全 文 ：第 31卷第 1期　　　　　　　　 　西 南 大 学 学 报(自然科学版)　　　　　　　　　　　2009年1月
Vol.31　No.1 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) Jan.　2009
文章编号:1673-9868(2009)01-0045-04
金银花和金银花露中绿原酸
和 4种黄酮含量的测定＊
郑　敏 , 　彭敬东 , 　王丽峰
西南大学 化学化工学院 , 重庆 400715
摘要:建立了一种反相高效液相色谱法同时分离和测定金银花和金银花露中绿原酸和 4 种黄酮类化合物的含量.
优化样品提取条件和实验条件下 , 采用甲醇-水(H3PO 4 调 pH =2.6)梯度洗脱 , 外标法定量.结果显示绿原酸 、
槲皮素 、 金丝桃苷 、木犀草素 、 芹菜素的线性范围分别为 0.1 ～ 50 , 0.055 ～ 100 , 0.05 ～ 200 , 0.05 ～ 100 , 0.1 ～
100 mg/ L(R>0.999), 回收率分别为 94.40%, 100.72%, 97.60%和 96.80%(相对标准偏差小于 1.2%).此实
验方法简便 , 快速 , 线性关系良好 , 可作为金银花品质的测定.
关　键　词:金银花;金银花露;反相高效液相色谱法
中图分类号:O657.7+2;TQ460.7+2 文献标识码:A
金银花为忍冬科多年生半常绿缠绕植物忍冬的花蕾及初开的花 , 又名忍冬花 、银花 、双花等 , 其主要
成分有机酸———绿原酸具有抗菌 、抗病毒及抗真菌 、增强机体防御机能的作用 , 也是鉴定金银花品质的标
准.同时金银花中含有木犀草素 、金丝桃苷 、槲皮素 、芹菜素等多样黄酮类化合物.现代医学研究表明 , 黄
酮类化合物具有降低心肌耗氧量 , 使冠脉 、脑血管流量增加 , 软化血管 , 降血糖 、血脂等作用.同时黄酮还
是一类天然的抗氧化剂 , 具有抗衰老 , 增加机体免疫力的生理活性作用[ 1-2] .鉴于此 , 金银花中黄酮的含量
也可以作为金银花品质检验的标准.目前对以上这 5种物质已经建立的分析方法已经有:阻抑催化褪色光
度法[ 3] 、分光光度法[ 4] 、高效液相色谱法[ 5] 、共振瑞利散射光谱法[ 6] 、催化动力学光度法[ 7] 、流动注射化学
发光法[ 8] 、毛细管电泳法[ 9] 等.但文献中多为一种或两种物质的测定 , 而同时对金银花中绿原酸和黄酮类
化学物进行测定的报导还未曾出过.本文则建立了一种反相高效液相色谱法同时对绿原酸 、金丝桃苷 、木
犀草素 、槲皮素 、芹菜素进行测定 , 旨为增加对金银花质量检测的补充.
2　实验部分
2.1　仪器与试剂
Agilent1100高效液相色谱仪(美国 , Agilent公司);DF-101s集热式恒温加热磁力搅拌器(中国 , 郑州
长城科工贸有限公司);DZF-6021真空干燥箱(中国 , 上海齐欣科学仪器有限公司);pHs-3c 酸度计(中国 ,
成都世纪方舟科技有限公司).
绿原酸 、金丝桃苷对照品(98%, 中国 , 上海融禾医药科技发展公司), 槲皮素对照品批号 0081-9304
(98%, 中国 , 中国药品生物制品检定), 木犀草素对照品批号 111520-200201(99%, 中国 , 中国药品生物制
品检定), 芹菜素对照品(98%, 中国 , 上海试剂二厂).甲醇(分析纯 , 中国 , 成都科龙化工试剂厂)、磷酸
＊收稿日期:2008-03-25
作者简介:郑　敏(1985-), 女 , 四川成都人 , 硕士研究生 , 主要从事色谱分析的研究.
(分析纯 , 中国 , 重庆市北碚区化学试剂厂).金银花样品(购于重庆市北碚区心连心大药房)和金银花露(每
500 mL 相当于金银花 31.25 g , 中国 , 湖北金龙福药业有限公司).水为二次蒸馏水.
2.2　实验方法
1.绿原酸;2.金丝桃苷;3.槲皮素;
4.木犀草素;5.芹菜素.
图 1　对照品图色谱图
2.2.1　色谱条件
Eclipse XDB-C8 柱(4.6×150 mm , 5 μm);流动相
为甲醇-水(用磷酸调节 pH =2.60), 采用梯度洗脱 , 0
～ 2.5 min二者的体积比恒定为 35∶65 , 2.5 ～ 4.0 min
内二者的体积比线性变化至 55∶45;检测波长 340 nm ;
流速 0.8 mL/min;进样量为 20 μL .色谱图见图 1.
2.2　标准曲线的绘制
分别精密称取干燥至恒重的绿原酸 、槲皮素 、木犀
草素和金丝桃苷对照品适量加甲醇溶解制成 1.0 g/L 的
贮备液 , 芹菜素用热的乙醇溶解制成 1.0 g/L 的贮备液.
临用前用贮备液配制一系列不同浓度的 5 种标样的混合
溶液.进样 20 μL , 以各组分峰面积Y 对其质量浓度 X(g/L)进行线性回归分析 , 得到的回归方程 、相关系
数 、线性范围及其检测限(3σ)见表 1.
表 1　五种化合物校正曲线的回归分析
对照品 线性回归方程 相关系数 线性范围/(×10 -3 g · L-1)
检测下限
/(×10-6 g · L-1)
绿原酸 Y =60 133X+12.244 R=0.999 9 0.1～ 50 3.6
金丝桃苷 Y =53 345X +5.636 4 R=0.999 9 0.055～ 100 47
槲皮素 Y =12 755X-47.947 R=0.999 7 0.05 ～ 200 38
木犀草素 Y =1 798X-37.43 R=0.999 8 0.05 ～ 100 30
芹菜素 Y =15 003X-101.69 R=0.999 7 0.1～ 100 54
2.3　样品含量测定
精密称取金银花试品粉末(过 60目筛)2.000 g , 置圆底烧瓶中 , 加 30 mL 70%乙醇(磷酸调 pH =
2.6), 于 86 ℃水浴回流 1 h , 过滤 , 滤渣加 20 mL 70%乙醇(磷酸调 pH =2.6), 重复上述步骤两次 , 合并3
次提取液 , 放冷 , 转移到 100 mL 容量瓶 , 稀释至刻度 , 摇匀 , 取 2.5 mL 稀释至100 mL , 用 0.45 μm 微孔
滤膜过滤 , 作为供试品溶液 1;取金银花露 1 mL 稀释至 10 mL 作为供试品溶液 2 , 按 2.1色谱条件分析 ,
外标法计算含量.金银花和金银花露的色谱图见图 2 , 样品测定结果见表 2 , 从表 2可以看出本实验方法测
得的绿原酸含量与国标法[ 10] 测得的含量基本一致 , 表明该方法准确度较好.
表 2　样品测定结果(n=5)
成分 绿原酸/(mg· g -1)
金丝桃苷
/(mg· g -1)
槲皮素
/(mg· g -1)
木犀草素
/(mg · g-1)
芹菜素
/(mg · g-1)
金银花 本试验方法 27.74 4.93 1.37 0.89 ND国标对照 27.22
金银花露 本试验方法 23.96 4.48 ND ND ND国标对照 23.13
　　注:ND表示未测定.
2.4　精密度实验
取同一浓度对照品溶液 , 重复进样 5 次 , 测得峰面积 , 计算得绿原酸的标准相对偏差(RSD)为
2.8%, 金丝桃苷的 RSD为 1.4%, 槲皮素的 RSD为 2.0%, 木犀草素的 RSD为1.1%.表明该方法的精
密度良好.
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1.绿原酸;2.金丝桃苷;3.槲皮素;4.木犀草素.
图 2　金银花(a)和金银花露(b)色谱图
2.5　重复性实验
按照 2.3项下样品的预处理过程分别同时处理金银花样品 5份 , 测得绿原酸含量的 RSD为 1.6%;金
丝桃苷含量的 RSD为 2.4%;槲皮素含量的 RSD为 2.1%;木犀草素含量的 RSD为 1.8%.表明该方法的
重现性良好.
2.6　加样回收实验
精密量取已知含量的金银花试液 5 份 , 分别精密加入绿原酸 、金丝桃苷 、槲皮素和木犀草素对照品 ,
测定样品的平均加标回收率(表 3).
表 3　方法的回收率实验结果(n=5)
原有量/(ng· L-1) 加入量/(ng· L-1) 测得量/(ng · L-1) 回收率/ % RSD/ %
绿原酸 14.73 2.50 17.09 94.40 1.07
金丝桃苷 0.98 1.38 2.37 100.72 0.81
槲皮素 0.27 2.50 2.71 97.60 1.63
木犀草素 0.18 2.50 2.60 96.80 2.45
2.7　稳定性实验
取同一样品溶液 , 分别于 0 , 4 , 8 , 12 , 24 h 进样测定 , 绿原酸的 RSD 为 0.87%, 金丝桃苷的 RSD为
0.63%, 槲皮素的 RSD为 0.95%, 木犀草素的 RSD为 0.77%, 表明样品在 24 h内基本稳定.
3　结果与讨论
3.1　流动相的选择
黄酮类成分在 HPLC 测定中易出现拖尾现象 , 在流动相中加入磷酸 , 抑制其拖尾 , 提高峰形对称性.
通过对不同比例的有机相及磷酸浓度的实验选择 , 结果发现甲醇-水(磷酸调 pH =2.6)系统比乙腈-水
(磷酸调 pH=2.6)系统分离效果好 , 故选择甲醇-水(磷酸调 pH =2.6)为流动相.并根据这 5种物质的极
性和分离情况 , 调整流动相的配比 , 采用梯度洗脱.
3.2　实验测定波长的选择
扫描各对照品在 200 ～ 700 nm 范围内的紫外吸收光谱 , 分析结果 , 实验选择在 330 ,340 , 350 , 360 nm
处对混合样测定 , 比较发现在 340 nm 处所测定的峰面积相对较大 , 灵敏度较高 , 峰形较好 , 因此本实验采
用 340 nm作为测定波长.
3.3　样品处理方法的选择
金银花样品分别用水浴回流提取与超声提取处理 , 结果发现水浴回流法提取的金丝桃苷 、槲皮素和
木犀草素的总含量比超声法的高出一倍 , 因为回流更有利于苷的水解 , 实验比较选定磷酸缓冲 , V(磷酸)
∶V(乙醇)=30∶70水浴回流提取的方法.
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4　结　　论
文献中的高效液相色谱法的测定结果线性范围窄 , 灵敏度低;而其他方法也存在一定的不足 , 如:分
光光度法选择性较差 , 质谱法对仪器的要求很高 、价格昂贵 , 化学发光法和催化动力学光度法操作手续烦
琐等.而本文运用反相高效液相色谱法对绿原酸 、金丝桃苷 、木犀草素 、槲皮素 、芹菜素同时测定 , 此法简
便 , 快速准确 , 灵敏度高 , 重现性和稳定性良好 , 可用于金银花的品质检测.
参考文献:
[ 1] 府旗中 , 王伯初, 许祥武.应用超声波法提取金银花中绿原酸 [ J] .重庆大学学报(自然科学版), 2007 , 30(1):123-125.
[ 2] 　赵花荣 , 温树敏 , 王晓燕 , 等.金银花道地品与非道地品的 FT IR光谱研究 [ J] .光谱学与光谱分析 , 2005 , 25(5):705
-707.
[ 3] 　耿玉珍 , 刘　葵 , 周　杰.阻抑催化褪色光度法测定痕量绿原酸 [ J] .分析化学研究简报 , 2002 , 30(6):684-686.
[ 4] 　苟占平 , 万德光.分光光度法测定 6 种忍冬藤中绿原酸的含量 [ J] .时珍国医国药 , 2007 , 18(08):1900.
[ 5] 　陈　勇, 蔡　敏 , 韩凤梅.HPLC 测定复方双花口服液中绿原酸和连翘苷的含量 [ J] .分析科学学报 , 2001 , 17(5):440.
[ 6] 　严　军 , 刘忠芳, 刘绍璞.汞(Ⅱ)-槲皮素螯合物共振瑞利散射光谱法测定槲皮素 [ J] .分析化学 , 2007 , 35(01):123-126.
[ 7] 　薛　珺 , 戚　琦 , 赖晓绮 , 等.催化动力学光度法测定槲皮素 [ J] .分析科学学报 , 2007 , 23(05):589-591.
[ 8] 　刘泽敏 , 黄玉明.流动注射化学发光法测定芹菜素 [ J] .西南师范大学学报(自然科学版), 2006 , 31(3):89-9.
[ 9] 　吕元琦 , 邬春华 , 袁倬斌.毛细管电泳法测定密蒙花中的橙皮素 、 木犀草素和芹菜素 [ J] .分析试验室 , 2004 , 23(8):
14-17.
[ 10] 《中华人民共和国药典》委员会.中华人民共和国药典(一部)[ S] .北京:化学工业出版社 , 2005:153.
Determination of Chlorogenic Acid and Four Flavones
in Flos lonicerae and Flos lonicerae Beverage
ZHENG 　Min , 　PENG Jing-dong , 　WANG Li-feng
School of Chemistry and Chemical Engineering , Southwest University , Chongqing 400715 , China
Abstract:A method to simultaneously separate and determinate chloro genic acid and four f lav ones w as es-
tablished based on reversed-phase high performance liquid chromato graphy.Under the optimized and ex-
perimental condit ions , a mix ture o f MeOH-water , w ith pH adjusted to 2.6 w ith H 3PO 4 , was used as the
mobile phase , and ex ternal standard w as also employed The results show ed the lineari ty range was 0.1-
50 , 0.055-100 , 0.05-200 , 0.05-100 and 0.1-100 g/mL , respectively , for chlo rogenic acid , Querce-
tin , Hyperoside , Luteocin and Quercetin (R >0.999)and thei r recove ries were 94.40%, 100.72%,
97.60% and 96.80%(RSD<1.2%).This method proved to be sensi tive , accurate , rapid and reproduci-
ble.It could be applied to determine the quali ty of F los lonicerae .
Key words:F los lonicerae;F los lonicerae beverage;reversed-phase high performance liquid chromatog ra-
phy
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