全 文 ：　 ［收稿日期］２０１６－０１－１２
　 ［基金项目］安徽省高等学校自然科学重点项目 （ＫＪ２０１５Ａ３５８）；亳州市中药科技创新团队项目 （ＢＺ２０１３ｚｚｂ０６）。
　 ［作者简介］王庆 （１９８２－），女，硕士，讲师，主要从事天然药物活性成分分离纯化研究，８４１８１７１３＠ｑｑ．ｃｏｍ。
［引著格式］王庆，薛天乐 ．追风伞总黄酮的纤维素酶提取工艺研究 ［Ｊ］．长江大学学报 （自科版），２０１６，１３ （９）：７６～７９．
追风伞总黄酮的纤维素酶提取工艺研究
　　王庆，薛天乐　 （亳州职业技术学院药学院，安徽 亳州２３６８００）
［摘要］采用紫外分光光度法，以芸香苷为标准品建立标准曲线，分别研究了酶用量、提取时间、料液比
和提取温度对纤维素酶法提取追风伞 （Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ　ｐａｒｉｄｉｆｏｒｍｉｓ）中总黄酮提取率的影响，再设计正交试
验优选最优提取工艺。结果表明，其最优工艺条件为：酶用量４．０ｍｇ，提取时间２．５ｈ，料液比１∶３０，提
取温度５０℃。在最优提取工艺条件下，追风伞中的总黄酮提取率可达２．６８％。因此，该方法可以用于追
风伞总黄酮的提取。
［关键词］纤维素酶；追风伞 （Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ　ｐａｒｉｄｉｆｏｒｍｉｓ）；总黄酮
［中图分类号］Ｏ６５２．６ ［文献标识码］Ａ　　 ［文章编号］１６７３－１４０９ （２０１６）０９－００７６－０４
报春花科珍珠菜属植物追风伞 （Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ　ｐａｒｉｄｉｆｏｒｍｉｓ）性辛、温，具有祛风、活血的功效，
临床上主要用于风湿疼痛、半身不遂等的治疗［１，２］。追风伞黄酮类化合物含量丰富，但关于其提取工艺
的研究很少。为此，笔者利用纤维素酶法提取追风伞总黄酮，以期为追风伞的二次开发提供支持。
１　材料与方法
１．１　材料、仪器与试剂
追风伞由安徽省亳州市三义堂药业有限公司提供；芸香苷为中国药品生物制品检定所产品；纤维素
酶为湖南米纯生物科技有限责任公司产品。
旋转蒸发仪ＲＥ－２０５为上海予华仪器设备有限公司产品；水浴锅 ＨＨ－４为金坛市普林仪器制造有限
公司产品；紫外分光光度计ＵＶ２４００为北京钮因科技有限公司产品。
１．２　试验方法
１．２．１　标准曲线的绘制
精确称取芸香苷标准品５．５ｍｇ置于小烧杯中，加７０％乙醇溶解并转移至５０ｍＬ容量瓶中，以７０％
乙醇稀释至刻度线，制成浓度为０．１１ｍｇ／ｍＬ标准液［２］。取６支２５ｍＬ容量瓶，分别编号为０、１、２、
３、４、５，在上述容量瓶中依次加入芸香苷标准溶液０．０、２．０、４．０、６．０、８．０、１０．０ｍＬ，然后分别加
入１．０ｍＬ的５％ＮａＮＯ２ 溶液，混匀，放置６ｍｉｎ后，分别加入１．０ｍＬ　１０％Ａｌ（ＮＯ３）３ 溶液，混匀并放
置６ｍｉｎ，再分别向上述容量瓶中加入１０．０ｍＬ　４％ＮａＯＨ 溶液，７０％乙醇定容，混匀，１５ｍｉｎ后在
５１０ｎｍ波长处分别测定光密度 （以０号管为空白）。以芸香苷浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标
准曲线 （图１）。
１．２．２　提取步骤及样品测定
将干燥的追风伞粉碎成粗粉，准确取追风伞粗粉１．５ｇ置于１００ｍＬ烧瓶中，按照设计方案，以不同
工艺条件进行提取追风伞总黄酮。９０℃水浴１０ｍｉｎ灭活纤维素酶，同法提取３次，合并提取液，减压
浓缩，以７０％的乙醇定容至５０ｍＬ容量瓶中，得到总黄酮试液。取２．０ｍＬ总黄酮试液至２５ｍＬ容量瓶
中再测定各自的光密度，然后按照标准曲线方程计算，求得总黄酮提取率。
·６７·
长江大学学报 （自然科学版）　２０１６年３月 第１３卷 第９期 （农学）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｙａｎｇｔｚｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　Ｍａｒ．２０１６，Ｖｏｌ．１３Ｎｏ．９
DOI:10.16772/j.cnki.1673-1409.2016.09.019
图１　芸香苷标准曲线图
１．２．３　单因素试验
１）纤维素酶用量　称取追风伞粗粉６份，
每份１．５ｇ，料液比１∶４０ （ｇ／ｍＬ），分别加入
１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０ｍｇ的纤维素
酶用量，４０℃条件下提取２ｈ，再测定各自的光
密度，然后按照标准曲线方程计算并比较总黄
酮提取率。
２）提取时间　称取追风伞粗粉６份，每
份１．５ｇ，料液比１∶４０ （ｇ／ｍＬ），纤维素酶
４．０ｍｇ，在４０℃条件下分别提取０．５、１．０、
１．５、２．０、２．５、３．０ｈ，再测定各自的光密度，
然后按照标准曲线方程计算并比较总黄酮提取
率。
３）液料比　称取追风伞粗粉６份，每份１．５ｇ，纤维素酶用量４．０ｍｇ，提取温度４０℃，在液料比分
别为１ （１∶１０）、２ （１∶２０）、３ （１∶３０）、４ （１∶４０）、５ （１∶５０）、６ （１∶６０）的条件下提取２ｈ，再测
定各自的光密度，然后按照标准曲线方程计算并比较总黄酮提取率。
４）提取温度　称取追风伞粗粉６份，每份１．５ｇ，料液比１∶４０ （ｇ／ｍＬ），纤维素酶用量４．０ｍｇ，
分别在３５、４０、４５、５０、５５、６０℃的温度下提取２ｈ，再测定各自的光密度，然后按照标准曲线方程计
算并比较总黄酮提取率。
１．２．４　正交试验
在单因素试验基础上，以总黄酮提取率为考察指标，选择酶用量、提取时间、料液比、提取温度４
个相关因素进行正交试验，正交试验因素水平如表１所示。
表１　正交试验因素水平表
水平 Ａ．酶用量／ｍｇ　 Ｂ．提取时间／ｈ 　Ｃ．料液比／（ｇ／ｍＬ） Ｄ．提取温度／℃
１　 ３　 １．５　 １∶３０　 ４５
２　 ４　 ２．０　 １∶４０　 ５０
３　 ５　 ２．５　 １∶５０　 ５５
２　结果与分析
图２　纤维素酶用量对追风伞总黄酮提取率的影响
２．１　纤维素酶用量对总黄酮提取率的影响
由试验结果 （图２）可知，当纤维素酶用
量高于３．０ｍｇ时，总黄酮的提取率增速变缓；
当纤维素酶用量高于４．０ｍｇ时，提取率几乎不
变，表明此时酶解作用已经近似饱和。因此，
当纤维素酶用量为３．０～５．０ｍｇ较为适宜。
２．２　提取时间对总黄酮提取率的影响
由试验结果 （图３）可知，追风伞总黄酮
提取率随着提取时间的增加而提高，但是当提
取时间超过２ｈ时，总黄酮提取率增加不明显。
综合考虑，提取时间以１．５～２．５ｈ较为适宜。
２．３　液料比对总黄酮提取率的影响
由试验结果 （图４）可知，追风伞总黄酮
·７７·第１３卷 第９期 王庆等：追风伞总黄酮的纤维素酶提取工艺研究 　
提取率随溶剂的增加而增大，但当料液比超过１∶４０后，总黄酮提取率增加不明显，这不仅造成试验原
料浪费，也为后续的蒸发浓缩带来困难。综合考虑，料液比应为１∶４０左右为宜。
图３　提取时间对追风伞总黄酮提取率的影响 图４　料液比对追风伞总黄酮提取率的影响
图５　提取温度对追风伞总黄酮提取率的影响
２．４　提取温度对总黄酮提取率的影响
由试验结果 （图５）可知，在３５℃到６０℃
之间时，追风伞总黄酮提取率随温度升高总体
呈先升后降趋势，在５０℃时总黄酮提取率最
高，表明在５０℃时纤维素酶活性最大，而温
度高于５０℃后追风伞总黄酮提取率有明显下
降，这可能是因为高温抑制了酶的活性所致。
２．５　纤维素酶法提取总黄酮的最优工艺条件
在单因素试验基础上，以酶用量、提取时
间、料液比、提取温度４个相关因素进行正交
试验，结果如表２所示。根据正交试验结果，
可以确定最佳提取工艺是 Ａ２Ｂ３Ｃ１Ｄ２，即酶用
量为４ｍｇ，提取时为２．５ｈ，料液比１∶３０，提
取温度５０℃。４个因素对追风伞总黄酮提取率
　　 表２　正交试验结果表
试验号 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ 总黄酮提取率／％
１　 １　 １　 １　 １　 １．７１
２　 １　 ２　 ２　 ２　 ２．１３
３　 １　 ３　 ３　 ３　 １．９６
４　 ２　 １　 ２　 ３　 ２．１７
５　 ２　 ２　 ３　 １　 ２．３３
６　 ２　 ３　 １　 ２　 ２．６２
７　 ３　 １　 ２　 ３　 ２．２２
８　 ３　 ２　 ３　 １　 ２．０９
９　 ３　 ３　 １　 ２　 ２．４７
Ｋ１ １．９３　 ２．０３　 ２．２７　 ２．０４

Ｋ２ ２．３６　 ２．１８　 ２．１７　 ２．４１
Ｋ３ ２．２６　 ２．３５　 ２．１３　 ２．１２
Ｒ　 ０．４３　 ０．３２　 ０．１４　 ０．３７
·８７· 　 食品科学 ２０１６年３月
影响的大小依次是：酶用量＞提取温度＞提取时间＞料液比。在最佳工艺条件下，通过实验验证，追风
伞总黄酮提取率可达２．６８％，比文献 ［４］报道的乙醇回流法提高了５８．６％。
３　结语
使用纤维素酶法提取追风伞中的总黄酮，利用酶制剂降解植物细胞壁，可显著增加细胞内有效成分
溶出度，提取条件温和，操作简便，成本较低，且提取率显著高于乙醇回流法［５］。因此，该方法可用于
追风伞总黄酮的提取。需要指出的是，使用纤维素酶法提取追风伞中总黄酮时，采用的溶剂为水，由于
水本身极性较大，对极性较小的黄酮特别是黄酮苷元的溶解状况不佳。针对上述情况，可尝试使用乙醇
作为提取溶剂，把酶提法和回流提取法、超声提取法和微波提取法等结合使用来提取追风伞总黄酮，以
期获得更高的提取率［６～８］。
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（上接第７５页）
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ｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｓｏｕｒｃｅ　ａｒｅａｓ　ｏｆ　ｎｏｎ－ｐｏｉｎｔ　ｓｏｕｒｃｅ　ｐｏｌｕｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｙｄｒｏｌｏｇｙ，２０１５，５２４：１００～１１０．
［１１］Ｚｈｅｎｙａｏ　Ｓｈｅｎ，Ｊｉａｌｉ　Ｑｉｕ，Ｑｉａｎ　Ｈｏｎｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐａｔｉａｌ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｎｏｎ－ｐｏｉｎｔ　ｓｏｕｒｃｅ　ｐｏｌｕｔｉｏｎ　ｌｏａｄ　ｉｎ　ｔｈｅ
Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ　Ｒｅｇｉｏｎ ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１４，４９３：１３８～１４６．
［１２］Ｉｎｇｒｉｄ　Ｗｅｓｓｔｒｍ，Ａｂｒａｈａｍ　Ｊｏｅｌ，Ｉｎｇｍａｒ　Ｍｅｓｓｉｎｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌｅｄ　ｄｒａｉｎａｇｅ　ａｎｄ　ｓｕｂｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ– Ａ　ｗａｔｅｒ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｐｔｉｏｎ　ｔｏ　ｒｅｄｕｃｅ
ｎｏｎ－ｐｏｉｎｔ　ｓｏｕｒｃｅ　ｐｏｌｕｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ｌａｎｄ ［Ｊ］．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１４，１９８：７４～８２．
［１３］Ｐｉｎｇ　Ｈｕａｎｇ，Ｊｉａｂａｏ　Ｚｈａｎｇ，Ａｎｎｉｎｇ　Ｚｈｕ，ｅｔａｌ．Ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ（Ｎ）ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ａｓ　ａ　ｋｅｙ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｇａｓｅｏｕｓ　Ｎ　ｌｏｓｓｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｈｕａｎｇ－Ｈｕａｉ－Ｈａｉ　Ｐｌａｉｎ［Ｊ］，Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｏｉｌｓ，２０１５，５１：３３３～３４２．
［１４］Ａｎｄｒｅｗ　Ｎ．Ｓｈａｒｐｌｅｙ，Ｌａｒｓ　Ｂｅｒｇｓｔｒｍ，Ｈｅｌｅｎａ　Ａｒｏｎｓｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｕｔｕｒｅ　ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｉｔｈ　ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｌｏｓｓｅｓ　ｔｏ　ｗａｔｅｒｓ：
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｎｅｅｄｓ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ［Ｊ］．ＡＭＢＩＯ，２０１５，４４ （Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ１６３～Ｓ１７９．
·９７·第１３卷 第９期 王庆等：追风伞总黄酮的纤维素酶提取工艺研究