全 文 ：西北农业学报　2010 , 19(8):126-131
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
超声波辅助提取苹果叶多酚及其抗氧化性研究①
王临宾 ,马倩倩 ,徐怀德 ,张立佳
(西北农林科技大学 食品科学与工程学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:研究了超声波辅助提取苹果叶多酚的最佳工艺及其抗氧化性。结果表明 ,超声波辅助提取苹果叶多
酚的最佳条件为:乙醇体积分数 20%, 液料比 40∶1(mL∶g), 提取温度 75℃, 提取时间 20 min , 超声波功率
600 W , 提取两次 ,在此条件下多酚的得率为 4.22%;苹果叶提取物有较好的抗氧化活性 , 对· OH 和 O2 -· 的
清除能力比茶多酚强;H PLC 分析表明苹果叶中根皮苷的含量为 2.45%, 苹果叶提取物中根皮苷的含量为
6.18%, 占提取物中多酚量的 61.36%。
关键词:苹果叶;多酚;超声波辅助提取;抗氧化性;根皮苷
中图分类号:TS05 　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2010)07-0126-06
Ultrasonic-assisted Extraction of Polyphenols from
Apple Leaves and Its Antioxidant Activities
WANG Linbin ,MA Qianqian ,XU Huaide and ZHANG Lijia
(College of Food S cience and Engineering , Northw es t A&F Universi ty , Yangling S haanxi　712100 , China)
Abstract:U ltrasonic-assisted ext ract ion of polyphenols f rom apple leaves w as opt imized and the antiox-
idant activities of the ext ract w ere also studied.The resul ts indicated that the optimal ult rasonic-assis-
ted ext raction conditions we re as fo llow s:ethano l concentration 20%, ratio of liquid to so lid 40∶1
(mL∶g), ex traction tempe rature 75℃, ext ract ion time 20 min , ult rasonic pow er 600 W and ex t rac-
ted tw ice , the rate of to tal polypheno ls w as 4.22%;Apple leaves ex t ract had good antioxidant act ivi-
ties , it held st ronger scavenging activi ties on ·OH and O 2 -· than tea po lyphenols;HPLC (high per-
fo rmance liquid chromatog raphy)results showed the content of phlo rizin w as 2.45% in apple leave s
and 6.18% in ext ract , account ing for 61.36% of total polyphenols.
Key words:A pple leaves;Polyphenols;Ultrasonic-assisted ex t raction;A ntioxidant activities;Phlo ri-
zin
　　苹果(Malus pum ila Mill.)树叶 ,性味苦寒 ,
凉血解毒 。《滇南本草》记载:敷脐上治阴症 ,又治
产后血迷 ,经水不调 ,蒸热发烧 ,服之神效;贴火毒
疮或汤火 ,烧灰调油搽之最良[ 1] 。中国是世界上
最大的苹果生产国 ,而大量苹果叶腐烂 ,未得到开
发利用。
苹果多酚具有抗氧化 、抗过敏 、抗龋齿 、降低
胆固醇 、防治心脑血管疾病 、抗突变 、抗癌 、抑制血
压上升和提高人体应变能力等作用[ 2-6] 。根皮苷
主要存在于苹果树的根 、皮 、茎 、嫩叶以及苹果果
实中 ,具有调节血压 、保护心脏及清除体内自由基
等作用 ,根皮苷可以减少小肠对葡萄糖的吸收和
增加肾脏分泌排除葡萄糖 ,从而有降低血糖水平
的作用 。董华强等[ 7] 研究结果证明多穗柯根皮苷
对糖尿病防治有明显的作用。
超声波提取法利用超声波产生的强烈振动 、
高加速度 、空化效应 、搅拌作用等 ,可加速细胞壁
的破碎 ,促进胞内物质的溶出 ,从而提高提取率 ,
①收稿日期:2010-12-31　　修回日期:2010-01-14
第一作者:王临宾 ,女 ,在读硕士 ,专业方向为天然产物提取分离。 E-mail:coolge1986@126.com
通讯作者:徐怀德 ,男 ,副教授 ,从事软饮料 、果品蔬菜贮藏与加工 、天然产物提取研究。 E-mai l:xu huaide@yahoo.com.cn
缩短提取时间 。此法已成功应用于苹果多酚[ 8] 、
绿茶多酚[ 9] 、大叶白麻叶总黄酮[ 10] 等的提取。目
前 ,已有大量关于苹果和苹果渣中多酚的研究 ,而
未见苹果叶的报道 ,本试验通过中心组合试验研
究了超声波辅助提取苹果叶多酚的最佳工艺 ,并
对提取物进行抗氧化性研究和 HPLC 分析 ,以期
为苹果叶的开发利用提供依据 。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
原料:苹果叶(富士品种 ,绿色叶)2008 年 10
月采于杨凌 ,晒干 ,粉碎过 40目筛;试剂:根皮苷 、
儿茶素 、绿原酸 、槲皮素 、芦丁 、山萘酚购于天津金
测分析技术公司 ,乙腈为 HPLC 级;其他试剂均
为分析纯 。
主要仪器与设备:FW200 高速万能粉碎机
(北京中兴伟业仪器有限公司);分析天平(Sarto-
rius , cp2245);KQ-600DB 型数控超声波清洗器
(昆山市超声仪器有限公司);UV- mini1240 紫
外-可见分光光度计(日本岛津);B CHI R-200
旋转蒸发仪;Waters 600E 型高效液相色谱仪(美
国Waters)。
1.2　方 法
1.2.1　标准曲线的制作　以没食子酸为标准物
质制作标准曲线[ 11] 。回归方程为:A=11.649C
+0.0041 ,R 2=0.9991 ,其中 , A 为 765 nm 处吸
光度 ,C为没食子酸质量 。
1.2.2　苹果叶多酚的超声波辅助提取与含量测
定　称取 1.000 g 苹果叶于三角瓶中 ,以一定体
积分数的乙醇为提取溶剂 ,超声波辅助提取 ,抽
滤 ,滤液用 3倍体积的乙醚脱除叶绿素后定容至
50 mL 作为待测液 ,吸取待测液 0.04 mL ,按照
1.2.1的方法测定吸光度 ,计算多酚得率。按下
式计算多酚得率:
多酚得率=(A ×50)/(0.04×1×1000)×
100%
式中:A为根据回归方程计算得到的没食子
酸的质量(mg)。
1.2.3　苹果叶多酚提取的中心组合试验　在单
因素试验的基础上 ,选择超声波功率为 600 W ,超
声时间为 20 min ,提取 2次 ,以乙醇体积分数 、液
料比 、温度为试验因子 ,采用中心组合试验(CCD)
优化超声波提取苹果叶多酚的条件 。中心组合试
验设计因素水平见表 1。
表 1　中心组合试验因素水平
Table 1　Factors and levels of CCD
因素
Factor
水平 Level
-1.682 -1 0 1 1.682
乙醇体积分数(X 1)/ %
Ethanol concent ration
13.18 20 30 40 46.82
液料比(X 2)
Liquid-solid ratio 33.18 40 50 60 66.82
温度(X 3)/ ℃
Tem perature
61.59 65 70 75 78.41
1.2.4　苹果叶提取物的抗氧化性试验　配制多
酚质量浓度为 10 、20 、40 、80 、160 、320 、640μg/mL
的苹果叶提取液进行抗氧化性试验 ,同时配制不
同质量浓度的茶多酚溶液作为对照 。
苹果叶提取物对 DPPH 的清除效果[ 12-13] 　
分别取不同浓度的样品溶液 4 mL ,加入 1 mL 1
mmo l/L 无水乙醇配制的 DPPH 溶液 ,用力振摇
混匀后置暗室中静置 30 min ,于 517 nm 下测定
吸光度。按下式计算 DPPH 清除率 。
DPPH 清除率 =[ A0 -(AX -AX0)] / A0 ×
100%
式中:AX为加入样品和 DPPH 后的吸光度 ,
AX0为样品的吸光度 , A0 为 DPPH 和蒸馏水的吸
光度 。
苹果叶提取物对 ·OH 的清除效果[ 14] 　利
用 H 2O 2 与 Fe2+混合产生 ·OH ,在体系内加入
水杨酸捕捉 · OH 并产生有色物质 , 该物质在
510 nm 下有最大吸收 。反应体系中含 8.8
mmo l/L H 2O 2 1 mL 、9 mmol/L FeSO 4 1 mL 、9
mmo l/L 水杨酸-乙醇溶液 1 mL ,不同浓度的样
品 1 mL。最后加 H2O2 ,37 ℃反应0.5 h ,以蒸馏
水为参比 ,在 510 nm 下测定吸光度 。考虑到样
品本身的吸光值 ,同时以蒸馏水代替 H 2O 2 进行
测定 。按下式计算·OH 清除率 。
·OH 清除率=[ A0 -(AX -AX0)/ A0 ] ×
100%
式中:A0 为空白对照液的吸光度 , AX 为加入
样品后的吸光度 , AX0为样品的吸光度。
苹果叶提取物对 O 2 -· 的清除效果[ 15] 　取 50
mmo l/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)4.5 mL ,置
25 ℃水浴中保温 20 min ,分别加入 1 mL 样品溶
液和 0.4 mL 25 mmol/ L 邻苯三酚溶液 ,混匀后
于 25℃水浴中反应 5 min ,加入 1 mL 8 mmo l/L
HCl终止反应 ,于 299 nm 处测定吸光度 ,空白对
照组以相同体积蒸馏水代替样品 。按下式计算
O2 -· 清除率。
·127·8 期　　　　　　　　　　　王临宾等:超声波辅助提取苹果叶多酚及其抗氧化性研究
O 2 -· 清除率=[ A0-(AX-AX0)/ A0 ] ×100%
式中:A0 为空白对照液的吸光度 , AX 为加入
样品后的吸光度 , AX0为样品的吸光度。
1.2.5　苹果叶提取物的 HPLC 分析[ 16] 　取一定
量的苹果叶提取物 ,用乙腈溶解 , 经过 0.45 μm
的膜过滤 ,进行 HPLC 分析 。HPLC 条件:Dia-
monsil C18(150 mm×4.6 mm , d 5μm)色谱柱 ,
柱温 40 ℃,检测波长 280 nm 。流动相:A体积分
数 3%的乙酸水溶液 ,B 乙腈 ,梯度洗脱条件:0 ～
30 min , A 为 95%～ 65%, B 为 5%～ 35%,流速
1.0 mL·min-1 ,进样量 5μL。
1.3　数据处理
采用 Design-Expert 7.0 软件对试验数据进
行分析。
2　结果与分析
2.1　超声波提取苹果叶多酚的中心组合试验
二次中心组合设计及试验结果见表 2 。
表 2　中心组合设计及试验结果
Table 2　Coded value and results of experiment of central composite design
试验编号
No.
自变量　Factor
X 1(乙醇体积分数)
Ethanol concent ration
X 2(液料比)
Liquid-solid rat io
X3(温度)
Tem perature
响应值Y 　Response
试验值/ %
Observed
预测值/ %
Predicted
1 -1 -1 -1 3.847 3.910
2 1 -1 -1 3.175 3.169
3 -1 1 -1 3.810 3.814
4 1 1 -1 3.382 3.388
5 -1 -1 1 4.216 4.259
6 1 -1 1 3.823 3.869
7 -1 1 1 4.083 4.138
8 1 1 1 3.934 3.921
9 -1.682 0 0 3.721 3.647
10 1.682 0 0 3.032 3.036
11 0 -1.682 0 3.946 3.883
12 0 1.682 0 4.008 4.001
13 0 0 -1.682 3.573 3.558
14 0 0 1.682 4.347 4.293
15 0 0 0 3.566 3.680
16 0 0 0 3.566 3.521
17 0 0 0 3.566 3.552
18 0 0 0 3.566 3.586
19 0 0 0 3.566 3.667
20 0 0 0 3.566 3.404
　　以多酚得率为响应变量 Y , 乙醇体积分数
(X 1)、液料比(X 2)、温度(X 3)为可控变量 ,经过
回归分析得数学模型:Y =3.566-0.205 X 1 +
0.0184 X2 +0.230 X 3 +0.061 X 1X 2 +0.070
X 1 X3 -0.024 X2 X 3 -0.067X 1 2 +0.145X 2 2 +
0.139X 3 2 ,回归方程显著性检验结果见表 3。
表 3　回归方程的显著性检验
Table 3　Analysis of variance(ANOVA)for the quadratic model
方差来源
Source
DF SS MS F值F valu e P值Pr>F 决定系数R-squ ared
模型 Model 9 2.034 0.226 29.597 <0.000 1 0.963 8
残差 Residual 10 0.076 4 0.007 64
失拟 Lack of f it 5 0.024 3 0.004 85 0.466 0.789 1
误差 Error 5 0.052 1 0.010 4
总和 Corrected total 19 2.110
　　由表 3 可知 , 失拟不显著(P =0.7891 >
0.05),模型达到极显著(P <0.01)。模型的决定
系数为 0.9638 ,说明该模型能够解释 96.38%响
应值的变化 ,拟合程度良好 ,试验误差小 ,可以用
·128· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　19 卷
此模型对苹果叶多酚的提取工艺进行分析和预
测。模型系数显著性检验结果见表 4 。
表 4　数学模型的回归系数及显著性检验
Table 4　Model coef ficients estimated by multiples linear
regression and significance of regression coefficients
项
Model
variable
系 数
Coef f icient
value
F值
F-value P值P-valu e 显著性S ignifi cance
常数项 3.566
X1 -0.205 75.248 <0.000 1 ＊＊
X2 0.018 4 0.606 0.454 2
X3 0.23 94.735 <0.000 1 ＊＊
X 1X 2 0.061 3.894 0.076 7
X 1X 3 0.07 5.127 0.047 0 ＊
X 2X 3 -0.024 0.601 0.456 3
X 12 -0.067 8.479 0.015 5 ＊
X 22 0.145 39.868 <0.000 1 ＊＊
X 32 0.139 36.674 0.000 1 ＊＊
注:“ ＊＊” .表示差异显著性水平达 1%,“ ＊” .表示差异显著性
水平达 5%。
Note:＊＊Sig ni fican t at 1% l evel ,＊Significan t at 5% lev-
el.
　　由表 4可知 , X 1 、X 3 、X 2 2 和 X3 2 的影响均极
显著 ,X 1 X 3和 X 1 2 的影响显著 ,其余项的影响不
显著 。说明模型中一次项乙醇体积分数和温度 ,
二次项液料比和温度对多酚得率的影响达到极显
著水平;二次项乙醇体积分数和交互项乙醇体积
分数和温度对多酚得率的影响达到显著水平 。通
过对回归系数的检验可知 ,各因素对多酚得率的
影响顺序为温度>乙醇体积分数>液料比。优化
后得到的最优工艺条件为乙醇体积分数 20%,液
料比 40 ∶1 , 温度 75 ℃, 苹果叶多酚得率达
4.22%。在此条件下重复验证得多酚得率为
4.20%,与预测值接近 ,拟和性好 ,表明了模型的有
效性 ,回归方程能反映各因素对多酚得率的影响。
按上述最优条件提取苹果叶多酚 ,并将提取
液浓缩干燥得到多酚含量为 10.07%的苹果叶提
取物 。
2.2　苹果叶提取物的抗氧化性试验
2.2.1　苹果叶提取物对 DPPH 的清除效果　由
图 1可知 ,在质量浓度 10 ～ 320 μg/mL 时 ,二者
对 DPPH 的清除率随多酚质量浓度的增大而增
大 ,苹果叶提取物的清除率小于茶多酚;质量浓度
超过 320 μg/mL 后 ,苹果叶提取物的清除率均趋
于稳定 ,茶多酚略有下降。试验质量浓度范围内苹
果叶提取物对 DPPH 的最大清除率为69.42%。
2.2.2　苹果叶提取物对 ·OH 的清除效果　由
图 2可知 ,在质量浓度为 10 ～ 640 μg/mL 时 ,二
者对 ·OH 的清除率均与质量浓度呈正相关 。苹
果叶提取物的清除效果优于茶多酚 。试验质量浓
度范围内苹果叶提取物对 ·OH的最大清除率为
图 1　苹果叶提取物和茶多酚对 DPPH的清除效果
Fig.1　Effect of apple leaves extract and tea
polyphenols on DPPH scavenging
图 2　苹果叶提取物和茶多酚对·OH的清除效果
Fig.2　Effect of apple leaves extract and tea
polyphenols on ·OH scavenging
图 3　苹果叶提取物和茶多酚对 O2-· 的清除效果
Fig.3　Effect of apple leaves extract and tea
polyphenols on O2 -· scavenging
·129·8 期　　　　　　　　　　　王临宾等:超声波辅助提取苹果叶多酚及其抗氧化性研究
87.29%。
2.2.3　苹果叶提取物对 O 2 -·的清除效果　由图
3可知 ,在质量浓度为 10 ～ 640μg/mL 时 ,二者对
O 2
-· 的清除率均随质量浓度的增大而增大 ,苹果
叶提取物的清除能力比茶多酚强。试验质量浓度
范围内苹果叶提取物对 O 2 -· 的最大清除率为
93.06%。
2.3　苹果叶提取物的 HPLC分析
精确称取标准品儿茶素 、根皮苷 、绿原酸 、槲
皮素 、芦丁 、山萘酚各 1.0 mg ,分别用乙腈定容至
10 mL ,得到单个标准品的标准溶液。分别移取
2.0 mL 各单个标准溶液混合定容至 50 mL ,得到
混合标准品。在“1.2.5”色谱条件下进样 ,得到标
准色谱图 ,并在相同条件下进行各物质的单样 ,通
过保留时间对图中各峰定性(图 4 ,图 5)。
　　将苹果叶提取物色谱图与标准色谱图对照 ,
确定苹果叶提取物中含有根皮苷 ,经计算得苹果
叶中根皮苷的含量为 2.45%,苹果叶提取物中根
皮苷的含量为 6.18%, 占提取物中多酚量的
61.36%。可见 ,苹果叶可以作为优良的原料用于
根皮苷的开发 。
　　1.儿茶素 Catechin;2.绿原酸 Chlorogenic acid;3.芦丁 Ru tin;4.根皮苷 Ph lori zin;5.槲皮素 Quercetin;6.山萘酚 Kaem pferol
图 4　标准色谱图
Fig.4　Standard chromatogram
4.根皮苷 Phlorizin
图 5　苹果叶提取物的色谱图
Fig.5　Chromatogram of extract
3　结论
3.1　影响超声波辅助提取苹果叶多酚的因素顺
序依次为温度>乙醇体积分数>料液比 。超声波
辅助提取苹果叶多酚的最佳条件为:乙醇体积分
数 20%,液料比 40∶1 ,提取温度 75℃,提取时间
20 min ,超声波功率 600 W ,提取两次 ,在此条件
下多酚得率为 4.22%。
3.2 　抗氧化试验结果表明 ,苹果叶提取物对
·OH和 O 2 -· 的清除能力比茶多酚强;对 DPPH
·130· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　19 卷
的清除能力与茶多酚相当 ,苹果叶提取物有较好
的抗氧化活性。
3.3　HPLC分析表明 ,苹果叶中根皮苷的含量为
2.45%,苹果叶提取物中根皮苷的含量为6.18%,
占提取物中多酚量的 61.36%。
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