全 文 ：第 49 卷 第 7 期
2 0 1 3 年 7 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 7
Jul．，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20130709
收稿日期:2012 － 10 － 09;修回日期:2013 － 02 － 21。
基金项目:教育部博士学科点基金项目(20111515110001) ;内蒙古农业大学科技创新团队培育计划(NDPYTD2010-3)。
* 王瑞刚为通讯作者。
干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片 SSH文库构建及
CkWRKY1 基因克隆*
杨 杞1 张 涛1 王 颖1 李 高1，2 尹佳佳1
韩晓敏1 齐力旺3 李国婧1 王瑞刚1
(1． 内蒙古农业大学生命科学学院 呼和浩特 010018; 2． 北京市颐和园管理处 北京 100091;
3． 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091)
摘 要: 为研究柠条锦鸡儿抗旱的分子机制，挖掘干旱响应相关基因，成功构建干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片的抑
制性差减杂交(SSH)文库，获得 1 286 条高质量的 EST 序列，平均长度 475 bp，拼接得到 Unigenes 645 条。对这些
Unigenes进行 Blast比对注释后发现很多抗旱相关基因，例如 LEA 蛋白、DHN 蛋白编码基因，MYB、bZIP、WRKY、
NAC和 bHLH转录因子等。通过 RACE 技术克隆其中 1 个 WRKY 转录因子的 cDNA 全长，命名为 CkWRKY1，
GenBank 登录号为 JX987095。CkWRKY1 编码 330 个氨基酸的蛋白质，氨基酸序列中有 1 个“WRKYGQK”的 WRKY
转录因子家族保守序列，属于第Ⅱ类WRKY转录因子。利用实时荧光定量 PCR技术检测发现，CkWRKY1 基因在干
旱处理后 mRNA的表达水平明显上升，预示该转录因子可能与柠条锦鸡儿抗旱的分子机制相关。
关键词: 柠条锦鸡儿;干旱胁迫;抑制性差减杂交(SSH)文库;WRKY;基因克隆
中图分类号:S718. 46 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2013)07 － 0062 － 07
Construction of a Suppression Subtractive Hybridization Library of
Caragana korshinskii Under Drought Stress and Cloning of CkWRKY1 Gene
Yang Qi1 Zhang Tao1 Wang Ying1 Li Gao1，2 Yin Jiajia1 Han Xiaomin1
Qi Liwang3 Li Guojing1 Wang Ruigang1
(1． College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University Hohhot 010018;2． Beijing Summer Palace Management
Office Beijing 100091;3． Research Institute of Forestry，CAF Beijing 100091)
Abstract: Caragana korshinskii is an important cultivated shrub with high ecological and forage value，and widely
distributes in Northwest China． C． korshinskii has a strong tolerance to drought，cold，heat，saline and poor soil． In order
to study its resistance mechanisms to drought and explore for drought response related genes，a suppression subtractive
hybridization (SSH)library of C． korshinskii under drought stress was constructed． Totally 1 286 ESTs from the SSH
library were obtained and the average length was 475 bp． As many as 645 Unigenes were identified through the EST
sequence assembly． Many drought-related genes were annotated by Blasting，such as the genes encoding dehydration
related LEA and DHN proteins as well as transcription factors including MYB，bZIP，WRKY，NAC，and bHLH families．
A candidate gene encoding a member of WRKY transcription factor family was cloned by rapid amplification of cDNA ends
technique，and was named as CkWRKY1 (GenBank accession No． JX987095)． The protein deduced from the cDNA was
composed from 330 amino acids with a conserved region“WRKYGQK”． Real-time-quantitative PCR analysis showed that
drought stress enhanced CkWRKY1 expression at the transcriptional level，indicating that CkWRKY1 might be involved in
the drought resistance mechanisms of C． korshinskii at molecular level．
Key words: Caragana korshinskii;drought stress;suppression subtractive hybridization (SSH)library;WRKY;gene
cloning
第 7 期 杨 杞等:干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片 SSH文库构建及 CkWRKY1 基因克隆
柠条锦鸡儿 (Caragana korshinskii) ，落叶灌木，
欧亚大陆特有种，广泛分布于我国西北部地区及蒙
古、中亚地区 (牛西午，2003)。柠条锦鸡儿是我国
西北干旱荒漠地区重要的饲用灌木，同时具有巨大
的生态价值，是植树造林的优良树种 (杨洪晓等，
2010)。
柠条锦鸡儿抗旱、抗寒、耐热、耐盐碱和贫瘠，
因此对其抗逆性的研究一直是热点。过去对柠条
锦鸡儿抗逆的研究主要集中在生理机制上 (杨文
斌等，1997;王志会等，2007;李彦瑾等，2008;
徐当会等，2012) ，而近几年利用分子生物学技术
对其分子机制的研究逐渐增多。郭九峰等(2012)
构建了水分胁迫下柠条锦鸡儿叶片均一化全长
cDNA文库，王文芳(2010)构建了冷胁迫下柠条锦
鸡儿差减杂交文库。一些抗逆相关基因也逐渐被
克隆，有研究表明 CkDREB 基因明显被高盐、脱水
和低 温 诱 导，过 表 达 转 基 因 烟 草 (Nicotiana
tabacum)的抗逆性明显增强 (Wang et al．，2010)。
此外，柠条锦鸡儿 GME 基因、NCED4 基因也已经
得到克隆并证明被干旱等非生物胁迫诱导(王美
珍等，2009;王学敏等，2010)。因此寻找柠条锦
鸡儿抗逆相关基因，并对其功能进行研究，有助于
探讨柠条锦鸡儿抗逆境的分子机制，而且可能具
有广阔的应用前景。
植物在遭受生物胁迫与非生物胁迫时，体内转
录组会发生很大的变化，其中一部分转录因子被激
活，进而调控一些下游防御反应基因的表达 (李冉
等，2011)。WRKY 转录因子是在植物中发现的一
类锌指型转录因子基因家族，因在其序列中含有高
度保守的“WRKYGQK”氨基酸序列而得名 (秦伟
等，2010)。近年来的研究显示，WRKY转录因子参
与了植物抗生物胁迫和抗非生物胁迫过程。当植物
受到非生物胁迫时，如在干旱、冷冻、盐、低温及创伤
等逆境条件下，一些 WRKY 转录因子被诱导表达。
例如，对水稻 (Oryza sativa)的 103 个 WRKY 转录
因子在不同非生物胁迫 (冻害、干旱、盐害)下的表
达情况进行分析，结果发现其中的 54 个基因在不同
的非生物胁迫下会诱导表达 (李冉等，2011;
Ramamoorthy et al．，2008) ;而拟南芥(Arabidopsis
thaliana)中 过 量 表 达 大 豆 (Glycine max)
GmWRKY54 后则增强了抗旱、抗盐及抗冷能力
(Zhou et al．，2008)。
为了挖掘柠条锦鸡儿抗旱相关基因，本研究构
建了干旱胁迫下柠条锦鸡儿抑制性差减杂交
(suppression subtractive hybridization，SSH)文库，在
对其进行测序分析后得到了大量干旱胁迫相关的
EST序列;通过 RACE 技术克隆了其中 1 个 WRKY
转录因子编码基因的 cDNA 全长，并发现该基因在
干旱处理时表达量明显上调。
1 材料与方法
1. 1 植物材料与处理方法
柠条锦鸡儿种子由鄂尔多斯林业研究所提供。
种子播种于装有蛭石的培养钵中，置于 25 ℃、16 h
光照 /8 h黑暗、光照强度 7 000 ～ 8 000 lx 条件下培
养。取苗龄 1 个月小苗用于试验。
从培养钵小心取出柠条锦鸡儿苗，蒸馏水冲洗
干净，尽量避免造成损伤。吸水纸吸干净水，在原生
长环境中放置 3 h 进行干旱处理，未处理的柠条锦
鸡儿苗作为对照。分别剪取对照和处理柠条锦鸡儿
苗的叶片置于 50 mL 离心管中，液氮速冻，保存于
－ 80 ℃冰箱作为构建文库样品备用。该处理样品
同时做 RACE克隆。
同样的方法处理柠条锦鸡儿苗，分别取干旱处
理 0，1，2，4，8，12 h 样品做基因表达检测。每个
处理重复 3 次。
1. 2 总 RNA的提取和 mRNA的分离纯化
采用 TRIzol (Invitrogen)法提取柠条锦鸡儿叶
片总 RNA。总 RNA 溶于 DEPC 处理水中，用 Dnase
Ⅰ(TaKaRa)37 ℃处理 30 min，去除 DNA 的干扰。
1% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性，用微量紫
外检测仪 Beckman DU 800 对 RNA 进行浓度、纯度
测定。
mRNA纯化采用 QIAGEN 公司 mRNA 纯化试
剂盒 (Qiagen mRNA midi kit) ，具体操作步骤按照
试剂盒说明书进行。
1. 3 文库的构建与分析
依 照 PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit
(Clontech)说明书进行文库构建。以干旱处理的柠
条锦鸡儿样品作为 Tester，未处理的柠条锦鸡儿样
品作为 Driver。经过 cDNA双链合成、RsaⅠ酶切、连
接接头、差减杂交和 2 次选择性 PCR 后，将第 2 轮
PCR产物与 pMD19T Vector (TaKaRa)载体连接，转
化到感受态大肠杆菌 (Escherichia coli)TOP10 (天
根)细胞中，经蓝、白斑筛选，挑取白色单克隆，在含
有 Amp抗性的 LB 培养基中 37 ℃过夜摇菌。以菌
液为模板、试剂盒中提供的巢式引物进行 PCR扩增
验证重组子。用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产
物，挑选有清晰单一条带的阳性克隆，将对应菌液送
北京华大基因有限公司 (BGI)测序。
36
林 业 科 学 49 卷
1. 4 CkWRKY1 基因的克隆和序列分析
根据文库中获得的 WRKY转录因子的序列，用
Primer Premier5. 0 设计 RACE 引物，以柠条锦鸡儿
cDNA为模板进行 5RACE 扩增。具体操作步骤按
5-RACE试剂盒 (TaKaRa 公司)说明书进行。将
扩增到产物连入 pMD19-T 载体，转化大肠杆菌
DH5α感受态，菌落 PCR 及酶切验证后，菌液送华
大基因有限公司 (BGI)测序。将 5-RACE 获得的
序列与文库中得到的已知序列用 Vector NTI 10. 0
进行拼接，得到全长 cDNA 序列。根据 RACE 拼接
得到的序列设计特异性全长引物 F-CkWRKY1 和
R-CkWRKY1，利用高保真酶 PrimeSTAR (TaKaRa
公司)进行 PCR 扩增验证拼接序列。扩增条件:
98 ℃预变性 1 min;98 ℃变性 15 s，58 ℃退火 15 s，
72 ℃延伸 1 min 30 s，30 个循环;72 ℃补充延伸
10 min。扩增产物连入平末端载体 pEASY-Blunt
Cloning Vector (全式金公司) ，转化大肠杆菌 DH5α
感受态，菌落 PCR 及酶切验证后，菌液送华大基因
(BGI)测序。
对 CkWRKY1 基因进行序列分析。利用 NCBI
(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /blast /Blast． cgi)进
行序列比对分析，用 ORF finder 工具 (http:/ /
wncbi． nlm． nih． gov /gorf /gorf． ht ww． ml)分析开放
阅读框。利用 ExPASy 的 Compute pI /MW (http:/ /
web． expasy． org /compute_pi /)进行分子质量、等电
点等理化性质的分析，GOR IV (http:/ /npsa-pbil．
ibcp． fr /cgi-bin /npsa _ automat． plpage = npsa _ gor4．
html)进行二级结构分析。
1. 5 荧光定量 PCR
根据 RACE 拼接获得的基因的 cDNA 全长序
列，用 Primer Premier5. 0 设计荧光定量 PCR 引物
F-CkWRKY1-rt、R-CkWRKY1-rt。使用SYBR Green
I荧光染料法，在 LightCycler480(Roche Diagnostics)
实时荧光定量 PCR 仪上对柠条锦鸡儿干旱胁迫处
理下的 CkWRKY1 基因转录表达水平进行分析。根
据SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)试剂盒说明书
配制反应体系，每个反应 3 次重复。反应体系中含
有 10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，引物各 1 μL
(5 μmol·L －1) ，稀释的 cDNA 模板 5 μL，灭菌水
3 μL，总体系 20 μL。反应程序为 95 ℃预变性 30
s;95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 30 s，40
个循环。反应结束后做溶解曲线分析。柠条锦鸡儿
actin (FJ485727)作为内参基因，2 －△△Ct 法分析
数据。
本试验所用全部引物见表 1，由生工生物工程
(上海)股份有限公司合成。
表 1 试验所用全部引物
Tab． 1 All of the primers used in this study
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence(5 － 3)
CkWRKY1-5OU CTTATTGGGGTCCTACAACGGT
CkWRKY1-5IN CTGGACATGTTGGAGCAAAAGAG
F-CkWRKY1-rt TACAATACAACATACCAAATAGGGGG
R-CkWRKY1-rt CCTATAGCATGGAAGACTGAGCTGAG
F-actin-rt TGACAGGATGAGCAAGGAGA
R-actin-rt GTTGGAAGGTGCTGAGGGA
F-CkWRKY1 TGCAACATTAATACTTGCCATG
R-CkWRKY1 GAGCCACAGACAGTTCACAAGA
2 结果与分析
2. 1 柠条锦鸡儿 SSH文库的构建
对样品的总 RNA及纯化的 mRMA 质量检测结
果显示满足文库构建要求。反转录效果、酶切效果、
接头连接效率、消减效率和菌落 PCR阳性率检测的
结果表明各项指标均符合试验要求。
图 1 是文库构建中 2 轮 PCR 电泳结果。可
以看出，第 1 轮扩增后差减 cDNA、未差减 cDNA
为模板都只能看到轻微的弥散带 (1，2 泳道) ，经
过第 2 轮扩增后才可以看到明显的弥散带，大小
范围下移，而且亮度增加 (3，4 泳道)。PCR 产
物条带主要集中在 250 ～ 750 bp。说明 cDNA 的
差减效果较明显，富集了干旱诱导表达 cDNA
片段。
图 1 差减杂交后第 1 轮、第 2 轮 PCR电泳结果
Fig． 1 Analysis of the PCR products after subtraction
M:1 kb DNA marker;1，2． 未差减样品的第 1 轮及第 2 轮
PCR产物 The first and the second round of PCR products un-
subtracted respectively;3，4． 差减样品第 1 轮及第 2 轮 PCR
产物 The first and the second round of PCR products after
subtraction respectively．
第 2 轮 PCR产物克隆转化后，菌液 PCR鉴定结
果显示插入片段大多在 250 ～ 750 bp，阳性率 90%
以上，共获得 1 359 个阳性克隆。以上结果表明，以
干旱处理及未处理的柠条锦鸡儿叶片为材料，成功
构建了差减杂交文库。
46
第 7 期 杨 杞等:干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片 SSH文库构建及 CkWRKY1 基因克隆
2. 2 柠条锦鸡儿 SSH文库 EST序列分析
测序的 1 359 个阳性克隆中，除去 73 条低质量
的 EST序列 (去除载体序列后长度小于 100 bp)
后，共获得 1 286 条高质量的 ESTs 序列。这些 EST
序列未去除载体序列的测序平均读长是 851 bp，去
掉载体序列后的平均长度是 475 bp，足够的序列长
度保证了后期能够较容易地克隆相关基因。将这些
EST序列拼接后获得 Unigenes 645 条，其中 Contigs
226 条，Singlets 419 条，冗余度 48. 84%。拼接后得
到的 645 条 Unigenes平均长度是 518. 8 bp，比未拼
接时平均长度略有增加。
将这些 Unigenes 序列在 NT 库和 NR 库进行
Blast比对 (e 值设置为 1e － 5)注释后发现，仅 13
条序列未得到注释，632 条序列得到注释，得到注释
的序列中 119 条功能未知。已知功能的 EST 序列
涉及到信号转导、转录、植物抗逆性反应、光合作
用、代谢与能量、蛋白质合成与转运和氧化胁迫等
相关基因。提交获得的 EST 序列到 GenBank 获得
的部分登录号为 JZ167376，JZ167377，JZ167378，
…，JZ167772。
通过 COG 分析可以把 EST 序列归入对应的
COG家族，可以明确它们在细胞生理过程、信号存
储与加工和各类代谢中的作用。将比对结果阈值低
于 1e － 05 的 225 条 Unigenes进行功能分类，结果如
表 2 所示。利用 COG 对 Unigenes 功能分类后显示
这些序列比例前 3 位的是翻译后修饰、蛋白转运、分
子伴侣相关基因，翻译、核糖体结构相关基因和氨基
酸转运、新陈代谢相关基因，分别占到全部 EST 序
列的 18. 67%、12. 44%和 11. 56%。从表 2 可以看
到，在受到干旱胁迫后，柠条锦鸡儿表达了大量与能
量代谢与物质代谢相关的基因。蛋白质、糖类、脂类
和核苷酸类物质的转运、代谢相关的 EST 序列约占
到总数 30%以上。这些物质代谢相关的基因为细
胞提供了大量的渗透调节剂，维持细胞的渗透平衡，
比如大量的 LEA蛋白、水通道蛋白及富含脯氨酸的
各类蛋白。同时，能量代谢为这些物质的运输提供
了所需能量。另外，经 COG 分析的 225 条 Unigenes
中，信号转导相关基因共 11 条，占到总序列的
4. 89%，这类基因虽然数目较少，但是大多是各类激
酶和转录因子，对下游功能蛋白的表达起着关键的
调控作用，推测它们与柠条锦鸡儿抵抗干旱胁迫的
机制密切相关。
表 2 柠条锦鸡儿干旱胁迫叶片 SSH文库 EST序列 COG分类
Tab． 2 Classification of ESTs from SSH library of Caragana korshinskii under drought by COG
基因类别
Class of genes
序列数目
Number of sequences
百分比
Percent (%)
翻译后修饰、蛋白转化、分子伴侣 Posttranslational modification，protein turnover，chaperones 42 18. 67
翻译、核糖体结构 Translation，ribosomal structure 28 12. 44
氨基酸转运和代谢 Amino acid transport and metabolism 26 11. 56
一般功能预测 General function prediction only 24 10. 67
脂质运输和代谢 Lipid transport and metabolism 16 7. 11
能量生产与转化 Energy production and conversion 14 6. 22
碳水化合物运输与代谢 Carbohydrate transport and metabolism 14 6. 22
信号转导 Signal transduction mechanisms 11 4. 89
核苷酸运输和代谢 Nucleotide transport and metabolism 10 4. 44
离子运输与代谢 Inorganic ion transport and metabolism 9 4. 00
辅酶运输与代谢 Coenzyme transport and metabolism 7 3. 11
细胞壁、生物膜 Cell wall /membrane 5 2. 22
功能未知 Function unknown 4 1. 78
其他 Others 11 6. 67
2. 3 CkWRKY1 基因的克隆和表达分析
2. 3. 1 CkWRKY1 基因 cDNA 全长的克隆 在构建
好的柠条锦鸡儿干旱胁迫 SSH 文库获得的 645 条
Unigenes中，找到 1 个 WRKY 转录因子编码序列。
为了检测这个 WRKY基因是否确实受到干旱胁迫的
诱导，并进一步探讨它的功能，研究它在柠条锦鸡儿
抵抗干旱胁迫中的作用，通过 RACE 技术克隆了这
条 WRKY转录因子的 cDNA全长。
文库中得到 WRKY基因序列长 854 bp，经 Blast
及与其他植物 WRKY 基因序列比对后，发现该序列
已经包含了基因的终止密码子和部分 3UTR，因此
只需 5 RACE便可以得到基因的 cDNA全长。利用
5 RACE 引物 CkWRKY1-5OU、CkWRKY1-5 IN，克
隆获得了 776 bp 的 5-RACE 片段，将测序获得的
5-RACE序列及已知的中间片段序列拼接后得到
1 374 bp 的全长 cDNA 序列。以特异性引物
F-CkWRKY1和 R-CkWRKY1 对该基因进行扩增，测
序后得到的序列与 RACE 拼接结果完全一致，说明
56
林 业 科 学 49 卷
通过拼接获得的基因全长是正确的。将克隆到的柠
条锦鸡儿 WRKY 基因命名为 CkWRKY1 并提交到
GenBank，登 录 号 为 JX987095。如 图 2 所 示，
CkWRKY1 基因 cDNA全长 1 374 bp，具有 993 bp 的
开放阅读框，起始密码子 ATG，终止密码子 TAA，此
外还有 142 bp 的 5调控区，236 bp 的 3非编码区。
该基因编码含有 330 个氨基酸的蛋白质，氨基酸序
列中第 183 个氨基酸到第 189 个氨基酸是一个
WRKY 转 录 因 子 家 族 共 有 的 保 守 序 列
“WRKYGQK”，属于第Ⅱ类 WRKY 转录因子。Blast
显示 CkWRKY1 与大豆的 WRKY78 及拟南芥的
AtWRKY18 氨基酸相似度分别达到 70% 和 45%。
用 ExPASy 的 Compute pI /MW 进行预测表明，
CkWRKY1 基因编码的蛋白质分子质量为 36. 79
kDa，等电点 8. 28。利用 GOR4 对该推导蛋白进行
二级结构预测发现 α －螺旋占 25. 15%、β －折叠占
13. 33%、无规则卷曲占 61. 52%。
图 2 CkWRKY1 基因的全长 cDNA序列及推导的氨基酸序列
Fig． 2 Full-length cDNA and deduced amino acid sequences of CkWRKY1
方框中是“WRKYGQK”保守序列，下划线部分是特异引物所在位置，小写字母表示非编码区。
Sequence in the box is“WRKYGQK”conservative sequence，the underlined
part is the location of specific primers and lowercase letters indicate the non-coding region．
2. 3. 2 干旱胁迫下 CkWRKY1 基因表达检测 为了
检测 CkWRKY1 基因是否参与柠条锦鸡儿对干旱胁
迫的响应，以干旱处理和未处理的柠条锦鸡儿幼苗
作为材料，通过实时荧光定量 PCR技术对干旱胁迫
下 CkWRKY1 基因的转录水平表达进行分析。研究
结果表明，受到干旱胁迫后 CkWRKY1 的 mRNA 表
66
第 7 期 杨 杞等:干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片 SSH文库构建及 CkWRKY1 基因克隆
达水平迅速上升，1 h 就达到对照的 20 倍。处理
2 h时该基因表达水平达到最高，是对照的 40 多倍，
之后逐渐下降，但直到 12 h时仍维持高于对照的水
平，如图 3 所示。这说明 CkWRKY1 确实受到干旱胁
迫的诱导。
图 3 qRT-PCR检测干旱胁迫下
CkWRKY1 基因的表达
Fig． 3 The expression of CkWRKY1
after drought treatment by qRT-PCR
3 讨论
SSH技术自发明以来被广泛应用于植物差异表
达基因的分离，成为分离差异基因的一种常用的技
术，在很多植物中都得到了应用 (Leelatanawit et al．，
2008;Norelli et al．，2009;冯健等，2010;Hirao et
al．，2012)。本研究利用 SSH 技术成功构建了柠条
锦鸡儿叶片干旱胁迫下的差减杂交文库，在获得的
645 条 Unigenes基因中，与抗旱直接相关的基因包
括 LEA蛋白编码基因、DHN 蛋白编码基因、各类激
酶和转录因子相关基因，另外还有水通道蛋白基因、
光合作用相关基因、泛素类蛋白基因、抗氧化胁迫相
关基因等等。对文库中 EST 序列功能分类的分析
显示，柠条锦鸡儿对干旱胁迫的响应涉及到体内各
类物质的代谢、能量代谢、信号转导和物质运输等多
个方面，具有复杂的分子机制。柠条锦鸡儿生长于
干旱荒漠地区，适应了干旱、寒冷和盐碱等逆境条
件，柠条锦鸡儿干旱胁迫下叶片差减文库的构建为
研究其抗旱的分子机制，挖掘利用抗旱相关基因提
供了序列信息。
干旱胁迫引起植物细胞缺水，使细胞的水分平
衡紊乱，影响植物的正常生长甚至导致死亡。为了
应对干旱胁迫，植物表达了一系列抗旱相关基因保
护植物的基本生理功能，其中包括一系列的转录因
子。WRKY转录因子作为一类重要的转录因子，参
与植物多种非生物胁迫的途径中，如干旱 (Pnueli et
al．，2002)、低温 (Huang et al．，2002)、创伤 (Guo et
al．，2004)等。本研究构建的干旱胁迫下柠条锦鸡
儿叶片 SSH 文库中的 EST 序列中，包括了 MYB、
bZIP、WRKY、NAC和 bHLH各类转录因子。本研究
选择了其中 1 条 WRKY 基因片段，通过 RACE 技术
克隆 到 了 1 374 bp 的 cDNA 全 长，命 名 为
CkWRKY1。与大豆及拟南芥相关 WRKY 转录因子
的比对及保守序列的分析显示 CkWRKY1 属于第Ⅱ
类 WRKY转录因子。利用实时荧光定量 PCR 技术
检测在干旱胁迫下该基因的表达，发现 CkWRKY1 基
因转录表达水平在干旱胁迫后明显上升，并持续保
持高水平表达，这说明 CkWRKY1 可能参与到柠条锦
鸡儿抗旱的分子机制中。这些结果为今后进一步研
究柠条锦鸡儿 CkWRKY1 基因的功能奠定了基础。
参 考 文 献
冯 健，齐力旺，孙晓梅，等． 2010． 落叶松扦插生根过程 SSH文库构
建及部分基因的表达分析．林业科学，46(6) :27 － 34．
郭九峰，孙国琴，乔慧蕾． 2012． 水分胁迫柠条锦鸡儿叶片均一化全
长 cDNA文库的构建及 EST 分析． 华北农学报，27(3) :67 －
71．
李 冉，娄永根． 2011． 植物中逆境反应相关的 WRKY 转录因子研
究进展． 生态学报，31(11) :3223 － 3231．
李彦瑾，赵 忠，孙德祥，等． 2008．干旱胁迫下柠条锦鸡儿的水分生
理特征．西北林学院学报，23(3) :1 － 4．
牛西午． 2003． 柠条研究． 北京:科学出版社．
秦 伟，赵光耀，曲志才，等． 2010． 小麦白粉病菌诱导的 TaWRKY34
基因的鉴定与分析． 作物学报，36(2) :249 － 255．
王美珍，王学敏，王 赞，等． 2009． 柠条 GDP －甘露糖 － 3，5 －异
构酶基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建． 中国草
地学报，31(5) :75 － 83．
王文芳． 2010． 冷诱导下柠条锦鸡儿 SSH文库的构建． 呼和浩特:内
蒙古农业大学硕士学位论文．
王学敏，高洪文． 2010． 柠条锦鸡儿 NCED4 基因的克隆及对逆境胁
迫的响应． 植物分子生物学与现代农业———全国植物生物学研
讨会论文摘要集．天津:中国遗传学会．
王志会，夏新莉，尹伟伦． 2007． 不同种源的柠条锦鸡儿的生理特性
与抗旱性．东北林业大学学报，35(9) :27 － 29．
徐当会，方向文，宾振钧． 2012． 柠条适应极端干旱的生理生态机
制———叶片脱落和枝条中叶绿体保持完整性． 中国沙漠，32
(3) :691 － 697．
杨洪晓，王学全，卢 琦，等． 2010． 行带式柠条锦鸡儿林在内蒙古四
子王旗退耕还草工程中的应用．林业科学，46(11) :36 － 42．
杨文斌，任建民． 1997．柠条抗旱的生理生态与土壤水分关系的研究．
生态学报，17(3) :239 － 244．
Guo Zejian，Kan Yunchao，Chen Xujun，et al． 2004． Characterization of
a rice WRKY gene whose expression is induced upon pathogen attack
and mechanical wounding． Acta Botanica Sinica，46(8) :955 －
964．
Hirao T，Fukatsu E，Watanabe A． 2012． Characterization of resistance
to pine wood nematode infection in Pinus thunbergii using
suppression subtractive hybridization． BMC Plant Biology，12(1) :
13
76
林 业 科 学 49 卷
Huang T，Duman J G． 2002． Cloning and characterization of a thermal
hysteresis (antifreeze) protein with DNA-binding activity from
winter bittersweet nightshade，Solanum dulcamara． Plant Molecular
Biology，48(4) :339 － 350．
Leelatanawit R， Klinbunga S， Aoki T， et al． 2008． Suppression
subtractive hybridization (SSH)for isolation and characterization of
genes related to testicular development in the giant tiger shrimp
Penaeus monodon． BMB Rep，41(11) :796 － 802．
Norelli J L， Farrell Jr R E， Bassett C L， et al． 2009． Rapid
transcriptional response of apple to fire blight disease revealed by
cDNA suppression subtractive hybridization analysis． Tree Genetics
＆ Genomes，5(1) :27 － 40．
Pnueli L，Hallak-Herr E，Rozenberg M，et al． 2002． Molecular and
biochemical mechanisms associated with dormancy and drought
tolerance in the desert legume Retama raetam． The Plant Journal，
31(3) :319 － 330．
Ramamoorthy R，Jiang S Y，Kumar N，et al． 2008． A comprehensive
transcriptional profiling of the WRKY gene family in rice under
various abiotic and phytohormone treatments． Plant and Cell
Physiology，49(6) :865 － 879．
Wang X，Chen X，Liu Y，et al． 2010． CkDREB gene in Caragana
korshinskii is involved in the regulation of stress response to multiple
abiotic stresses as an AP2 /EREBP transcription factor． Molecular
Biology Reports，38(4) :2801 － 2811．
Zhou Q Y，Tian A G，Zou H F，et al． 2008． Soybean WRKY-type
transcription factor genes， GmWRKY13， GmWRKY21， and
GmWRKY54，confer differential tolerance to abiotic stresses in
transgenic Arabidopsis plants． Plant Biotechnology Journal，6(5) :
486 － 503．
( 责任编辑 徐 红)
86