全 文 ：第 52 卷 第 9 期
2 0 1 6 年 9 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 52，No. 9
Sep．，2 0 1 6
doi:10．11707 / j．1001-7488．20160905
收稿日期:2015 － 08 － 20;修回日期:2015 － 09 － 16。
基金项目:国家高技术研究发展计划(2013AA102705);国家自然科学基金面上项目(31270702)。
* 甘四明为通讯作者。
细叶桉群体的遗传多样性和受选择位点*
宋志姣1，2，4 杨合宇2 翁启杰2 周长品2 李发根2 李 梅2
卢万鸿3 罗建中3 甘四明1，2
(1． 林木遗传育种国家重点实验室(中国林业科学研究院) 北京 100091;
2． 中国林业科学研究院热带林业研究所 热带林业研究国家林业局重点实验室 广州 510520;
3． 国家林业局桉树研究开发中心 湛江 524022;4． 保山学院 保山 678000)
摘 要:【目的】分析细叶桉天然群体的多样性水平和遗传结构，为种质资源管理和育种利用提供有用信息;检
测细叶桉与原产地气候因子显著关联的基因组位点，探索气候适应过程中趋异选择的分子证据。【方法】以细叶
桉 9 个群体的 77 株样品为材料，基于覆盖巨桉全基因组的 108 个 SSＲ位点(包括 44 个基因组 SSＲs 和 64 个 EST-
SSＲs)，利用不偏离哈 －温平衡、FST值非异常的 25 个中性的基因组 SSＲs进行群体多样性水平和遗传结构分析，利
用所有位点进行 FST异常值检测、再利用空间分析法查找与原产地气候因子关联的适应性位点，注释适应性位点的
功能，并通过等位片段在各群体的频率与气候因子的一元线性回归进一步验证关联的显著性。【结果】25 个中性
的基因组 SSＲ位点对细叶桉 9 个群体扩增，共检测到 556 个等位片段、平均每个位点 22. 2 个等位片段，位点多态
性较高;群体多样性水平都较高，期望杂合度为 0. 711 ～ 0. 847 (平均 0. 800)、基因丰富度为 3. 054 ～ 3. 386 (平均
3. 246)，各群体特有等位片段数为 6 ～ 26 (平均 14. 4);群体间分化水平较低，25 个中性位点平均 FST仅 0. 012，分子
方差分析中群体间方差分量仅占 1. 2%，表明细叶桉遗传变异主要存在于群体内;聚类分析也表明群体分化水平较
低。所有 108 个位点中，共检测到 78 个 FST值异常的位点，与年均气温、年均降水、最热月最高温度和季节性降水
变异系数相关的 FST值异常的位点数分别为 27，10，51 和 42 个，即为受选择位点;其中，4 个 FST值异常的位点各有 1
个等位片段在空间分析法中与 1 个或者 2 个气候因子显著关联，EUCeSSＲ485 与季节性降水变异系数相关、为富含
羟脯氨酸的蛋白家族基因，EUCeSSＲ0497 与年均气温和年均降水均相关、与跨膜内切 1，4 － β －葡聚糖酶基因同
源，而另外 2 个没有明确的功能注释;线性回归分析验证了 1 个等位片段(EUCeSSＲ485-140 bp)与季节性降水变异
系数的回归显著性(P ≤ 0. 05)。【结论】细叶桉群体的遗传多样性高，育种利用的潜力大，种质资源管理应重视多
样性较高和特有等位片段较多的群体;细叶桉群体的遗传分化较低，其适于关联遗传分析;受选择位点的鉴定有助
于理解林木适应环境的分子机制和探索林木环境适应性的潜力。
关键词: 细叶桉;SSＲ标记;遗传多样性;群体结构;适应性
中图分类号:S718. 46;S718. 51 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2016)09 － 0039 － 09
Genetic Diversity and Selective Loci in Eucalyptus tereticornis Populations
Song Zhijiao1，2，4 Yang Heyu2 Weng Qijie2 Zhou Changpin2 Li Fagen2
Li Mei2 Lu Wanhong3 Luo Jianzhong3 Gan Siming1，2
(1． State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Chinese Academy of Forestry) Beijing 100091;2． Key Laboratory of
State Forestry Administration on Tropical Forestry Ｒesearch Ｒesearch Institute of Tropical Forestry，Chinese Academy of
Forestry Guangzhou 510520;3． China Eucalypt Ｒesearch Centre Zhanjiang 524022;4． Baoshan University Baoshan 678000)
Abstract:【Objective】Genetic diversity and population structure were analyzed in an important tree species Eucalyptus
tereticornis to provide useful information for germplasm management and breeding． Genomic loci significantly associated
with habitat climatic variables were identified to explore the molecular signature of divergent selection during climatic
adaptation． 【Method】A total of 77 individuals sampled from nine E． tereticornis populations were analyzed using 108
simple sequence repeats (SSＲ)markers spanning the E． grandis genome，including 44 genomic SSＲs and 64 expressed
sequence tag (EST)derived SSＲs． The genetic diversity and population structure were assessed using 25 putatively
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neutral genomic SSＲ loci that neither departed from Hardy-Weinberg equilibrium nor showed FST outlying values． FST
outlying loci and their significant associations with habitat climatic variables were investigated for all the 108 SSＲs，with
further functional annotation of the significantly associated loci． The significance of associations was also tested through
univariate linear regression analysis between the allelic frequency and the climatic factor． 【Ｒesults】A total of 556 alleles
were detected，averaging at 22. 2 alleles per locus and indicating high levels of locus polymorphism． Population diversity
was high，with expected heterozygosity 0. 711 － 0. 847 (mean 0. 800)，allelic richness 3. 054 － 3. 386 (mean 3. 246)and
number of private alleles 6 － 26 (mean 14. 4)． Population differentiation was extremely low，with mean FST = 0. 012 at 25
putative neutral genomic SSＲs as well as among-population variation percentage of 1. 2% in analysis of molecular variance
(AMOVA)， indicating within-population accounting for the majority of genetic variations． The clustering analysis
indicated also a low level of population differentiation． A total of 78 FST outliers were identified as selective loci form all
the 108 SSＲ loci，and the numbers of outliers related with mean annual temperature，mean annual precipitation，maximum
temperature of the warmest month and precipitation seasonality were 27，10，51 and 42，respectively． Four alleles from
independent outlier loci were revealed with spatial analysis methods (SAM)，each associated with one or two climatic
factors． Of the four selective loci，EUCeSSＲ485 associated with precipitation seasonality climatic factors was functionally
annotated as a member of hydroxylproline-rich glycoprotein gene family，and EUCeSSＲ0497 with mean annual temperature
and mean annual precipitation was homologous to membrane-anchored endo-1，4-beta-glucanase gene，while the rest two
loci were of unknown function． One significant association between frequency of EUCeSSＲ485-140 bp and precipitation
seasonality was validated with univariate linear regression (P ≤ 0. 05)．【Conclusion】The high levels of genetic diversity
in E． tereticornis may suggest that great potential can be expected in breeding and attention should be paid to those
populations with higher diversity and more private alleles in germplasm management． The low genetic differentiation may
indicate that E． tereticornis populations are suitable for further association genetics analysis． The selective loci indentified
herein may help in understanding the molecular mechanism of adaptation to environments and exploring the adaptation
potential in forest trees．
Key words: Eucalyptus tereticornis;SSＲ marker;genetic diversity;population structure;adaptation
桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)双蒴盖
亚属(Symphyomyrtus)细叶桉(E． tereticornis)是优良
的纸浆和人造板工业用材树种，在全球热带和亚热
带地区广为引种(Eldridge et al．，1993)。细叶桉天
然分布于巴布亚新几内亚南部和澳大利亚东海岸
(9°—38°S)海边至内陆 100 km的广大区域，海拔范
围 0 ～ 1 500 m，分布区包括多种气候类型、年降雨量
500 ～ 1 500 mm (Eldridge et al．，1993)。相应地，细
叶桉表型性状的变异较大，种源 /家系试验表明其生
长、干形、分枝和木材性质等性状均变异显著(王豁
然等，1988;徐建民等，1993;2003;梁坤南等，1995;
Chamshama et al．，1999;陆钊华等，2000;Varghese
et al．，2009;Luo et al．，2014)，一些种源甚至可耐受
－ 7. 9 ℃的冻害(林睦就等，2003)。但是，细叶桉分
子水平上的变异却较少研究，只有 Butcher 等
(2009)利用简单重复序列(simple sequence repeats，
SSＲ)和限制性片断长度多态性(restriction fragment
length polymorphism，ＲFLP)分析了 3 个群体，张党权
等(2009)利用简单重复序列区间(inter-simple
sequence repeats，ISSＲ)分析了 4 个小群体，更大范
围乃至全分布区的群体多样性研究尚待开展。多样
性水平的研究有助于阐明群体变异的范围和结构，
对种质资源管理和育种策略制定亦有重要的参考价
值(Yanchuk，2001)。
细叶桉广泛的分布区和原产地多种气候类型也
为群体适应性研究提供了材料。适应性是生境条件
对群体长期自然选择的结果，从而导致群体间基因
频率的不同(Jump et al．，2006)，进而引起表型和遗
传结构的分化(Savolainen et al．，2007)。因此，阐明
与自然选择有关的基因或基因组位点对理解适应性
的遗传基础和指导种质资源的保护均有重要意义
(Savolainen et al．，2013;Alfaro et al．，2014)。桉属
中，目前仅在棒头桉(E． gomphocephala)(Bradbury
et al．，2013)和毛果桉(E． tricarpa)(Steane et al．，
2014)中研究了自然选择相关位点，2 个树种分布范
围均较窄(前者为西澳海岸 30. 4°—33. 6°S，后者为
南澳沿海 36. 7°—37. 5°S)，而对分布范围较广的树
种却没有报道。本研究基于覆盖全基因组的 44 个
基因组 SSＲs 和 64 个开发自表达序列标签
(expressed sequence tag，EST)的 SSＲs，利用 25 个中
性的基因组 SSＲs分析 9 个细叶桉群体的遗传多样
性和群体结构，利用全部标记分析受自然选择的候
04
第 9 期 宋志姣等:细叶桉群体的遗传多样性和受选择位点
选位点，旨在明确该树种的遗传多样性和群体分化
水平以及探索适应性的分子机制，并为种质资源管
理和育种利用提供有用信息。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
选取细叶桉 9 个天然群体的 77 个半同胞家系，
每个家系选取 1 株生长正常的植株，各群体包含
4 ～ 19株(表 1)。叶样采自 2012 年 8 月营建的、位
于广东省遂溪县的细叶桉种源 /家系试验林，参试家
系的种子均采自天然林、母树间隔 100 m以上，由澳
大利亚林木种子中心和 Kylisa种子公司提供。叶样
采后临时保存在放有冰袋的泡沫盒中，带回实验室
即置于 － 80 ℃冰箱备用。
表 1 参试的细叶桉 9 个天然群体及其地理位置①
Tab． 1 The nine populations of E． tereticornis tested and their geographical origins
序号
No．
群体(缩写)
Population (abbreviation)
群体大小
Population size
纬度 N
Latitude (S)
经度
Longitude (E)
海拔
Altitude /m
1 Normanby Ｒiver，QLD (Nor) 10 15°46 145°00 140
2 Little Mulgrave Deeral，QLD (Lit) 5 17°09 145°52 40
3 Walsh Ｒiver，QLD (Wal) 5 17°20 145°18 762
4 Cardwell，QLD (Car) 5 18°10 145°58 84
5 Lava Plains，QLD (Lav) 19 18°20 144°46 925
6 Burdekin Ｒiver，QLD (Bur) 4 19°48 146°04 291
7 Calliope Ｒiver，QLD (Cal) 12 22°52 149°48 30
8 Kalpower，QLD (Kal) 7 23°57 151°09 350
9 Marborough，QLD (Mar) 10 24°40 151°19 100
① Lava Plains群体由澳大利亚 Kylisa种子公司提供，其余为澳大利亚林木种子中心提供。QLD:澳大利亚昆士兰州。The population Lava
Plains was provided by ATC Kylisa Seed Co．，and the rest populations were provided by Australian Tree Seed Centre． QLD:Queesland，Australia．
1. 2 DNA提取和 SSＲ标记试验
称取 0. 3 g叶样放入 1. 5 mL Eppendorf管，液氮
冷冻后通过球磨仪 MM400 (Ｒetsch GmbH，德国)粉
碎，采用改良 CTAB法提取 DNA (Gan et al．，2003)。
利用 NanoDrop 2000 (Thermo Scientific，美国)测定
DNA浓度和纯度。
基于已经发表的桉树 SSＲ 标记，选取在巨桉
(E． grandis)全基因组上分布较均匀的 108 个 SSＲ
位点(包括 44 个基因组 SSＲs 和 64 个 EST-SSＲs)
(表 2)。考虑到所选 SSＲ 位点在基因组上相距较
远，认为位点间不存在连锁不平衡。SSＲ 引物由上
海英骏生物技术有限公司合成。
SSＲ分型通过在 10 μL PCＲ 反应中加入荧光
dUTP (Fermentas，加拿大)、采用降落 PCＲ 扩增程
序、PCＲ 产物利用 ABI 3130xl 测序仪(Applied
Biosystems，美国)检测，具体参考 Li 等(2011)，PCＲ
反应的 Mg2 + 浓度和扩增的退火温度视 SSＲ 标记
而定。
1. 3 数据分析
1. 3. 1 位点多样性分析 对于各位点，利用
Genepop 4. 2 软件(Ｒousset，2008)检测哈 －温平衡
(P ≤ 0. 01，随机检测 1 000 次)，利用 PowerMarker
3. 25 (Liu et al．， 2005)计 算 多 态 性 信 息 量
(polymorphism information content， PIC)，利 用
GenAlEx 6. 4. 1 (Peakall et al．，2006)计算等位片段
数(number of alleles，Na)、观测杂合度(observed
heterozygosity，Ho )、期 望 杂 合 度 (expected
heterozygosity，He)和固定指数(fixation index，F)，利
用 FSTAT 2. 9. 3. 2 (http:/ /www2． unil． ch /popgen /
softwares / fstat． htm)计算等位片段丰富度(allelic
richness，AＲ;基于最小群体的样品数)、群体间分化
系数(between-population differentiation，FST)、群体内
近交 系 数 (inbreeding coefficients of individuals
relative to the sub-population，FIS)和群体间近交系数
(inbreeding coefficients of individuals relative to the
total population，FIT)，利用 FreeNA (Chapuis et al．，
2007)计算哑等位频率(null allele frequency，NAF)。
1. 3. 2 群体多样性分析 因中性标记更适于群体
分析(Black et al．，2001)，只将既不偏离哈 －温平
衡、也在 LOSITAN分析中(见下文)FST非异常值的
25 个中性的基因组 SSＲ 用于群体多样性和群体结
构分析。
利用 GenAlEx 6. 4. 1 (Peakall et al．，2006)计算
各群体 Na，Ho，He和 F 等参数，利用 FSTAT 2. 9. 3. 2
(http:/ /www2． unil． ch /popgen /softwares / fstat． htm)
计算 AＲ(基于最小群体的样品数)，手动统计特有等
位片段数(number of private alleles，Npa)。
1. 3. 3 群体结构分析 利用 EXCEL 计算 25 个中
性位点对所有群体的 FST，FIS和 FI T平均值，利用
GenAlEx 6. 4. 1 (Peakall et al．，2006)进行分子方差
14
林 业 科 学 52 卷
表 2 参试的 108 个 SSＲ位点①
Tab． 2 The 108 SSＲ loci used in this study
序号
No．
SSＲ位点
SSＲ locus
参考文献
Ｒeference
序号
No．
SSＲ位点
SSＲ locus
参考文献
Ｒeference
序号
No．
SSＲ位点
SSＲ locus
参考文献
Ｒeference
1a EUCeSSＲ1061 Zhou et al．，2014 37c EUCeSSＲ840 He et al．，2012 73b EUCeSSＲ1087 Zhou et al．，2014
2b EUCeSSＲ1039 Zhou et al．，2014 38b Embra120 Brondani et al．，2006 74b EUCeSSＲ683 He et al．，2012
3a Embra180 Brondani et al．，2006 39b Embra41* Brondani et al．，2006 75 EUCeSSＲ522 He et al．，2012
4b Embra366* Brondani et al．，2006 40b EUCeSSＲ626 He et al．，2012 76b Embra197 Brondani et al．，2006
5b EUCeSSＲ485 He et al．，2012 41c Embra64 Brondani et al．，2006 77b Embra150* Brondani et al．，2006
6c Embra100 Brondani et al．，2006 42a Embra111 Brondani et al．，2006 78b EUCeSSＲ0163 Zhou et al．，2014
7 EUCeSSＲ0333 Zhou et al．，2014 43 Embra370* Brondani et al．，2006 79 EUCeSSＲ1070 Zhou et al．，2014
8a EUCeSSＲ347 He et al．，2012 44 EUCeSSＲ0455 Zhou et al．，2014 80b Embra88 Brondani et al．，2006
9b EUCeSSＲ1136 周长品等
，2010
(Zhou et al．，2010 ) 45
a Embra358 Brondani et al．，2006 81a Embra53＊＊ Brondani et al．，2006
10a Embra98＊＊ Brondani et al．，2006 46a Embra304* Brondani et al．，2006 82 EUCeSSＲ0226 Zhou et al．，2014
11b EUCeSSＲ0502 Zhou et al．，2014 47 EUCeSSＲ0103 Zhou et al．，2014 83b EUCeSSＲ0497 Zhou et al．，2014
12a EUCeSSＲ0224 Zhou et al．，2014 48a Embra188 Brondani et al．，2006 84 EUCeSSＲ0845 Zhou et al．，2014
13b EUCeSSＲ0276 Zhou et al．，2014 49 EUCeSSＲ0906 Zhou et al．，2014 85b EUCeSSＲ1125 Zhou et al．，2014
14 Embra333 Brondani et al．，2006 50a Embra37 Brondani et al．，2006 86 EUCeSSＲ0592 Zhou et al．，2014
15a Embra201＊＊ Brondani et al．，2006 51 EUCeSSＲ1134 Zhou et al．，2014 87c EUCeSSＲ0909 Zhou et al．，2014
16 EUCeSSＲ0930 Zhou et al．，2014 52b Embra187* Brondani et al．，2006 88c Embra217 Brondani et al．，2006
17 EUCeSSＲ410 He et al．，2012 53b EUCeSSＲ346 He et al．，2012 89b EUCeSSＲ0679 Zhou et al．，2014
18b EUCeSSＲ0979 Zhou et al．，2014 54a EUCeSSＲ0755 Zhou et al．，2014 90a EUCeSSＲ596 He et al．，2012
19 Embra115 Brondani et al．，2006 55c EUCeSSＲ0705 Zhou et al．，2014 91a Embra40 Brondani et al．，2006
20 Embra227* Brondani et al．，2006 56 Embra196 Brondani et al．，2006 92b EUCeSSＲ1044 Zhou et al．，2014
21a EUCeSSＲ1060 周长品等
，2010
(Zhou et al．，2010) 57
c Embra233 Brondani et al．，2006 93 EUCeSSＲ0568 Zhou et al．，2014
22 Embra280 Brondani et al．，2006 58a EUCeSSＲ338 He et al．，2012 94a EUCeSSＲ0126 Zhou et al．，2014
23a Embra377 Brondani et al．，2006 59b EUCeSSＲ231 He et al．，2012 95 Embra394 Brondani et al．，2006
24b Embra321* Brondani et al．，2006 60b EUCeSSＲ0959 Zhou et al．，2014 96b Embra87 Brondani et al．，2006
25b EUCeSSＲ313 He et al．，2012 61b EUCeSSＲ739 He et al．，2012 97b Embra165* Brondani et al．，2006
26b EUCeSSＲ0857 Zhou et al．，2014 62 EUCeSSＲ0620 Zhou et al．，2014 98b Embra326* Brondani et al．，2006
27b EUCeSSＲ384 He et al．，2012 63a Embra135＊＊ Brondani et al．，2006 99 EUCeSSＲ1117 Zhou et al．，2014
28b Embra125* Brondani et al．，2006 64b Embra345＊＊＊ Brondani et al．，2006 100a EUCeSSＲ0893 Zhou et al．，2014
29 EUCeSSＲ0599 Zhou et al．，2014 65b EUCeSSＲ0776 Zhou et al．，2014 101 Embra269 Brondani et al．，2006
30b Embra130 Brondani et al．，2006 66b EUCeSSＲ880 He et al．，2012 102 EUCeSSＲ1021 Zhou et al．，2014
31 EUCeSSＲ0035 Zhou et al．，2014 67 Embra81 Brondani et al．，2006 103a EUCeSSＲ292 He et al．，2012
32b EUCeSSＲ0803 Zhou et al．，2014 68a EUCeSSＲ1042 Zhou et al．，2014 104 EUCeSSＲ349 He et al．，2012
33c EUCeSSＲ151 He et al．，2012 69b Embra7* Brondani et al．，2006 105a EUCeSSＲ209 He et al．，2012
34a EUCeSSＲ686 He et al．，2012 70a Embra83＊＊ Brondani et al．，2006 106 EUCeSSＲ0849 Zhou et al．，2014
35b EUCeSSＲ0862 Zhou et al．，2014 71 EUCeSSＲ0875 Zhou et al．，2014 107b Embra258* Brondani et al．，2006
36a Embra242 Brondani et al．，2006 72b Embra369 Brondani et al．，2006 108a EUCeSSＲ1145 Zhou et al．，2014
① 前缀为 EUCeSSＲ的标记为 EST-SSＲ标记(64 个)，其余为基因组 SSＲ(44 个)。* :偏离哈 －温平衡的基因组 SSＲ (P ≤ 0. 01;13 个位
点);＊＊:FST值异常的基因组 SSＲ (5 个位点);＊＊＊:既偏离哈 －温平稳(P ≤ 0. 01)又是 FST异常值的基因组 SSＲ (1 个位点)。a:1 个或多个
气候因子分组中大于 95%置信水平的 FST值异常位点(趋异选择位点，28 个);b:1 个或多个气候因子分组中低于 5%置信水平的 FST值异常位
点(平衡选择位点，42 个);c:不同气候因子分组中 FST异常值既有大于 95%置信水平的、又有低于 5%置信水平的位点(8 个)。The prefix
EUCeSSＲ indicates EST-SSＲs (64 markers)while the rest are of genomic SSＲs (44 markers)． * :Genomic SSＲ departed from Hardy-Weinberg
equilibrium (P ≤ 0. 01;13 loci);＊＊:Genomic SSＲ being FST outlier (five loci);＊＊＊:Genomic SSＲs both departed from Hardy-Weinberg
equilibrium (P ≤ 0. 01)and being FST outlier (one locus)． a:FST outlier above 95% confidence interval in one or more climatic partitions (divergent
selection，28 loci);b:FST outlier below 5% confidence interval in one or more climatic partitions (balancing selection，42 loci);c:FST outlier above 95%
or below 5% confidence interval in different climatic partitions (eight loci)．
分析(analysis of molecular variances，AMOVA);利用
PowerMarker 3. 25 (Liu et al．，2005)计算群体间
Nei’s 遗传距离，采用非加权分组算术平均法
(unweighted pair group method with arithmetic mean，
UPGMA)进行聚类分析。
1. 3. 4 受选择位点的检测 对所有 108 个 SSＲs，受
选择位点的检测采用 FST异常值和与气候因子关联分
析 2 种方法。因部分群体较小，参考 Prunier 等
(2011;2012)首先根据原产地的气候因子进行群体分
组，从 http:/ /www． worldclim． org / (Hijmans et al．，
24
第 9 期 宋志姣等:细叶桉群体的遗传多样性和受选择位点
2005)下载原产地 1950—2000 年的 19 个气候因子的
数据，用 Ｒ软件的 cor． test 功能检测气候因子之间的
相关性，只取相关不显著的气候因子(P ≤ 0. 05)进
行 9个群体的 K-means分组(Legendre et al．，1998)。
根据各气候因子的群体分组，利用 LOSITAN
(Antao et al．，2008)通过 FST与 He的分布确定 FST值
异常的位点，选项设置为无限等位突变模型、模拟重
复 100 000 次，FST值高于 95%置信区间则为趋异选
择(或正向选择)、低于 5%置信区间则为平衡选择，
假阳性率设为 0. 01。
对于 FST异常值的位点，再通过空间分析法
(spatial analysis method，SAM)(Joost et al．，2007)检
测等位频率与气候因子的关联，采用似然比值 G 和
Wald检测(α = 0. 01)以及 Bonferroni 校正，关联显
著性的置信水平为 99. 99%。显著关联位点的功能
注释通过 BlastX 比对 GenBank 非冗余蛋白库
(http:/ /blast． ncbi． nlm． nih． gov /Blast． cgi;E ≤
10 －5)。为校正等位频率的自相关，通过等位片段
在各群体的频率与气候因子的一元线性回归进一步
验证关联的显著性(Narum et al．，2010)。
2 结果与分析
2. 1 位点和群体多样性
44 个基因组 SSＲ 位点中，14 个偏离哈 －温平
衡，6 个显示 FST值异常，其中 1 个同时偏离哈 －温
平衡和显示 FST值异常 (表 2)，其余 25 个中性的基
因组 SSＲ 用于群体多样性和群体结构分析。表 3
列出了这 25 个位点对细叶桉 9 个群体的多样性参
数，共检测到 556 个等位片段、平均每位点 22. 2 个
等位片段;位点多态性均较高，如 PIC 为 0. 680 ～
0. 954 (平均 0. 904)，按 PIC ≥ 0. 5 的标准(Botstein
et al．，1980)均为多态性高的位点。
表 3 25 个中性的基因组 SSＲ位点的多样性参数①
Tab． 3 Diversity indices for 25 putatively neutral genomic SSＲs tested
序号
No．
SSＲ位点
SSＲ locus
Na PIC NAF AＲ Ho He F FST FIS FIT
1 Embra269 22 0. 924 0. 041 3. 428 0. 768 0. 830 0. 064 0. 026 0. 166 0. 187
2 Embra130 23 0. 902 0. 048 3. 383 0. 747 0. 830 0. 100 0. 003 0. 144 0. 146
3 Embra120 22 0. 931 0. 052 3. 532 0. 743 0. 841 0. 115 0. 011 0. 207 0. 216
4 Embra87 29 0. 948 0. 171 3. 488 0. 533 0. 854 0. 382 － 0. 004 0. 439 0. 437
5 Embra64 21 0. 906 0. 079 2. 951 0. 640 0. 782 0. 193 0. 036 0. 248 0. 275
6 Embra394 17 0. 783 0. 116 3. 035 0. 521 0. 725 0. 289 0. 014 0. 340 0. 348
7 Embra115 18 0. 910 0. 141 3. 395 0. 560 0. 816 0. 309 0. 014 0. 402 0. 410
8 Embra88 21 0. 928 0. 057 2. 883 0. 756 0. 774 － 0. 020 0. 013 0. 200 0. 210
9 Embra369 17 0. 905 0. 046 3. 360 0. 767 0. 839 0. 086 0. 003 0. 137 0. 140
10 Embra280 21 0. 930 0. 259 3. 159 0. 349 0. 813 0. 583 － 0. 013 0. 564 0. 558
11 Embra333 16 0. 834 0. 088 3. 098 0. 619 0. 772 0. 197 － 0. 003 0. 275 0. 273
12 Embra37 20 0. 922 0. 104 3. 125 0. 585 0. 790 0. 267 0. 029 0. 269 0. 291
13 Embra180 18 0. 916 0. 106 3. 176 0. 609 0. 799 0. 246 0. 037 0. 239 0. 267
14 Embra233 20 0. 906 0. 237 3. 108 0. 363 0. 734 0. 452 － 0. 002 0. 688 0. 688
15 Embra242 15 0. 866 0. 141 2. 953 0. 509 0. 750 0. 332 0. 043 0. 340 0. 368
16 Embra40 19 0. 914 0. 039 3. 343 0. 747 0. 811 0. 078 0. 031 0. 168 0. 194
17 Embra111 27 0. 933 0. 069 3. 547 0. 684 0. 841 0. 194 0. 007 0. 207 0. 213
18 Embra358 31 0. 949 0. 311 3. 025 0. 259 0. 826 0. 699 － 0. 001 0. 678 0. 677
19 Embra196 33 0. 954 0. 136 3. 502 0. 574 0. 846 0. 325 0. 010 0. 429 0. 434
20 Embra100 25 0. 934 0. 070 3. 325 0. 713 0. 766 0. 042 0. 035 0. 196 0. 224
21 Embra188 31 0. 928 0. 055 3. 415 0. 695 0. 810 0. 155 0. 021 0. 222 0. 239
22 Embra197 16 0. 680 0. 050 2. 649 0. 572 0. 675 0. 154 － 0. 007 0. 247 0. 241
23 Embra217 24 0. 920 0. 082 3. 580 0. 732 0. 836 0. 121 0. 005 0. 205 0. 209
24 Embra377 23 0. 941 0. 139 3. 283 0. 556 0. 795 0. 265 － 0. 006 0. 410 0. 406
25 Embra81 27 0. 928 0. 137 3. 418 0. 601 0. 846 0. 299 0. 015 0. 331 0. 341
合计 Total 556
平均值(标准误)
Mean (SE)
22. 2
(5. 1)
0. 904
(0. 060)
0. 111
(0. 072)
3. 246
(0. 241)
0. 608
(0. 016)
0. 800
(0. 006)
0. 237
(0. 021)
0. 012
(0. 003)
0. 316
(0. 032)
0. 324
(0. 030)
① Na:等位片段数;PIC:多态性信息量;NAF:哑等位频率;AＲ:等位片段丰富度;Ho:观测杂合度;He:期望杂合度;F:固定指数;FST:群
体间分化系数;FIS:群体内近交系数;FIT:群体间近交系数;SE:标准误。下同。Na:Number of alleles;PIC:Polymorphism information content;
NAF:Null allele frequency;AＲ:Allelic richness;Ho:Observed heterozygosity;He:Expected heterozygosity;F:Fixation;FST:Between-population
differentiation;FIS:Inbreeding coefficients of individuals relative to the sub-population;FIT:Inbreeding coefficients of individuals relative to the total
population;SE:Standard error． The same below．
34
林 业 科 学 52 卷
表 4 列出了细叶桉 9 个群体的 SSＲ 多样性参
数。群体多样性水平都较高，如 He为 0. 711 ～ 0. 847
(平均 0. 800)、AＲ为 3. 054 ～ 3. 386 (平均 3. 246)。
各群体均有特有等位片段，数量为 6 ～ 26 (平均
14. 4)。但固定指数相对较高，平均达 0. 237，表明
多数群体内存在一定程度的近交。
2. 2 群体结构
群体间分化水平较低，25 个中性的基因组位点
平均 FST仅 0. 012 (表 3);AMOVA 分析也表明群体
间方差分量仅占 1. 2% (表 5)。这表明细叶桉的群
体分化水平较低。同时，25 个位点的平均近交系数
与 AMOVA结果较一致，如 FIS分别为 0. 316 (表 3)
与 0. 386 (表 5)、FIT分别为 0. 324 (表 3)和 0. 394
(表 5)，表明细叶桉群体变异主要存在于群体内。
并且，聚类分析中 9 个群体逐步聚类(图 1)，很难再
区分亚类，也表明细叶桉具有较低分化的群体结构。
表 4 细叶桉 9 个天然群体的 SSＲ多样性参数①
Tab． 4 SSＲ diversity indices of nine populations of E． tereticornis tested
群体
Population
位点平均等位片段数
Mean Na per locus
特有等位片段数
Number of private alleles
观测杂合度
Ho
期望杂合度
He
固定指数
F
等位片段丰富度
AＲ
Nor 8. 1 16 0. 664 0. 836 0. 206 3. 111
Lit 4. 4 12 0. 572 0. 795 0. 287 3. 332
Wal 4. 2 6 0. 528 0. 759 0. 306 3. 150
Car 4. 0 6 0. 585 0. 742 0. 211 3. 088
Lav 16. 2 26 0. 649 0. 873 0. 259 3. 352
Bur 3. 1 10 0. 610 0. 705 0. 086 3. 334
Cal 10. 3 20 0. 631 0. 844 0. 253 3. 126
Kal 6. 1 12 0. 568 0. 800 0. 308 3. 335
Mar 8. 4 22 0. 667 0. 846 0. 216 3. 377
平均值(标准误)
Mean (SE)
7. 2
(4. 1)
14. 4
(7. 1)
0. 608
(0. 016)
0. 800
(0. 006)
0. 237
(0. 021)
3. 246
(0. 122)
① 群体缩写见表 1。Population abbreviations are listed in Tab． 1．
表 5 细叶桉群体内和群体间 AMOVA分析结果①
Tab． 5 AMOVA results for within-and among-population variations in E． tereticornis
变异来源
Source of variation
自由度
df
平方和
Sum of squares
均方
Mean square
方差分量
Variance
component
方差分量比
Percentage of
variance(%)
群体间 Among populations 8 143. 0 17. 9 0. 142 1. 2
群体内个体间 Among individuals within populations 68 1 055. 9 15. 5 4. 323 38. 1
个体间 Within individuals 77 530. 0 6. 9 6. 883 60. 7
总计 Total 153 1 728. 9 11. 348 100. 0
F统计量 F-statistics
FST 0. 012＊＊＊
FIS 0. 386＊＊＊
FIT 0. 394＊＊＊
① ＊＊＊:P ≤ 0. 001。
图 1 细叶桉 9 个群体的聚类分析
Fig． 1 UPGMA clustering of nine E． tereticornis populations
群体缩写见表 1。Population abbreviations are listed in Tab． 1．
2. 3 受选择的 SSＲ位点
群体产地的 19 个气候因子中，年均气温、年均
降水、最热月最高温度和季节性降水变异系数 4 个
因子互不相关，用于 K-means 分组可将 9 个群体分
别分为 4，2，4 和 4 组。FST异常值检测和 SAM 分析
均基于气候分组进行。
利用 LOSITAN (Antao et al．，2008)共检测到 78
个(72. 2%)FST值异常的位点(表 2)，即为受选择
的位点;年均气温、年均降水、最热月最高温度和季
节性降水变异系数相关的 FST值异常的位点数分别
为 27，10，51 和 42 个(数据未显示)，各气候因子上
FST异常值大于 95%置信水平的位点数分别为 21，
8，35 和 15 个，而小于 5%置信水平的位点数分别为
44
第 9 期 宋志姣等:细叶桉群体的遗传多样性和受选择位点
6，2，16 和 27 个。FST值异常的位点再进行 SAM 分
析，发现其中 4 个位点各有 1 个等位片段与 1 个或
者 2 个气候因子显著关联(表 6)。功能注释表明:
与季节性降水变异系数相关的 EUCeSSＲ485 位点与
富含羟脯氨酸的蛋白家族［hydroxylproline-rich
glycoprotein family protein (Vitis vinifera);2E － 14］有
关，与 年 均 气 温 和 年 均 降 水 均 相 关 的 位 点
EUCeSSＲ0497 与跨膜内切 1，4 － β － 葡聚糖酶
［ membrane-anchored endo-1， 4-beta-glucanase
(Gossypium hirsutum);2E － 12］基因同源，而
EUCeSSＲ880 和 EUCeSSＲ1125 没有明确的功能注
释。进一步的线性回归分析也验证了其中 1 个等位
片段(EUCeSSＲ485-140 bp)与季节性降水变异系数
存在显著的线性关系(P ≤ 0. 05)(图 2) ，而其余等
位片段与相关气候因子的线性回归不显著，可能存
在非线性关系。
表 6 SAM分析中与气候因子显著关联的位点和等位片段①
Tab． 6 Loci and their alleles significantly associated with climatic factors in SAM analyses
位点 －等位片段
Locus-allele /bp
所在的染色体
Scaffold
年均气温
Mean annual temperature
年均降水
Mean annual precipitation
季节性降水变异系数
Precipitation seasonality
EUCeSSＲ485-140 1 +
EUCeSSＲ880-388 6 + +
EUCeSSＲ0497-167 8 + +
EUCeSSＲ1125-168 9 + +
① 位点所在的染色体通过比对巨桉基因组(http:/ /www． phytozome． net /eucalyptus． php)确定。The scaffold to which a locus belongs is
determined with aligning with Eucalyptus grandis genome sequence (http:/ /www． phytozome． net /eucalyptus． php)．
图 2 EUCeSSＲ485-140 bp频率与季节性降水
变异系数的线性回归
Fig． 2 Univariate linear regression of the frequency of
EUCeSSＲ485-140 bp with precipitation seasonality
3 讨论
细叶桉群体的遗传多样性水平高，基于 25 个中
性的基因组 SSＲ 位点的 He为 0. 711 ～ 0. 847 (平均
0. 800)(表 3)。这与 Butcher 等(2009)基于 SSＲ分
析 3 个细叶桉群体 He为 0. 67 ～ 0. 83 的结果较一
致，也与基于 SSＲ分析的其他一些桉属树种的多样
性水平类似，如尾叶桉(E． urophylla)群体的平均 He
为 0. 739 (Payn et al．，2008)、棒头桉群体的平均 He
为 0. 75 (Bradbury et al．，2013)、蓝桉(E． globulus)
群体的平均 He为 0. 82 (Steane et al．，2006)。细叶
桉较高的遗传多样性应是其分布范围广、异交系统
和有效群体较大所致，这也是多数桉属树种的特点。
细叶桉的群体分化水平却偏低，平均 FST仅
0. 012 (表 3;表 5)。这类似于尾叶桉 FST为 0. 031
(Payn et al．，2008)，但显著低于同样分布广泛的赤
桉(E． camaldulensis，FST = 0. 08)(Butcher et al．，
2009)和蓝桉(FST = 0. 09)(Steane et al．，2006)。聚
类分析(图 1)也表明细叶桉群体分化水平较低。这
表明细叶桉较广的分布范围和不同的气候类型并未
引起明显的遗传分化，其原因可能与连续分布、虫媒
授粉和较为频繁的基因流有关。另一方面，尾叶桉
(Payn et al．，2008)和本文的材料均是天然林采种育
苗的子代、FST较低，而赤桉(Butcher et al．，2009)和
蓝桉(Steane et al．，2006)的材料是天然林直接采集
的植株样品，可能天然林的生境条件已在幼苗期对
适应性差的迁移个体进行了选择、从而导致相对较
高的群体分化参数(Kalisz et al．，2001)。
细叶桉群体的自然选择和适应可能涉及大量的
基因组位点，一些位点具有明确的功能。基于不相
关的 4 个气候因子的群体分组，共检测到 FST值异常
的 78 个 SSＲ 位点(72. 2%)，表明受选择的位点较
多。虽然 SAM分析只检测到其中 4 个位点与年均
气温、年均降水和季节性降水变异系数的 1 ～ 2 个因
子显著关联，但并不能认为其余 FST值异常位点是
假阳性的受选择位点(Prunier et al．，2011)。4 个显
著关联的位点中，与季节性降水变异系数相关的
EUCeSSＲ485 位点与富含羟脯氨酸的蛋白家族有
关，该类蛋白主要位于植物细胞的细胞壁、是细胞壁
伸展蛋白的主要成分(郭联华等，2010)，其参与多
种发育过程，如细胞胁迫反应(Showalter，1993)和细
胞伸长的停止(Ito et al．，1998 )，考虑到季节性降水
54
林 业 科 学 52 卷
变异系数对植物发育的复杂影响，该位点应具有多
种功能;与年均气温和年均降水均显著关联的位点
EUCeSSＲ0497 与跨膜内切 1，4 － β －葡聚糖酶基因
同源，该酶为普遍存在于植物体内的水解酶，自然条
件下植物生长、开花、果实成熟和器官脱落等过程均
可诱导其基因表达，Shani 等(1997)发现该酶的基
因 cel2 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)开花茎秆的
生长区高效表达，考虑到气温和降水对开花等过程
的显著影响，该位点的功能较好理解;另外 2 个相关
位点没有明确的功能注释，可以作为参与相关环境
适应的候选位点，或者也可能是因为这些位点与目
的基因连锁导致的‘搭便车’效应(Schltterer，
2003)。
相对较小的群体仍可有效估算群体多样性参
数。虽然本研究的多数群体较小、个体数不多，但与
之前桉属树种中利用 SSＲ 估算的群体参数相近。
类似地，Elliott 等(2003)利用 10 个群体、每群体 10
株有效地进行了西方桉(E． occidentalis)的多样性
分析。
本研究的结果对细叶桉种质资源管理和利用具
有重要作用。资源保存和育种利用需要重视遗传多
样性较高和特有等位片段数较多的群体，如 Lav，
Mar，Cal和 Nor 等群体，同时群体多样性水平普遍
较高也表明育种利用的潜力较好。虽然细叶桉分子
水平的群体遗传分化极低，但分子与表型的变异水
平可能不同(Steane et al．，2006)，之前的研究也表
明细叶桉具有较大的表型变异(Varghese et al．，
2009;Luo et al．，2014)，因此育种中仍需进行种源 /
家系的表型选择，尤其是考虑到林木表型易受环境
条件的影响。并且，因群体结构对标记与性状的关
联分析具有较大影响，细叶桉低的群体分化水平表
明该树种适于进一步进行标记与经济性状的关联研
究。另外，检测到的受选择位点有助于理解细叶桉
适应环境的分子机制，在当前气候变化背景下，这对
探索多年生林木的环境适应潜力有积极作用。
4 结论
本文首次系统地分析了细叶桉的群体多样性，
检测了细叶桉与原产地气候因子显著关联的基因组
位点，得到以下主要结论:1)细叶桉群体的遗传多
样性高，育种利用的潜力大，种质资源管理应重视多
样性较高和特有等位片段较多的群体;2)细叶桉
群体的遗传分化较低，其适于关联遗传分析;3)鉴
定了一批受选择位点，有助于理解林木适应环境的
分子机制和探索林木环境适应性的潜力。
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(责任编辑 徐 红)
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