全 文 ：收稿日期:2014-12-31
作者简介:何志超(1984-)，男，在读硕士研究生，专业方向:天然产物化学;E-mail:zhichaohe@ 163. com。
* 通讯作者:邱凯锋，Tel:020-81332451，E-mail:feng. qk@ 163. com。
不同肥料栽培对岩黄连中生物碱含量的影响研究
何志超1，陈广惠1，汪锦飘1，王冬梅2，李国成1，伍俊妍1，邱凯锋1*
(1. 中山大学孙逸仙纪念医院药学部，广东 广州 510120;2. 中山大学药学院，广东 广州 510080)
摘要 目的:考察施加不同肥料对岩黄连药材中生物碱含量的影响。方法:以岩黄连药材中总生物碱、脱氢卡
维汀和卡维汀含量为指标，应用多元 logistic回归分析肥料中不同元素对岩黄连药材质量的影响。结果:氮元素与
岩黄连中总生物碱、脱氢卡维汀、卡维汀含量和综合评分呈正相关，硅酸盐菌与上述指标呈负相关，钾、微量元素则
在不同生物碱中呈现不同的相关关系。结论:综合评价岩黄连总生物碱、脱氢卡维汀、卡维汀的含量，复合肥可作
为岩黄连栽培的理想肥料。
关键词 岩黄连;肥料;总生物碱;脱氢卡维汀;卡维汀;多元 logistic回归
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)08-1591-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 08. 007
岩黄连是罂粟科紫堇属多年生草本植物石生黄
堇 Corydalis saxicola Bunting的干燥全草〔1〕，其味苦、
性寒，具有清热、消肿、止血、止痛、利湿、拔毒等功
效，生物碱是其主要活性成分，其中脱氢卡维汀与卡
维汀是其主要活性生物碱〔2，3〕，临床常用于治疗急
慢性肝炎、肝硬化、胆囊炎、肝癌等病症〔4-8〕。岩黄连
属于石山特有种〔9〕，常分布于石山悬崖峭壁的石缝
中，产量十分有限，加之近年来人们对其大量采摘，
其野生资源濒临枯竭。本研究旨在探讨岩黄连对肥
料营养的需求，研究合适的添加肥料品种，为岩黄连
的规范化种植(GAP)科学施肥提供理论依据。
1 材料与仪器
1. 1 材料 供试肥料:复合肥为金正大化肥进出
口山东有限公司生产，含 N、P2O5、K2O 各 15%;硫
酸钾为德国生产，含 K2O 50%;生物钾肥(硅酸盐菌
剂)为河北保定区微生物工程有限公司生产，含有
效菌 2 亿 / g;快长素为山东潍坊产，含 N 10%、K2O
15%，另含微量元素 9%。
施肥方案:试验设 6 个不同肥料处理，每种设 3
个重复，共设 18 个试验小区，按随机区组排列，每个
小区的面积约为 30 m2，小区间设保护行，整个样地
四周设保护带。其具体的施肥种类、施肥量见表 1。
6 个不同施肥处理的 18 个试验小区在栽培时间、田
间管理、采收加工方法等方面均一致;10 月初幼苗
定植时一次性施腐熟农家肥作为底肥，每株约 0. 5
kg。定植后分别于当年 12 月 23 日与次年 3 月 22
日按表 1 所示施肥处理各追肥 1 次，将各类肥料均
配成 0. 8%的溶液根系施淋。次年 4 月 14 日各试
验小区选取具有代表性的岩黄连全草 3 株，阴
干〔10〕，粉碎后过 60 目筛备用。
岩黄连样品经中山大学药学院王冬梅副教授鉴
定为罂粟科紫堇属植物石生黄堇 Corydalis saxicola
Bunting的全草。
表 1 岩黄连种植的追肥施肥方案
编号 肥料种类 肥料配比(W/W) N/kg P2O5 /kg K2O /kg 微量元素 /kg 硅酸盐菌 /亿个 施肥量 /(kg /667 m2)
FL1 A + B 10∶ 2 1. 5 1. 5 1. 7 － 4 千 12
FL2 A + C 10∶ 5 1. 5 1. 5 4. 0 － － 15
FL3 A + B + C 10∶ 5∶ 2 1. 5 1. 5 4. 2 － 4 千 17
FL4 D － 1. 0 － 1. 5 0. 9 － 15
FL5 B + D 10∶ 2 1. 0 － 1. 7 0. 9 4 千 12
FL6 A － 1. 5 1. 5 1. 5 － － 10
注:A. 复合肥;B. 生物钾肥;C. 硫酸钾;D. 快长素
1. 2 仪器与试剂 Waters 高效液相色谱仪;2996
光电二极管阵列检测器;TU-1901 双光束紫外可见
光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);
电子分析天平(METTLEＲ TOLEDO，Swizerland);
Milli-Q plus system超纯水仪(Millipore，Milford，MA，
USA);乙腈(Tedia Company，Fairfield，USA);其余试
剂均为国产市售分析纯。
对照品脱氢卡维汀、卡维汀(自制)。经过 UV、
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IＲ、NMＲ、MS等光谱技术确定其结构，与参考文献
核对数据一致，经 HPLC 峰面积归一化法测定纯度
达 98%以上〔11〕。
2 方法
2. 1 总生物碱含量测定
2. 1. 1 对照品溶液的制备:精密称取脱氢卡维汀
对照品 2. 20 mg置于 50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并
稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液(44 μg /mL)。
2. 1. 2 供试品溶液的制备:精密称取各岩黄连样
品(60 目)0. 2 g，精密加入甲醇 10. 0 mL 于具塞锥
形瓶中，称定重量，超声提取 30 min(水浴温度 30
℃，250 W，40 kHz)，放冷，再称定重量，用溶剂补足
减失的重量，摇匀，滤过，适当稀释即得。
2. 1. 3 标准曲线和线性范围:精密量取对照品储
备液 0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mL 分别置于 10
mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，0. 45
μm微孔滤膜过滤，在 280 nm 处测定吸光度。以对
照品吸光度(Y)为纵坐标，对照品溶液的浓度(C，
μg /mL)为横坐标，绘制标准曲线。总生物碱:Y =
0. 047C + 0. 002，r = 0. 9999，线性范围 4. 4 ～ 44 μg /
mL。
2. 1. 4 精密度试验:精密吸取对照品溶液，在 280
nm下日内连续测定 6 次，连续测 3 天，测得吸光度
的日内 ＲSD为 0. 57%，日间 ＲSD为 0. 79%，表明仪
器精密度良好。
2. 1. 5 稳定性试验:采用同一供试品溶液，分别于
0、1、2、4、8、24 h 分析，共测定 6 次，结果 ＲSD 为
0. 58%，表明供试品溶液在 24 h内稳定性良好。
2. 1. 6 重复性试验:精密称取岩黄连样品 0. 2 g，
平行制备供试品溶液 6 份，测定其吸光度，结果 ＲSD
为 1. 39%，表明该方法重复性良好。
2. 1. 7 加样回收率试验:精密称取已知总生物碱
含量的岩黄连样品 6 份，分别加入不同含量的脱氢
卡维汀对照品，制备 3 个不同浓度的样品，每个浓度
平行 3 份，按“2. 1. 2”项下方法制备供试品溶液，在
280 nm 下测定，结果回收率为 101. 00%，ＲSD 为
1. 07%，表明方法准确度良好。
2. 2 脱氢卡维汀与卡维汀含量测定
2. 2. 1 色谱条件:色谱柱:GeminiTM C18(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm);流动相为 A．乙腈-B. 20 mmol /L 乙
酸铵水溶液(冰醋酸调节 pH 4. 66)。梯度洗脱程
序:0 ～ 10 min，15 ～ 20% A;10 ～ 20 min，20 ～ 22%
A;20 ～ 25 min，22%A;25 ～ 30 min，22 ～ 24%A;30 ～
45 min，24 ～ 29%A;45 ～ 55 min，29 ～ 80% A;55 ～ 65
min，80% A;65 ～ 75 min，80 ～ 90% A;75 ～ 85 min，
90% A。流速:1. 0 mL /min;检测波长:280 nm;柱
温:室温;进样量:20 μL。
2. 2. 2 标准曲线和线性范围:精密称定脱氢卡维
汀对照品 9. 90 mg、卡维汀对照品 21. 6 mg分别置于
5 mL 容瓶中，用甲醇定容至刻度，得到 1. 98 mg /
mL、4. 32 mg /mL 的对照品溶液。分别精密量取对
照品溶液 0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mL 分别置于
10 mL 量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，
0. 45 μm微孔滤膜过滤，取滤液进行 HPLC 测定，以
对照品浓度(C，μg /mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵
坐标，绘制标准曲线。脱氢卡维汀:Y = 53408. 825C
－ 110539，r = 0. 9996，线性范围 19. 8 ～ 198 μg /mL;
卡维汀:Y = 21179. 212C － 33371. 6，r = 0. 9997，线性
范围 43. 2 ～ 432 μg /mL。
2. 2. 3 精密度试验:精密吸取对照品溶液，连续测
定 6 次。脱氢卡维汀与卡维汀峰面积的 ＲSD 分别
为 1. 36%、1. 28%，保 留 时 间 的 ＲSD 分 别 为
0. 23%、0. 04%，表明测定方法的精密度符合分析要
求。
2. 2. 4 稳定性试验:精密吸取对照品溶液，分别于
0、1、2、4、8、24 h 进样 20 μL，测定其峰面积，脱氢卡
维汀与卡维汀的 ＲSD 分别为 0. 89%与 0. 59%，表
明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 2. 5 重复性试验:精密称取岩黄连样品 6 份，平
行配制一定浓度的 6 份供试品溶液，分别进样，测定
峰面积。脱氢卡维汀与卡维汀峰面积的 ＲSD 分别
为 1. 27% 与 1. 46%，保留时间的 ＲSD 分别为
1. 12%与 0. 06%，表明测定方法的重复性良好。
2. 2. 6 加样回收率试验:精密称取已知含量的岩
黄连样品 3 份，每份约 0. 2 g，精密称定，精密加入混
合对照品溶液，脱氢卡维汀与卡维汀回收率分别为
101. 28% 与 101. 42%，ＲSD 分 别 为 1. 92% 与
1. 58%，表明方法的准确度良好。
2. 3 统计分析 采用多指标进行统计分析，为消
除各项指标间的差异，岩黄连药材总评分采用综合
评分法进行处理。总的综合评分计算公式为:Yg =
ΣWk × Ygk，Yg 指第 g号试验的总评分;Wk 指权重
(总生物碱含量的权重为 50%，脱氢卡维汀含量的
权重为 30%，卡维汀含量的权重为 20%)，Ygk指第
g号试验 r项指标消除量纲后的评分。Ygk =(Ygk
－ Ykmin)× 100 /(Ykmax － Ykmin)，Ygk 指第 g 号试验
k项指标测量值;Ykmax指第 k 项指标中的最大值，
Ykmin指第 k项指标中的最小值。
采用 SPSS 19. 0 进行统计分析，应用单因素方
差分析 ANOWA比较不同肥料栽培的岩黄连样品中
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总生物碱、脱氢卡维汀、卡维汀、综合评分间的差异，
如果差异有统计学意义，进一步使用 LSD 法进行多
重两两比较。对氮、磷、钾、微量元素、硅酸盐菌等采
用线性回归分析，考察其对总生物碱、脱氢卡维汀、
卡维汀和综合评分的影响。本研究所有统计方法均
采用双侧检验，以 P ＜ 0. 05 表示具有显著差异，P ＜
0. 001 表示具有极显著差异。
3 结果与分析
3. 1 不同肥料栽培对岩黄连中总生物碱含量的影
响 见表 2。不同肥料栽培的岩黄连药材中总生物
碱含量差异较大，其中，FL6(复合肥)栽培的岩黄连
药材中总生物碱含量最高，FL4(快长素)栽培的岩
黄连药材中总生物碱含量最低，FL1(复合肥 +生物
钾肥)、FL2(复合肥 +硫酸钾)、FL3(复合肥 +硫酸
钾 +生物钾肥)、FL5(快长素 +生物钾肥)4 个处理
总生物碱含量相近，并且均与空白组(未施肥)的总
生物碱含量无统计学差异。比较 FL6(复合肥)和
FL1(复合肥 +生物钾肥)、FL2(复合肥 +硫酸钾)
可知，在肥料中添加钾肥，不利于岩黄连总生物碱的
累积;比较 FL6(复合肥)和 FL4(快长素)可知，复合
肥比快长素更有利于岩黄连中总生物碱的累积。
3. 2 不同肥料栽培对岩黄连中脱氢卡维汀与卡维
汀含量的影响 见表 2。不同肥料栽培的岩黄连药
材所含主要化学成分种类相同，但各成分的含量差
异较大，且主要有效成分脱氢卡维汀的含量差异最
为明显。脱氢卡维汀含量由高至低依次是:FL6(复
合肥)＞ FL3(复合肥 +硫酸钾 +生物钾肥)＞ FL4
(快长素)＞ FL2(复合肥 +硫酸钾)＞空白组(未施
肥组)＞ FL5(快长素 +生物钾肥)≥FL1(复合肥 +
生物钾肥)。卡维汀含量由高至低依次是:FL2(复
合肥 +硫酸钾)≥FL6(复合肥)＞空白组(未施肥)
＞ FL1(复合肥 +生物钾肥)= FL3(复合肥 +硫酸钾
+生物钾肥)＞ FL4(快长素)＞ FL5(快长素 +生物
钾肥)，排序与脱氢卡维汀稍不同，表明不同肥料栽
培对脱氢卡维汀与卡维汀影响不一致。
比较 FL6(复合肥)和 FL1(复合肥 +生物钾肥)
可知，添加了生物钾肥反而大大降低了脱氢卡维汀
的含量，而少量降低卡维汀的含量;比较 FL6(复合
肥)和 FL4(快长素)可知，复合肥比快长素更有利
于脱氢卡维汀、卡维汀在岩黄连中的累积。
3. 3 不同肥料栽培对岩黄连药材综合评分的影响
见表 2。结合岩黄连中总生物碱、脱氢卡维汀、卡
维汀三者的含量，对其进行归一化处理，综合评分由
高至低依次为:FL6(复合肥)＞ FL2(复合肥 +硫酸
钾)＞ FL3(复合肥 +硫酸钾 +生物钾肥)＞ FL1(复
合肥 +生物钾肥)＞ FL5(快长素 +生物钾肥)＞ FL4
(快长素)＞空白组(未施肥)，复合肥栽培所得岩黄
连药材质量相对最高。但由于总生物碱含量所设权
重为 50%，脱氢卡维汀为 30%，改变上述二者的权
重，会对综合评分结果产生一定的影响。
表 2 不同肥料栽培对岩黄连药材中生物碱含量的影响(珔x ± s，n =3)
编号 总生物碱 /% 脱氢卡维汀 /% 卡维汀 /% 综合评分
FL1 3. 787 ± 0. 156bc 0. 776 ± 0. 063a 0. 695 ± 0. 043ab 31. 13 ± 3. 80bc
FL2 3. 897 ± 0. 162c 0. 853 ± 0. 045ab 0. 759 ± 0. 037c 50. 86 ± 4. 25d
FL3 3. 648 ± 0. 147ab 0. 989 ± 0. 057c 0. 695 ± 0. 025ab 37. 92 ± 4. 70c
FL4 3. 532 ± 0. 178a 0. 899 ± 0. 084bc 0. 676 ± 0. 026ab 25. 24 ± 0. 71ab
FL5 3. 766 ± 0. 208b 0. 839 ± 0. 047ab 0. 644 ± 0. 037a 27. 96 ± 3. 57b
FL6 4. 252 ± 0. 223d 1. 083 ± 0. 087d 0. 718 ± 0. 039bc 85. 87 ± 11. 54e
空白 3. 697 ± 0. 108bc 0. 852 ± 0. 045ab 0. 701 ± 0. 061b 17. 51 ± 4. 23a
注:每列数据间不同字母代表具有统计学差异(P ＜ 0. 05)
3. 4 肥料不同元素对岩黄连药材质量的影响因素
分析 鉴于不同元素对岩黄连药材中各成分影响不
一致，本研究分别以总生物碱、脱氢卡维汀、卡维汀、
综合评分 4 者为因变量，以肥料中氮、磷、钾、微量元
素、硅酸盐菌为自变量，采用 backward 法进行多重
回归分析，所得出的 4 个 logistic 回归模型均有统计
学意义，结果见表 3。
结果表明，磷元素(P2O5)对岩黄连总生物碱、
脱氢卡维汀、卡维汀含量均无影响，均排除在 logistic
回归方程外。氮元素的添加对总生物碱、脱氢卡维
汀、卡维汀和综合评分均为正相关，进一步考察氮元
素的标准化偏回归系数，除在卡维汀回归模型中影
响稍低外，在其余 3 个回归模型中均为影响权重最
大的影响因素，表明氮元素为岩黄连栽培中需要添
加的重要元素;硅酸盐菌的添加对总生物碱、脱氢卡
维汀、卡维汀和综合评分均为负影响，表明其添加不
利于岩黄连中生物碱的富集;钾(K2O)元素的添加
对总生物碱、脱氢卡维汀、综合评分为负相关，对卡
维汀为正相关;微量元素的添加对总生物碱、卡维
汀、综合评分为负相关，对脱氢卡维汀为正相关。
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表 3 岩黄连多重回归模型参数结果
评价结局 F p Ｒ
标准化偏回归系数
N P2O5 K2O 微量元素 硅酸盐菌
总生物碱 7. 120 0. 002 0. 800 1. 104 － － 0. 634 － 0. 147 － 0. 043
脱氢卡维汀 3. 271 0. 047 0. 606 0. 666 － － 0. 040 0. 061 － 0. 321
卡维汀 6. 304 0. 003 0. 782 0. 114 － 0. 276 － 0. 471 － 0. 500
综合评分 8. 902 0. 001 0. 831 0. 951 － － 0. 359 － 0. 245 － 0. 467
4 讨论
活性成分是评价中药材质量好坏的重要指标之
一，但不同活性成分间由于存在指标间单位的差异，
导致结果难以综合评价，本文应用综合评分法对药
材总质量进行归一化评估，以评估不同肥料栽培对
岩黄连药材质量的影响。
不同肥料中氮、磷、钾含量、配比的不同，对中药
材合成活性成分含量产生一定的影响，导致药材质
量迥异。本研究结果显示，应用不同肥料栽培会对
岩黄连药材中总生物碱含量、脱氢卡维汀与卡维汀
含量产生较大的影响。相对于其他肥料，复合肥所
栽培的岩黄连总生物碱含量、脱氢卡维汀含量、综合
评分明显较高，从提高岩黄连药材中总生物碱、脱氢
卡维汀含量的角度来看，复合肥是岩黄连药材栽培
比较理想的肥料。
本文进一步考察了不同元素对岩黄连药材的影
响，结果表明，磷元素对岩黄连药材中生物碱含量无
影响;氮元素则作为岩黄连中生物碱合成的必须元
素之一，该元素的添加可以增加岩黄连总生物碱、脱
氢卡维汀、卡维汀的含量，但硅酸盐菌则不利于岩黄
连中生物碱的生成。关于各元素对岩黄连生物碱含
量的影响，尚待进一步深入研究。
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