全 文 :西北农业学报 2016,25(1):142-146
Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica doi:10.7606/j.issn.1004-1389.2016.01.020
网络出版日期:2016-01-07
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160107.2054.040.html
巴东醉鱼草提取物抑菌活性研究
收稿日期:2015-01-20 修回日期:2015-06-17
基金项目:国家自然科学基金(31101486);农业部行业(农业)专项(K312021014);陕西省农业攻关(2010K02-09-1)。
第一作者:谢玉峰,男,硕士研究生,研究方向为农药毒理学。E-mail:fengafeia082@163.com
通信作者:王永宏,男,研究员,博士生导师,研究方向为农药毒理学。E-mail:yhwang@nwsuaf.edu.cn
谢玉峰,张秀云,魏志平,沈 静,王永宏
(西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心,陕西杨凌 712100)
摘 要 采用生长速率法对巴东醉鱼草乙醇提取物和石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3种溶剂萃取相的抑菌活性
进行测试。结果表明:质量浓度为10g/L(干样)的巴东醉鱼草乙醇提取物对供试的24种植物病原真菌均表
现出一定抑制作用,其中对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、玉米小斑病菌和水稻稻瘟病菌的菌丝生长抑制率均
超过80%;3种溶剂萃取相对上述4种病原菌菌丝生长也具有一定的抑制作用,乙酸乙酯萃取相活性最强,在
质量浓度5g/L(干样)下,对4种病原真菌的抑制率在75%以上,对油菜菌核病菌的作用最强(89.14%);质
量浓度为1g/L时,对油菜菌核的作用为71.37%,对以上4种病原真菌的EC50分别为0.492、0.534、0.531
和0.938g/L。据此,可推测巴东醉鱼草提取物的抑菌活性成分主要集中在中等极性部位。
关键词 巴东醉鱼草;抑菌活性;植物源杀菌剂;植物提取物
中图分类号 S482.2+92 文献标志码 A 文章编号 1004-1389(2016)01-0142-05
马钱科(Loganiaceae)醉鱼草属(Buddleja)
植物约有100多种,广泛分布于亚洲温热带地区
及美洲各国[1],该属植物具有抗炎[2]、抗氧化[3]、
抗菌[2]、抑制乙酰胆碱酯酶[2,4]、抗细胞增殖[5]、抑
制脂质堆积[6]等多种生物活性。巴东醉鱼草
(Buddleja albiflora Hemsl.),又名酒药花、晕
老汉或牛皮梢,为直立灌木,主要分布在陕西、四
川、湖北、河南等地,秦岭地区尤为多见,其地上部
分有化痰止咳、治眼病的功效。目前,有关巴东醉
鱼草的研究主要集中在成分分离上,其生物活性
研究较少。西北农林科技大学无公害农药研究服
务中心前期对巴东醉鱼草提取物进行杀虫活性的
研究,发现其对农业害虫具有一定毒杀活性,为更
全面地了解巴东醉鱼草提取物多方面的活性,开
展其抑菌活性研究,以期从中寻找到高抑菌活性
物质,为巴东醉鱼草资源的充分开发利用提供理
论基础[7-9]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供 试 植 物:巴 东 醉 鱼 草 (B.albiflora
Hemsl.)于2012年7月采自陕西省太白县太白
国家森林公园。
供试病原真菌:由西北农林科技大学无公害
农药研究服务中心提供,具体见表1。
主要仪器及试剂:超净工作台(SW-CJ-2FD,
苏州安泰空气技术有限公司),灭菌锅(ES-315,
TOMY公司),智能人工气候箱(RQX-250B,上海
跃进医疗器械厂),电子天平,恒温双层摇床(宁波
新芝科研仪器研究所),旋转蒸发仪(RE-52AA,
上海亚荣生化仪器厂),水浴锅(HHS-0-100,郑州
长城科工贸有限公司),微型号植物粉碎机
(FZ102,天津泰斯特仪器公司);乙醇、石油醚、乙
酸乙酯、正丁醇、丙酮等试剂均为市售分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 供试浸膏的制备 将采集的巴东醉鱼草
于室温下通风阴干,用粉碎机粉碎,并过40~60
目筛,得巴东醉鱼草植物粗粉,用φ=95%乙醇浸
泡提取3次,每次浸泡7d,将过滤后的滤液在旋
转蒸发仪上减压浓缩,除去乙醇得总浸膏;继而总
浸膏用水分散捏溶之后,依次用极性由小到大的
有机溶剂石油醚、乙酸乙酯及正丁醇进行液液萃
取,减压浓缩除去溶剂后,分别得相应的萃取物浸
膏,用丙酮先充分溶解后,定容至合适的浓度,
4℃装箱中保存,备用。
表1 供试病原真菌
Table 1 Tested fungi in this experiment
序号
No. 供试病原真菌名称 Tested fungi
序号
No.
供试病原真菌名称 Tested fungi
1 杨树溃疡病菌 Dothiorella gregaria Sacc. 13 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum
2 烟草赤星病菌 Alternaria alternata 14 水稻纹枯病菌 Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk.
3 西瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporumf.sp.niveum 15 白菜黑斑病菌Alternaria brassicae(Berk.)Sacc.
4 玉米小斑病菌 Bipolaria maydis 16 小麦纹枯病菌 Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven
5 番茄早疫病菌 Alternaria solani(Elis et Martin)Jones et Grout. 17 玉米大斑病菌 Exserohilum turcicum
6 黄瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporumSchlecht 18 棉花黄萎病菌 Verticillium dahliae
7 番茄灰霉病菌 Botrytis cirerea Pers Fr. 19 苹果炭疽病菌 Glomerella cingulata(Stoneman)Spauld.et Schrenk
8 油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)de Bary 20 小麦赤霉病菌 Gibberella zeae(Schw.)Petch
9 番茄叶霉病菌 Fulvia fulva(Cooke)Ciferri 21 棉花立枯病菌 Rhizoctonia solani
10 水稻稻瘟病菌 Pyricularia oryzae Cav. 22 苹果轮纹病菌 Botryosphaeria berengrianaf.sp piricola
11 小麦全蚀病菌 Gaeumannomyces graminis 23 辣椒疫霉病菌 Phytophthora capsici Leonian
12 小麦白粉病菌 Blumeriaa graminis 24 小麦根腐病菌 Bipolaris sorokiniana
1.2.2 抑菌活性测定方法 采用抑制菌丝生长
速率法[10-11]测定巴东醉鱼草总浸膏及不同溶剂萃
取相对供试病原真菌的抑制活性。将浸膏用分析
纯丙酮充分溶解后,配制成供试药剂,将药剂与融
化的PDA培养基按照体积比为1∶9的比例混
匀,倒入培养皿(d=9cm)内,制作成带毒平板,
以丙酮作对照。病原真菌用直径为4mm的打孔
器打成大小均匀的菌饼,接入带毒培养基中央,为
保证结果的可靠性,每皿只接1个菌饼,设置3个
重复。转接好的菌种置于28℃的培养室内培养
3~7d,采用十字交叉法测量菌落的直径,菌落直
径=测量直径-4;菌丝生长抑制率按下式计算。
抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/
对照菌落直径×100%
将供试浸膏用分析纯丙酮与灭菌水以体积比
为1∶9稀释成相应的浓度,备用,以不含浸膏的
无菌水和丙酮的混合液作对照。
2 结果与分析
2.1 乙醇提取物(总浸膏)对供试病原真菌菌丝
生长的抑制作用
以菌丝生长速率法测定10g/L(干样)巴东
醉鱼草提取物对24种病原真菌的抑制作用,结果
表明,在质量浓度为10g/L,巴东醉鱼草总浸膏
对部分植物病原真菌表现出较强的抑制作用,菌
丝生长抑制率在80%以上的有油菜菌核病菌、水稻
稻瘟病菌、番茄灰霉病菌和玉米小斑病菌(表2)。
表2 巴东醉鱼草总浸膏对24种植物病原真菌菌丝生长抑制率(珔x±s)
Table 2 Mycelia growth inhibition rate of B.albiflora Hemsl extracts on 24plant pathogenic fungi
供试病原真菌
Pathogenic fungi
菌丝生长
抑制率/%
Inhibition rate
植物病原真菌
Pathogenic fungi
菌丝生长
抑制率/%
Inhibition rate
供试病原真菌
pathogenic fungi
菌丝生长
抑制率/%
Inhibition rate
油菜菌核病菌
S.sclerotiorum (Lib.)de Bary 90.28±0.32
棉花枯萎病菌
F.oxysporumf.sp.vasin-
fectum
45.18±0.41 番茄叶霉病菌F.fulva(Cooke)Ciferri 34.18±0.66
番茄灰霉病菌
B.cirerea Pers Fr. 89.29±0.14
水稻纹枯病菌
T.cucumeris(Frank)Donk. 50.27±0.42
杨树溃疡病菌
D.gregaria Sacc. 45.12±0.21
玉米小斑病菌
B.maydis 86.12±0.11
白菜黑斑病菌
A.brassicae(Berk.)Sacc. 54.52±0.55
小麦全蚀病菌
G.graminis 35.78±0.24
水稻稻瘟病菌
P.oryzae Cav. 83.01±0.36
小麦纹枯病菌
R.cerealis Vander Hoeven 66.14±0.46
小麦白粉病菌
B.graminis 46.52±0.44
番茄早疫病菌
A.solani(Elis et Martin)Jones
et Grout.
25.45±0.66 玉米大斑病菌E.turcicum 41.25±016
棉花立枯病菌
R.solani 12.14±0.24
黄瓜枯萎病菌
F.oxysporumSchlecht 31.25±0.25
棉花黄萎病菌
V.dahliae 55.46±0.34
苹果轮纹病菌
B.berengriana f.sp piri-
cola
24.17±0.82
西瓜枯萎病菌
F.oxysporumf.sp.niveum 35.14±0.66
苹果炭疽病菌
G.cingulata (Stoneman)
Spauld.et Schrenk
21.01±0.41 辣椒疫霉病菌P.capsici Leonian 34.92±0.64
烟草赤星病菌A.alternata 12.36±0.36
小麦赤霉病菌
G.zeae(Schw.)Petch 10.23±0.22
小麦根腐病菌
B.sorokiniana 14.84±0.27
·341·1期 谢玉峰等:巴东醉鱼草提取物抑菌活性研究
2.2 不同极性溶剂萃取相对4种植物病原真菌
菌丝生长的抑制
为进一步明确巴东醉鱼草提取物抑菌活性物
质所在的极性段,将总浸膏用水捏溶分散后,分别
用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取,得到相应
的萃取相,测定各萃取相对油菜菌核病菌、番茄灰
霉病菌、玉米小斑病菌和水稻稻瘟病菌菌丝生长
的抑制作用。由表3可知,乙酸乙酯萃取相对以
上4种植物病原真菌均表现出强烈的抑制作用,
与总浸膏所表现出来的活性趋势一致。其中在乙
酸乙酯质量浓度为5g/L条件下,对油菜菌核病
菌菌丝生长抑制率为89.4%,在1g/L的条件
下,对以上4种植物病原真菌菌丝生长抑制率也
达60%以上。石油醚萃取相对以上4种病原真
菌显示一定的抑制作用,但均不强烈,而正丁醇萃
取相在相同的浓度下,几乎不显示抑制活性。这
说明,对乙醇提取物按照极性由小到大的有机溶
剂进行萃取,可明确巴东醉鱼草总浸膏中抑菌活
性物质所在的极性部位,这为采用活性跟踪法分离
获取具有抑菌活性的化合物提供一条可行的途径。
表3 不同溶剂萃取物对4种病原真菌菌丝生长的抑制率(珔x±s)
Table 3 Mycelia growth inhibition rate of different solvent extracts on four plant pathogenic fungi
供试样品
Sample
质量浓度/
(g/L)
Mass
concentration
抑制率/% Inhibition rate
油菜菌核病菌
S.sclerotiorum (Lib.)de Bary
番茄灰霉病菌
B.cirerea Pers Fr.
玉米小斑病菌
B.maydis
水稻稻瘟病菌
P.oryzae Cav.
石油醚萃取物 5 46.77±0.55 25.87±0.11 55.12±0.61 36.74±0.64
Petroleum extract 1 32.14±0.12 10.45±0.92 34.82±0.38 22.16±0.29
乙酸乙酯萃取物 5 89.14±0.18 85.12±0.45 74.58±0.61 82.14±0.43
Ethyl acetate extract 1 71.37±0.51 69.52±0.81 60.75±0.37 66.49±0.51
正丁醇萃取物 5 21.25±0.72 10.95±0.24 - 34.01±0.54
n-butanol extract 1 - - - 10.55±0.46
总浸膏 Total extract 10 90.28±0.32 89.29±0.14 86.12±0.11 83.01±0.36
注:“-”表示没有抑制作用。下同。
Note:“-”means no inhibition.The same as below.
2.3 乙酸乙酯萃取相对4种植物病原真菌菌丝
生长的抑制毒力
以菌丝生长速率法测定0.312 5、0.625、
1.25、2.5和5.0g/L质量浓度的乙酸乙酯萃取
相对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、玉米小斑病菌
和水稻稻瘟病菌菌丝生长的抑制。结果表明,随
质量浓度的增加,巴东醉鱼草提取物乙酸乙酯萃
取相对以上4种病原真菌菌丝生长的抑制作用均
呈增强趋势,EC50值分别为0.492、0.534、0.531
和0.938g/L(表4)。
表4 乙酸乙酯萃取物对4种植物病原真菌菌丝生长的抑制毒力
Table 4 Toxicity of ethyl acetate extract on four plant pathogenic fungi
供试病原真菌
Tested fungus
毒力回归方程
Regression
equation
相关系数(r)
Correlation
coefficient
EC50/(g/L)
95%置信限/(g/L)
95%confidence
limit
油菜菌核病菌 S.sclerotiorum (Lib.)de Bary y=0.090 0x+0.472 5 0.980 7 0.492 0.429~0.565
番茄灰霉病菌 B.cirerea Pers Fr. y=0.080 9x+0.459 8 0.967 3 0.534 0.442~0.644
玉米小斑病菌 B.maydis y=0.066 4x+0.465 5 0.991 1 0.531 0.408~0.690
水稻稻瘟病菌 P.oryzae Cav. y=0.102 2x+0.341 7 0.995 6 0.938 0.799~1.102
注:y代表菌丝生长抑制率机率值,x代表药剂浓度的对数值。
Note:y meas probability value of mycelial growth inhibition rate,x means logarithm value of agent mass concentration.
3 讨论与结论
本研究测定巴东醉鱼草提取物及不同极性溶
剂萃取相对植物病原真菌的抑制作用,乙醇提取
物对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、玉米小斑病菌
和水稻稻瘟病菌等4种病原真菌具有显著的抑制
作用,不同溶剂萃取相对以上4种病原菌菌丝生
长的抑制作用差异较大,其中乙酸乙酯萃取相对
油菜菌核病菌的作用最强,这说明巴东醉鱼草中
的抑菌活性成分主要集中在中等极性部位,对该
·441· 西 北 农 业 学 报 25卷
部分提取物的进一步跟踪分离有望获得具有开发
应用前景的抑菌活性化合物。
巴东醉鱼草中含有多种次生代谢产物,如黄
酮[12]、甾体[13]、萜类[14]等,这些物质对农业害虫
具有较强的毒杀活性[7-9],使其具有一定的应用前
景。本研究结果表明,巴东醉鱼草提取物具有较
强的抑菌活性,杀菌谱较宽,因此有望对其进一步
研究开发为生物源杀菌剂。为巴东醉鱼草资源的
综合开发利用提供一条新的途径。但该研究仅限
于对巴东醉鱼草总浸膏及不同极性溶剂萃取相的
抑菌活性进行初步的研究,对其中的抑菌活性成
分的分离纯化、田间药效、作用机理等尚待深入
探讨。
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·541·1期 谢玉峰等:巴东醉鱼草提取物抑菌活性研究
Study on the Antifungal Activity of Ethanol
Extract fromBuddlejaalbifloraHemsl.
XIE Yufeng,ZHANG Xiuyun,WEI Zhiping,SHEN Jing and WANG Yonghong
(Research and Development Center of Biorational Pesticide,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)
Abstract The inhibitory effects of Buddleja albiflora Hemsl.against pathogens were evaluated by
the method of mycelial growth rate.The extract of B.albiflora Hemsl.showed moderate antifungal
activities against 24pathogenic fungi,among which,higher activities were shown against Bipolaria
maydis,Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)de Bary,Botrytis cirerea Pers Fr.and Pyricularia oryzae
Cav.,up to 80%under the mass concentration of 10g/L(dried sample).The petroleum extract,eth-
yl acetate extract and n-butanol extract were then obtained successively.The ethyl acetate extract
showed the highest inhibition against the four kinds of selected fungi,up to 75%,among which,
89.14%inhibitory rate against Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)de Bary under the mass concentration
of 5g/L,and 71.37%,1g/L.Further research derived the EC50values of 0.492,0.534,0.531and
0.938g/L against the four kinds of selected fungi.It is suggested that the antifungal actives may be
the medium polarity compositions in B.albiflora Hemsl.extracts.
Key words Buddleja albiflora Hemsl.;Antifungal activity;Botanical fungicide;Plant extract
Received 2015-01-20 Returned 2015-06-17
Foundation item The National Natural Science Foundation of China(No.31101486);Special Fund
for Agro-scientific Research in Agriculture(No.K312021014);the Key Project of Agriculture Re-
search of Shaanxi(No.2010K02-09-1).
First author XIE Yufeng,male,master student.Research area:pesticide toxicology.E-mail:fen-
gafeia082@163.com
Corresponding author WANG Yonghong,male,research felow,Ph.D tutor.Research area:pesticide
toxicology.E-mail:yhwang@nwsuaf.edu.cn
(责任编辑:史亚歌 Responsible editor:SHI Yage)
·641· 西 北 农 业 学 报 25卷