全 文 ：园　艺　学　报　2007, 34 (1):39 -42
Ac taH or ticu ltu rae S inica
收稿日期:2006 - 04 - 18;修回日期:2006 - 10 -27
资助项目:北京市重点实验室 “果树逆境生理与分子生物学实验室 ” 资助项目
*通讯作者 Au th or for correspondence (E-mai l: litianzhong1535@163. com)
柿花发育相关的MADS-box基因克隆与表达
丁　燕 , 韩振海 , 许雪峰 , 李天忠*
(中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094)
摘　要:以雌花型柿 (D iospy ros kak i) ‘阳丰 ’ 花为试材 , 克隆得到一个与其花发育相关的 MADS-box
基因 , 命名为 D kMADS1, G enBank登录号为 DQ412058。该基因 cDNA全长 1 193 bp, ORF为 747 bp, 编码
一个含有 249个氨基酸的蛋白。DkMADS1具保守的 MADS区及半保守的 K区 , 与其它植物中的 MADS-box
蛋白有很高同源性。 RT-PCR表达分析表明 , 该基因在 ‘阳丰 ’ 花的萼片 、 花瓣 、 子房和 ‘禅寺丸 ’ 的雄
蕊中均有表达。
关键词:柿;花;基因;克隆;表达
中图分类号:S 665.2　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2007) 01-0039-04
Molecular C lon ing and Expression of F lower ing-re latedMADS-box Gene in
D iospyros kaki
DING Yan, HAN Zhen-hai, XU Xue-feng, and LI Tian-zhong*
( Institu te ofHorticu ltural P lants, Ch ina Agricu lturalUn iversity, B eijing 100094, China)
Abstract:A MADS-box gene namedDkMADS1 w as c loned from Yang feng pe rsimmon flowe rs (G enBank
accession No. DQ412058). The sequence o f completeDkMADS1 cDNA gene is 1 193 bp, w ith anORF en-
coding 249 am ino acids. The deduced p ro tein contained conse rvativeMADS domain and sem i-conservative K
domain. It shared high ly homo logy to o ther MADS-box prote ins from diffe rent spec ies. RT-PCR ana ly sis
show ed tha tDkMADS 1 genew as expressed in sepal, peta l, ovary o fYang feng persimmon and stamen o fZenji-
maru persimmon.
Key words:Pe rsimmon;Diospyros kak i;Flow er;Gene;C loning;Exp ression
植物典型的花器官发育包括形成萼片 、 花瓣 、 雄蕊 、 心皮四轮花器官。而柿的花器官却是单性
花 , 大多表现为雌花型 , 雄蕊退化 , 仅有少数授粉品种具有雄花 (如 ‘禅寺丸 ’ )。这与典型花器官
发育的成花机理不尽相同 。植物花器官发育过程中的大多数基因都属于 MADS-box基因 。本研究以雌
花型柿花为试材 , 通过 RT-PCR技术及 RACE技术 , 首次在柿花中克隆出一个 MADS-box基因 , 并进
行了表达分析。为深入了解柿花发育的分子机制 、 调控柿的开花结实提供理论依据 。
1　材料与方法
材料采自中国农业科学院郑州果树研究所资源圃 。蕾期采取雌花型柿 (Diospyros kak i) ‘阳丰 ’
的花及其萼片 、 花瓣 、子房 、 叶片 , ‘禅寺丸 ’ 的雄蕊 , 液氮处理后 - 80℃冰箱保存待用 。用 CTAB
法 (罗明 等 , 2003)提取 ‘阳丰 ’ 雌花总 RNA , 以总 RNA为模板 , o lig (dT)17为引物 , superscrip t
Ⅲ反转录酶合成 cDNA第一链。根据拟南芥 SEP1 (M a et a.l , 1991)、矮牵牛 FBP2 (Angeneart e t a.l ,
1992)、 番茄 TM 29 (Dwamena et a.l , 2002)、 苹果 MdMADS1 (Yao e t a.l , 1999)、 金鱼草 DEFH49
园　　艺　　学　　报 34卷
(Dav ies e t a.l , 1996) (登录号为 AAU82007、 CAC83066、 M91666、 AAC25922、 CAA64741)中的
MADS-box蛋白的保守区 GRVELKR I和 LLGEDLG设计简并引物 PF 5′-G [ AG ] AGAGT [ TGA ]
GAGCTGAAGAG [AG ] ATA-3′和 PR 5′-CC [ TC] AA [ AG ] TC [ TC] TC [ TCA ] CCAAGAAG-3′,
进行 PCR扩增。根据传统 RACE方法 (张维铭 , 1994), 设计 RACE接头引物 3M 1:5′-AAGGGAAT-
GCTATCCACAAGGTTTTTTTTTTTT-3′。在所获得的基因片段上设计 3′RACE基因特异性引物 3F:5′-
CTCTGTTCTGTGCGATGCC-3′;5′RACE以脱氧核糖核苷酸末端转移酶 TDT在 cDNA5′末端加 T尾 , 设
计基因特异性引物 GSP:5′-GGTGCCTTTGAAAATGTTGC-3′, 分别以 3F、 3M 1和 3M 1、 GSP进行 3′
RACE和 5′RACE扩增。上述反应程序均为 95℃ 3m in;94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 60 s, 35个循环;
72℃, 10m in。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳 , 回收目的片段 , 连接在 pMD-18T载体上 , 转化 、 测
序 。拼接全长基因序列 , 在拼接后的序列上设计上游引物 WF:5′-ACCGATCAGCCAAAGAGATG-3′和
下游引物WR:5′-TCAAATGAAGAAGCCTATCCAAG-3′, 利用 RT-PCR对 ‘阳丰 ’ 的叶 、萼片 、 花瓣 、
子房及 ‘禅寺丸 ’ 的雄蕊进行组织特异性表达分析 , 柿 actin基因片段作为内参基因 。
2　结果分析与讨论
2.1　基因克隆 、 序列拼接及全序列分析
用 RT-PCR法在阳丰柿花中扩增得到一个 343 bp的中间片段 , NCB I上 b last分析表明 , 该片段与
多种植物 MADS-box基因有较高的同源性 , 有 MADS蛋白的典型序列特征 , 证明该片段为所需目的片
段 。利用 RACE法分别获得 3′端 1 096 bp和 5′端 411 bp的目的片段 , 序列拼接得到 1 193 bp全长基
因 , 命名为 DkMADS 1, GenB ank登录号为 DQ412058 (图 1)。
图 1　DkMADS1基因核苷酸序列和编码氨基酸序列
ATG为起始密码子;TGA为终止密码子;箭头表示引物位置及方向。
F ig. 1　The full cDNA nucleotide acid sequence and deduced am ino sequence o fDkMADS1 gene
ATG:S tar codon;TGA:S top codon;Arrow show ed the position and orien tation of p rimers.
40
　1期 丁　燕等:柿花发育相关的 MADS-box基因克隆与表达　
该基因包含翻译起始密码子 (ATG)和终止密码子 (TGA), ORF为 747 bp, 编码一个含有 249
个氨基酸的蛋白 (图 1), 分子量 29 kD , 等电点 7.21, 是一个中性蛋白。 DkMADS1蛋白具有完整的
植物 MADS-box蛋白的结构 , 包括保守的 MADS区 、 半保守的 K区 、 I区和 C区 (Po llock＆ Tre isnan,
1991)。用 DNAman软件进行氨基酸序列同源性比较发现 , DkMADS1蛋白序列与不同物种中 AGL2亚
族的 MADS-box蛋白具很高同源性 , 其 MADS区同源性基本可达 98%以上 , 与矮牵牛的 PMADS12和
番茄的 TM 29MADS-box基因的整个蛋白序列的同源性也可达到 72%和 70% (图 2)。
图 2　 DkMADS1与其它物种 MADS-box蛋白的同源性比较
箭头表示保守的 MADS区, 直线表示半保守的 K区。图中基因所属物种及序列号:拟南芥 SEP1, AAU82007; SEP2, AAU82024;
矮牵牛 PMADS12, AAQ72498;番茄 TM 29, CAC83066;金鱼草 DEFH 49, CAA64741;长叶瞿麦 S lSEP1, BAD10944;
苹果 M dMADS1, AAC25922;D kMADS1为本试验中克隆得到柿中 MADS-box基因 , 序列号为 DQ412058。
F ig. 2　The hom ology o f DkM ADS1 and otherMADS-box pro teins
A rrow show edMADS box, and straigh t line show sK box. The species and Genebank access ion No. of genes:Arabidopsis tha liana SEP1,
AAU82007;SEP2, AAU82024;Petun ia PMADS12, AAQ72498;Lycopersicon escu len tum TM 29, CAC83066;
An trirrih inum m aju sDEFH 49, CAA64741;S ilene la tifo lia S lSEP1, BAD10944;Ma lusMdMADS1, AAC25922;
The cloned persimm onMADS-box poteinD kMADS1 (G enebank accession No. DQ412058).
2.2　DkMADS1基因组织特异性表达分析
提取柿不同组织的总 RNA , 以柿中的 actin基因作为内参照 , 进行 RT-PCR分析 。
结果表明 , DkMADS 1基因在柿阳丰萼片 、 花瓣 、 子房及禅寺丸的雄蕊中均表达 , 而在叶片中不
表达 (图 3)。
该基因在花器官中表达 , 推测它与花发育有关 。
DkMADS1基因的表达模式和与其同源性很高的拟南芥中 MADS-box蛋白 SEP 1 /2基因以及番茄的
TM29基因是一致的 , 后二者同属于花器官发育 ABCDE (Theissen et a.l , 2000)模型中的 E组基因。
同源性很高的基因 , 可能起到相似的作用 。推测该基因可能也起到 E组基因的作用 。该类基因
的功能是:与 B、 C组基因一起形成复合转录因子 , 激活或抑制靶基因的转录和表达 (郑尚永 等 ,
2004), 从而达到调控花瓣 、 雄蕊 、雌蕊形成的作用 。其具体功能还有待进一步研究。
41
园　　艺　　学　　报 34卷
图 3　柿花 DkMADS1基因的 RT-PCR表达分析
1 ～ 4. 阳丰柿 (1. 叶片;2. 萼片;3. 花瓣; 4. 子房);5. ‘禅寺丸 ’ 雄蕊。
F ig. 3　RT-PCR ana lys is ofD kMADS1 gene in pers imm on flow ers
1 - 4. O rgans from Yangfeng persimm on(1. Leaf;2. Sepal;3. Petal;4. Ovary);5. S tam en of Zen jim aru pers imm on.
References
AngeneatG C, BusscherM , F randen J. 1992. Dif feren tial expression of tw oMADS box genes in w ild-type andm u tan t petun ia f low ers. P lant
C ell, 4 (8):983 - 993.
Davies B, E gea-Cortin esM , Eugenia de A S. 1996. M u ltip le in teractions amongst floral homoeroticMADS box p ro tein s. EMBO J, 15 (16):
4330 - 4343.
Dw am ena C A , M orris B A, Su th erland P. 2002. Dow n-regu lation of TM29, a tomato SEPALLATA hom olog, cause parth enocarp ic fru it dev-
elopment and f loral reversion. P lan t Physiology, 130:605 - 617.
Luo M ing, Xiao Yue-hua, H ou Lei, Luo Xiao-ying, Li De-m ou, PeiYan. 2003. C lon ing and exp ression ana lysis of a LIM-dom ain p rote in
gene from cotton (Gossypium h rsu tum L. ) . A cta G enetica S in ica, 30 (2):175 - 182. ( in C hinese)
罗　明 , 肖月华 , 侯　磊 , 罗小英 , 李德谋 , 裴　炎. 2003. 棉花 LIM结构域基因 (GhLIM 1) 的克隆和表达分析. 遗传学报 , 30
(2):175 - 182.
M a H , YanofskyM F, M eyerow itz EM. 1991. AGL1-AGL6, an A rabidops is gene fam ily w ith sim i larity to floral hom eotic and tran scrip tion fact-
or gen es. G enesDev. , 5:484 - 495.
Po llock R, Treism an R. 1991. H uman SRF-related p roteins:DNA-b ind ing p roperties and poten tial regu latory targets. G enesDev. , 5:2327 -
2341.
Theissen G, B ecker A, D iRosa A. 2000. A short h istory ofMADS-box genes in p lan ts. Plan tM olecu lar Biology, 42: 115 -149.
Yao J L, Dong Y H , KvarnhedenA , M orris B. 1999. SevenMADS-b ox genes in app le are expressed in differen t parts of the frui.t J. Am. Soc.
H or.t S c.i , 124:8 - 13.
Zhang W ei-m ing. 1994. Experimentalm anual ofm odern mo lecu lar b iology. Beijing:S cien ce Press: 280 -283. ( in C hinese)
张维铭. 1994. 现代分子生物学实验手册. 北京:科学出版社: 280 - 283.
Zheng Sh ang-yong, Guo Yu-long, Xiao Yu e-hu a, Luo m ing, H ou Lei, Luo Xiao-ying, PeiYan. 2004. C lon ing of aMADS Box p rotein gene
(GhMADS1) from cotton (Gossyp ium h irsu tum L. ). Acta Genetica S in ica, 31 (10): 1136 - 1141. ( in Ch inese)
郑尚永 , 郭余龙 , 肖月华 , 罗　明 , 侯　磊 , 罗小英 , 裴　炎. 2004. 棉花 MADS框蛋白基因 ( GhMADS1)的克隆. 遗传学报 ,
31 (10) :1136 -1141.
42