n)的原生质体溶液 1ml(浓度为107个 /ml)，在60℃
水浴中振荡灭活 5、10、15、20、25、30min，分别
取不同灭活时间下的原生质体溶液0.1ml，涂布YPDS，28℃
培养 3～5d，计算长出的菌落数并计算灭活率。

灭活后在YPDS上长出的菌落数
灭活率(%)=(1－———————————————)× 100

灭活前在YPDS上长出的菌落娄
原生质体的融合：分别取两亲本的原生质体液(浓度
均为 107个 /ml)各 1ml，混合在一起，于 30℃和 180 r/min
下振荡培养 15min，5000r/min离心 10min，收集菌体，
用 1.5ml促融剂溶液悬浮菌体，振荡作用 10min，再静
置作用 10min，离心收集菌体，用原生质体悬浮液离心
洗涤一次，最后将菌体悬浮于 1ml原生质体悬浮液中。
取 0.1ml融合的菌液，涂布再生选择性培养基，于 28℃
培养 5～7d，平板上形成的菌落数即为融合子数，计算
融合率。

融合后在再生选择性培养基上长出的菌落数
融合率(%)=————————————————————×100

未灭活亲本的原生质体数
1.5.4 融合子的筛选
初筛：采用 TT C 法和杜氏管发酵法相结合。
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复筛：以含糖 220g/L的蜂蜜桑椹汁进行发酵实验。
对发酵结束后的酒，首先分析酒精度、总糖、总酸和
pH值，方法参照文献[7]、[8]，并参照感官综合评分表
1进行感官质量评价，选出性能较优的融合子；再定量
分析酒样中主要香气成分，采用模糊综合评判法对筛选
出的融合子进行优劣排序。香气成分定量分析方法参照
文献[9 ]。
项目 评分标准 评分
澄清，透明，有光泽，紫红色，悦目协调 18～20
色泽 澄清，透明，有光泽，紫红色 16～18
(满分 20分) 澄清，无夹杂物，红褐色 14～16
略微混浊，失光 14分以下
果香、酒香浓郁幽雅，协调悦人 27～30
果香、酒香良好，尚悦人 24～27
香气 果香、酒香较淡，但无异香 21～24
(满分 30分) 果香不足，或不悦人，或有异香 18～21
香气不良，使人厌恶 18分以下
酒体丰满，醇厚协调，舒适爽口，回味绵延 36～40
酒质柔顺，柔和爽口，酸甜适口 32～36
滋味 酒体协调，纯正无杂 28～32
(满分 40分) 略酸，略苦，欠浓郁 24～28
酸，涩，苦，平淡，有异味 24分以下
典型完美，风格独特，幽雅无缺 9～10
风格 典型明确，风格良好 8～9
(满分 10分) 有典型性，不够怡雅 7～8
缺乏典型性 7分以下
表1 蜂蜜桑椹酒感官综合评分表
Table 1 Standard and scores of sensory evaluation of honey-
mulberry wine
融合子的稳定性检验：将融合子先在选择性培养基
上连续传代 10次，再转移至完全培养基上连续传代 10次
后，检验其抗药性能和发酵性能，观察其遗传稳定性。
1.5.5 融合子的鉴定分析
细胞体积的测定参照文献[10]进行。按下式计算：
V =πab2/ 6
式中：a为细胞长轴长度(μm)；b为细胞短轴长度(μm)。
细胞DNA含量测定参照文献[11]进行。核酸提取采
用 Schneider法，DNA含量测定用二苯胺法[12]。
融合子和亲本抗药性的测定：分别将融合子和亲本
菌株制备成浓度为OD640nm≈ 1.0的菌悬液，取 0.4μl点
接种选择性培养基，做 3 次重复。培养 2～3d 后，观
察菌落的生长情况。
2 结果与分析
2.1 融合子的构建
2.1.1 亲本菌株单倍体的制备和抗药性标记
亲本菌株 Y 1和 HM 经液体产孢培养基培养 5～7d
后，产生了大量的子囊孢子，分别制得其单倍体Y1(n)
和HM(n)。由抗药性浓度筛选的结果得出，含 2.0mg/ml
CuSO4的完全培养基为区别两亲本单倍体的选择性培养
基，在此培养基上，Y1(n)能生长而HM(n)不能生长。说
明亲本Y1(n)具有能耐受 2.0mg/ml CuSO4的遗传抗药性能。
2.1.2 前培养时间的确定
研究证明，处在对数期的酵母菌体代谢极为旺盛，
其细胞壁对蜗牛酶较敏感，易于酶解脱壁而形成原生质
体，所形成的原生质体也易于再生[ 1 3 ]。由图 1 可以看
出，两亲本的对数生长期约为第 2～10h，其对数生长
中期均为第 3～6h。镜检发现，Y1(n)和HM(n)分别培养
至 4h和 5h时细胞浓度达到 2～3× 107个 /ml。因此确
定，Y1(n)前培养时间为 4h，HM(n)前培养时间为 5h。
2.1.3 不同酶浓度与作用时间对原生质体形成和再生的
影响
分别以 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的蜗牛酶处理
Y1(n)和 HM(n)，30℃酶解 1.0、1.5、2.0、2.5h，原
生质体的形成和再生情况见表 2、 3 。
图1 亲本菌株的生长曲线
Fig.1 Growth curves of parental strains
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Y1(n)
HM(n)
O
D
64
0n
m
时间(h)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
酶质量
1.0h 1.5h 2.0h 2.5h
分数(%)
形成 再生 形成 再生 形成 再生 形成 再生
率(%) 率(%) 率(%) 率(%) 率(%) 率(%) 率(%) 率(%)
0.5 43.3 38.0 60.0 34.0 74.1 30.6 78.2 21.0
1.0 60.2 34.2 93.2 31.5 94.2 25.5 94.1 14.2
1.5 62.4 28.5 94.1 26.0 95.0 22.0 95.2 15.3
2.0 65.0 25.4 94.8 19.3 95.4 17.1 95.5 12.8
表2 酶浓度和作用时间对Y1 (n)原生质体形成和再生的影响
Table 2 Effect of concentration and treatment time of enzyme on
protoplast formation and regeneration of Y1 (n)
酶质量
1.0h 1.5h 2.0h 2.5h
分数(%)
形成 再生 形成 再生 形成 再生 形成 再生
率(%) 率(%) 率(%) 率(%) 率(%) 率(%) 率(%) 率(%)
0.5 20.5 34.8 40.5 30.0 58.1 25.3 70.5 20.0
1.0 41.2 33.5 65.8 28.7 73.9 25.5 80.1 18.7
1.5 45.5 34.4 73.1 28.4 94.4 23.4 95.2 17.9
2.0 50.2 27.0 84.6 22.1 95.6 15.6 95.4 6.8
表3 酶浓度和作用时间对HM(n)原生质体形成和再生的影响
Table 3 Effect of concentration and treatment time of enzyme on
protoplast formation and regeneration of HM(n)
169※生物工程 食品科学 2009, Vol. 30, No. 19
而此时的对照组形成率仅为 60.5%，再生率为 34.4%；
对于经 0.1%BME预处理过的HM(n)，在酶解 1.5h后形
成率就达到 95.4%，再生率为 22.2%，而此时的对照组
形成率仅为 73.4%，再生率为 28.7%。与对照组相比，
酶解速率加快，原生质体形成率到达较高时所需时间缩
短，再生率仍较高。另外，无论是对于Y1(n)还是HM(n)，
DTT预处理组的原生质体形成率和再生率虽然比对照组
有较大提高，但比 B M E 预处理组都偏低。因此，最
终选用 0.1%BME对两亲本进行预处理，酶解时间均缩
短 0 .5h。
2.1.5 Y1(n)原生质体热灭活时间的确定
灭活时间(min) 5 10 15 20 25 30
灭活率(%) 30.1 70.3 92.5 100 100 100
表4 亲本Y1 (n)原生质体的热灭活情况(60℃)
Table 4 Inactivation degree of Y1 (n) protoplast at 60 ℃ with
various treatment times
从表 2、3可以看出，原生质体的形成和再生与蜗
牛酶的用量和作用时间有关。对于 Y1(n)，酶质量分数
达到 1.0%，酶解时间超过 1.5h以后，原生质体形成率
达到 90%以上就基本维持不变，而再生率却快速下降；
对于HM(n)，酶质量分数达到 1.5%，酶解时间超过 2.0h
以后，原生质体形成率达到 90%以上就不再明显上升，
同样，再生率也出现下降趋势。所以，综合考虑酶浓
度和作用时间的影响，用 1.0%蜗牛酶处理Y1(n)1.5h，
原生质体形成率和再生率分别可达 93.2%和 31.5%；用
1.5%蜗牛酶处理HM(n) 2h，原生质体形成率和再生率
分别可达 94.4%和 23.4%，适合进行原生质体融合。
2.1.4 预处理剂对原生质体形成和再生的影响
在酶解前，分别将 Y1(n)和 HM(n)细胞悬浮于不同
浓度的β-巯基乙醇和二硫苏糖醇预处理溶液中，30℃
下振荡处理 10min，以无菌水作对照，离心去除预处理
剂后，再分别向Y1(n)加入 1.0%酶解液，HM(n)加入 1.5%
酶解液，30℃振荡处理制备原生质体。结果见图 2、3。
图4 Y1 (n)原生质体形态(10×40)
Fig.4 Cell morphology of Y1 (n) protoplast
图2 预处理剂对Y1 (n)原生质体形成和再生的影响
Fig.2 Effects of pretreatment reagents on protoplast formation
and regeneration of Y1 (n)
100
80
60
40
20
原
生
质
体
形
成
率
(%
)
酶解时间(h)
0.5 1 1.5 2 2.5
50
40
30
20
10
0
原
生
质
体
再
生
率
(%
)
0.1%BME形成率
10mmol/L DTT形成率
对照形成率
0.2%BME再生率
20mmol/L DTT再生率
0.2%BME形成率
0.2mmol/L DTT形成率
10mmol/L DTT再生率
对照再生率
0.1%BME再生率
图3 预处理剂对HM(n)原生质体形成和再生的影响
Fig.3 Effects of pretreatment reagents on protoplast formation
and regeneration of HM (n)
酶解时间(h)
0.5 1 1.5 2 2.5
0.2%BME形成率
20mmol/L DTT形成率
对照再生率
0.1%BME再生率
10mmol/L DTT再生率
0.1%BME形成率
10mmol/L DTT形成率
对照形成率
0.2%BME再生率
20mmol/L DTT再生率
100
80
60
40
20
原
生
质
体
形
成
率
(%
) 50
40
30
20
10
0
原
生
质
体
再
生
率
(%
)
由图 2、3可见，对于经 0.1%BME预处理过的 Y1
(n)，在酶解 1h后形成率就达到 94.2%，再生率为 27.1%，
由表 4 可知，在 6 0℃下，随着灭活时间的增加，
原生质体的灭活率逐渐上升，20m in 可以达到完全灭
活。因此，确定灭活时间为 2 0 m i n。
2.1.6 两亲本原生质体的形态及融合状态
T1(n)和HM(n)原生质体形态如图 4、5所示。实验
中，在加入促融剂溶液后，两亲本菌株的原生质体迅
速凝集在一起(图 6)，经再生选择性培养基培养后，计
算其融合率为 4.85× 10 -6。
图5 HM(n)原生质体形态(10×40)
Fig.5 Cell morphology of HM (n) protoplast
图6 原生质体聚集融合状态(10×40)
Fig.6 Cell morphology of protoplast fusion
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2.2 融合子的筛选
2.2.1 融合子的初筛
结合 TTC平板菌落显色和杜氏管发酵产气情况的观
察，将在平板上呈现较红色泽和杜氏管中气柱较长的融
合子挑出来，然后采用相同的方法从挑出的融合子中进
行第 2 轮、第 3 轮筛选，最后得到 10 株发酵能力比较
理想的融合子。
2.2.2 融合子的复筛
2.2.2.1 发酵酒的理化性质和感官质量分析
将10株融合子和两亲本菌株Y1(n)和HM(n)进行发酵
实验，结合发酵结束后酒的理化性质和感官质量分析结
果，从中筛选出了 4 株性能较优的融合子 F 1、F 6、F 1 0
和 F 1 4，结果见表 5、6。
建立权重向量：经分析研究表明，香气成分中按
影响果酒质量的效应大小排序为酯类、醇类、酸类，
结合感官综合评价，根据德尔菲法[ 1 8 ]，确定评判中的
权重分配为：A ＝｛a 1，a 2，a 3，a 4｝＝｛0 . 3 0，
0.30，0 .25，0 .15｝。其中 a 1 ＋ a 2 ＋ a 3 ＋ a 4 ＝ 1。
建立评判矩阵：评判因素集与评判对象集之间的关
系可以通过隶属函数用模糊关系矩阵 R＝(rij)4× 7来表示。
根据表 6 构造感官评分因素的隶属函数为：
U(x1)＝ x1/100， 60≤ x1＜ 100
由于果酒香气主要成分的含量在一定范围内与果酒
的品质呈正相关，故可构造线性上升的隶属函数，根据
表 7，构建酯类、醇类、酸类隶属函数表达式分别为：
0 (x2＜30)
U(x2)＝ (x2－ 30)/45 (30 ≤ x2≤75)
1 (x2＞75)
0 (x3＜50)
U(x3)＝ (x3－ 50)/45 (50 ≤ x3≤95)
1 (x3＞95)
0 (x4＜6)
U(x4)＝ (x4－ 6)/12 (6 ≤ x4≤ 18)
1 (x4＞18)
然后，将表 6、7中的数据代入各隶属函数公式，可
以得到相应的隶属度，合并后可以得到如下评判矩阵：
0.792 0.848 0.816 0.880 0.867 0.783 0.827
R ＝ 0.050 0.951 0.663 1.000 0.921 0.093 0.564
0.002 0.971 0.781 1.000 1.000 0.019 0.833
0.042 0.852 0.478 1.000 1.000 0.006 0.448
模糊综合评判计算：
采用加权平均数法[19 ]即 b j＝Σ(a i·r i j)( j＝ 1，2，
3，4，5，6，7 )得到的评判结果为：
B＝A·R＝[0.259 0.910 0.711 0.964 0.936 0.268 0.693]
进行归一化处理得到：B＝[0.055 0.192 0.150 0.203
0.197 0.057 0.146]。
模糊综合评判的结果表明了酒样综合质量的优劣，
所以综合性能评判优劣顺序为 F6＞ F10＞HM(n)＞ F1＞
Y1(n)＋HM(n)＞ F14＞Y1(n)。可以得出融合子 F6为最佳
蜂蜜桑椹酒酿造酵母，F10稍次之，F1和 F14虽然不及亲
本 H M，但 F 1 仍优于两亲本混合发酵。
2.2.3 融合子的稳定性检验
将 F6和 F10连续传代 20次后，对第 1代和第 20代
菌株的抗药性和发酵性能进行分析，结果见表 8。
通过对CuSO4的抗性、发酵酒精度和总酯产量的分
析，表 8结果表明，融合子 F6和 F10的主要性能很稳定，
未受连续传代的影响，说明两者是真正的合核体，具
有遗传稳定性。
注：Y1(n)＋HM(n)表示两亲本菌株按照 1:1(V/V)的比例混合发酵，下同。
菌株 酒精度(%，V/V) 总糖(g/L) 总酸(g/L，柠檬酸计) pH值
Y1(n) 12.5± 0.2 4.51± 0.10 7.65± 0.11 3.50± 0.12
HM(n) 10.0± 0.2 42.64± 0.12 7.32± 0.10 3.55± 0.10
F 1 11.8± 0.1 13.14± 0.11 7.54± 0.12 3.52± 0.11
F 6 12.7± 0.2 3.23± 0.10 7.60± 0.14 3.50± 0.17
F 1 0 12.3± 0.2 6.52± 0.14 7.51± 0.11 3.52± 0.13
F 1 4 10.2± 0.1 38.84± 0.13 7.25± 0.18 3.51± 0.12
F1(n)＋ HM(n) 11.2± 0.2 21.43± 0.17 7.47± 0.12 3.50± 0.10
表5 不同蜂蜜桑椹酒的理化性质分析
Table 5 Physical and chemical properties of honey-mulberry wine
fermented by Saccharomyces cerevisiae Y1, HM, their fusants, or
their mixture
菌株 色泽(20分) 香气(30分) 滋味(40分) 风格(10分) 综合得分(100分)
Y1(n) 18.2 18.8 35.0 7.2 79.2
HM(n) 18.0 25.8 32.0 9.0 84.8
F 1 17.8 22.5 32.8 8.5 81.6
F 6 18.1 26.0 34.8 9.1 88.0
F 1 0 18.2 24.9 35.0 8.6 86.7
F 1 4 17.5 18.9 33.7 8.2 78.3
Y1(n)＋ HM(n) 18.0 22.9 34.0 7.8 82.7
表6 不同蜂蜜桑椹酒的感官质量分析
Table 6 Results of sensory evaluation of honey-mulberry wine
fermented by Saccharomyces cerevisiae Y1, HM, their fusants, or
their mixture
2.2.2.2 模糊综合评判
建立评判对象集：U ＝｛u 1，u 2，u 3，u 4，u 5，
u 6，u 7｝＝｛Y 1 ( n )，H M ( n )，F 1，F 6，F 1 0，F 1 4，
Y 1(n)＋ HM(n)｝。
建立评判因素集：根据评判对象主要香气成分的分
类和相关文献的报道[14-17]，确定酯类、醇类和酸类为主
要因素，结合感官综合评价得分，建立评判因素集X＝
｛x 1，x 2，x 3，x 4｝，式中：x 1 为感官得分；x 2 为主
要酯类含量；x 3 为主要醇类含量；x 4 为主要酸类含量。
171※生物工程 食品科学 2009, Vol. 30, No. 19
由图 7～10和表 9可以看出，亲本Y1(n)细胞近似球
图10 融合子F10细胞形态(10×40)
Fig.10 Cell morphology of Fusant F10
序号 香气成分 分子式 分子量
酒样香气成分含量(mg/L)
Y1(n) HM(n) F1 F6 F10 F14 Y1(n)＋HM(n)
1 乙酸乙酯 C4H8O2 88 11.42 24.64 21.21 26.57 23.47 12.10 20.58
2 丁酸乙酯 C6H12O2 116 2.21 6.25 5.00 5.89 6.29 4.03 3.48
3 己酸乙酯 C8H16O2 144 1.75 4.54 3.27 4.62 5.02 1.58 3.02
4 乳酸乙酯 C5H10O3 118 0.82 1.79 0.75 1.98 2.22 0.65 0.99
5 辛酸乙酯 C10H20O2 172 10.85 20.66 17.27 21.54 18.96 9.66 16.28
6 葵酸乙酯 C12H24O2 200 4.02 11.23 9.87 12.85 11.68 4.89 8.30
7 丁二酸单乙酯 C6H10O4 146 1.28 3.68 2.45 3.70 3.81 1.29 2.75
酯类含量 32.25 72.79 59.82 77.15 71.45 34.20 55.40
8 正丁醇 C4H10O 74 1.10 1.54 1.27 1.85 2.83 0.98 1.32
9 异丁醇 C4H10O 74 11.82 27.74 25.85 30.20 32.87 12.30 26.94
10 异戊醇 C5H12O 88 23.40 41.25 34.39 38.69 35.54 28.67 38.58
11 2,3-丁二醇 C4H10O2 90 0.56 1.02 0.65 1.15 2.82 0.41 0.79
12 苯乙醇 C8H10O 122 12.35 20.59 20.24 22.02 25.28 7.89 18.55
13 4-羟基苯乙醇 C8H10O2 138 0.87 1.54 2.74 1.98 2.02 0.60 1.32
醇类含量 50.10 93.68 85.14 95.68 95.89 50.85 87.5
14 异丁酸 C4H8O2 88 2.16 5.23 4.02 6.01 8.25 2.25 3.84
15 己酸 C6H12O2 116 1.54 4.28 1.98 5.02 4.51 1.47 3.30
16 辛酸 C8H16O2 144 2.80 6.71 5.74 7.01 8.84 2.35 4.24
酸类含量 6.50 16.22 11.74 18.04 21.6 6.07 11.38
表7 不同蜂蜜桑椹酒主要香气成分的定量分析结果
Table 7 Quantitative analysis of main aromatic components inhoney-mulberry wine fermented by Saccharomyces cerevisiae Y1, HM, their
fusants, or their mixture(mg/L)
注：表中数据为 3次重复实验的平均值，相对标准偏差为 2.1%～6.3%。
项目
第一代 第二十代
F 6 F 1 0 F 6 F 1 0
选择性培养基 ＋ ＋ ＋ ＋
酒精度(%，V/V) 12.7± 0.2 12.3± 0.1 12.6± 0.1 12.2± 0.2
总酯(mg/L) 1902.1± 1.5 1821.5± 1.8 1886.9± 2.0 1815.2± 1.6
表8 融合子的遗传稳定性分析
Table 8 Hereditary stability analysis of fusants F6 and F10
注：+ .生长。
2.3 融合子的鉴定分析
2.3.1 融合子和亲本细胞大小及DNA含量
图7 亲本Y1 (n)细胞形态(10×40)
Fig.7 Cell morphology of Y1 (n)
图8 亲本HM(n)细胞形态(10×40)
Fig.8 Cell morphology of HM (n)
图9 融合子F6细胞形态(10×40)
Fig.9 Cell morphology of fusant F6
菌株 预测倍性
细胞大小 DNA含量
平均长轴(μm) 平均短轴(μm) 平均体积(μm 3) (μg/cell，× 10-8)
Y1(n) n 3.7 3.5 23.72 2.7
HM(n) n 4.0 3.3 22.80 2.9
F6 2n 5.6 4.0 46.89 4.8
F10 2n 4.5 4.1 39.59 4.3
表9 融合子和亲本菌株的某些特征比较
Table 9 Comparison of morphological properties between fusants F6
and F10 and their parental strains
2009, Vol. 30, No. 19 食品科学 ※生物工程172
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菌株 Y1(n) HM(n) F6 F10
选择性培养基 ＋ － ＋ ＋
表10 融合子和亲本菌株的抗药性结果
Table 10 Drug resistance of fusants F6 and F10 and their parental
strains
注：＋ .生长；－ .不生长。
2.3.2 融合子和亲本菌株的抗药性分析
从表 10可以看出，在含 2.0mg/ml CuSO4的选择性
培养基上，亲本 HM(n)不能生长，亲本 Y 1(n)能生长，
F6和 F10同样能生长，说明 F6和 F10确实是两亲本菌株的
融合子。
3 结 论
确定含 2.0mg/ml CuSO4的完全培养基为区别两亲本
Y1(n)和HM(n)的选择性培养基。确定在制备原生质体时
前培养时间Y1(n)为 4h，HM(n)为 5h。用 0.1% BME对
两亲本进行预处理后，在 30℃下，用 1. 0% 酶解液处
理Y1(n)1.0h，原生质体形成率和再生率分别为 94.2%和
27.1%；用 1.5%酶解液处理HM(n)1.5h，原生质体形成
率和再生率分别为 95.4%和 22.2%。Y1(n)原生质体水浴
灭活的温度为 60℃，时间为 20min。
通过对融合子和两亲本菌株发酵酒的理化性质、感
官品质和主要香气成分的定量分析，采用模糊综合评判
法，选出性能优良的融合子 F 6和 F 10，它们具有发酵能
力强、风味优良的双亲优点。
通过对融合子和两亲本的细胞大小、DNA含量和
抗药性分析，进一步证实了 F6和 F10是两亲本的融合子。
形，平均轴比为 0.94，亲本 HM(n)细胞为椭圆形，平
均轴比为 0.83；融合子 F 6细胞为椭圆形，平均轴比为
0.71，融合子 F10细胞近球形，平均轴比为 0.91。融合
子细胞体积和 D N A 含量都明显大于双亲细胞体积和
D N A 含量。