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枣核多酚提取物对体外蛋白质非酶糖化的抑制作用
焦中高* ，张春岭，刘杰超，刘慧，吕真真，王思新
(中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009)
摘 要:为发掘枣核多酚提取物新活性，拓宽其应用范围，采用牛血清白蛋白 －葡萄糖非酶糖化反应体
系，对超临界 CO2萃取得到的枣核多酚提取物对体外蛋白质非酶糖化反应进程的影响进行了研究。结果表明，
枣核多酚提取物对蛋白质非酶糖化反应中间产物 Amadori和终产物 AGEs的形成均具有较强的抑制作用并呈明
显的量效关系;在实验条件下，枣核多酚提取物对蛋白质非酶糖化反应中间产物 Amadori和终产物 AGEs形成
的最大抑制率分别可达 83. 83%和 97. 69%，IC50分别为 18. 79g /L和 14. 73g /L (折合成枣核质量浓度)。相关
性分析表明，枣核提取物对蛋白质非酶糖化的抑制活性与其中的总酚含量呈极显著正相关关系，但不同萃取
条件得到的枣核提取物的抑制活性与其中的总酚含量并不能完全一一对应，获得高提取率所需工艺条件与获
得高活性提取物所需工艺条件可能不同。
关键词:枣核;多酚;非酶糖化;抑制
中图分类号:TS255 文献标识码:A 文章编号:1006 － 2513(2014)06 － 0071 － 06
Inhibitory effects of polyphenol extract from Chinese
jujube seed on non － enzymatic glycosylation of proteins in vitro
JIAO Zhong-gao，ZHANG Chun-ling，LIU Jie-chao，
LIU Hui，LV Zhen-zhen，WANG Si-xin
(Zhengzhou Fruit Ｒesearch Institute，Chinese Academy of
Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009)
Abstract:Bioactivity of polyphenols extract from jujube seeds and its applications were studied． The inhibitory effects
on protein non － enzymatic glycosylation were investigated in bovine serum albumin and glucose vitro system． Ｒesults
showed that the polyphenol extract from jujube seed could inhibit the formation of the intermediates non － enzymatic gly-
cosylation (NEG)which was known as Amadori products and glycation endproducts (AGEs)． The maximum inhibito-
ry to the formation of Amadori products and AGEs were 83. 83% and 97. 69% with IC50 value of 18. 79 g /L and 14. 73
g /L respectively． Analysis showed the inhibitory effect and total phenolic content was significantly positive correlated
with inhibition effect on non － enzymatic glycosylation of proteins． However，the optimal conditions for high yield poly-
phenols were not always in accordance with high initiatory capacities． The optimal conditions for high yield of polyphe-
nols extract and its high bioactivity may not be the same．
Key words:jujube seed;polyphenol;non － enzymatic glycosylation;inhibition
收稿日期:2014 － 05 － 11 * 通讯作者
基金项目:河南省科技攻关计划重点项目 (82102140026) ;郑州市农业科技创新工程项目 (131PZDGC113)。
作者简介:焦中高 (1972 －) ，男，博士，副研究员，研究方向为果品营养与保鲜加工研究。
72
糖尿病慢性并发症是威胁患者生命及影响生
存质量的主要因素。现代医学研究表明，糖尿病
人由于体内一直维持较高的血糖水平，使得体内
组织中非酶糖化 (Non － enzymatic glycosylation，
NEG)反应加速进行，并造成了高级糖化终末产
物 (Advanced glycation endproducts，AGEs)在体
内的大量积累［1］。AGEs 可进一步通过与体内组
织中蛋白质、脂类、核酸等大分子物质交联而影
响其理化性质和生物学功能，并通过受体系统的
转导引起细胞代谢改变和功能紊乱，最终造成动
脉粥样硬化、微血管病变、视网膜病、肾小球基
底膜通透性升高致糖尿病性肾病等糖尿病慢性并
发症的发生和发展［2 － 3］。因此，积极寻找非酶糖
化反应抑制剂、利用外源抑制剂阻止 AGEs 的生
成是防止糖尿病并发症发生和发展的重要手段之
一［4 － 5］。近年来，随着天然产物化学的快速发展
以及人们对食品、药品安全要求的不断提高，国
内外众多研究者把目光转向了天然植物中的生物
活性成分，越来越多的中草药或其他植物组织中
的多酚、多糖等提取物被证实对蛋白质非酶糖化
具有抑制作用，从而可能在糖尿病慢性并发症防
治中发挥作用［5 － 11］。
红枣，原产于我国，是我国传统的药食两用
食物之一，在中医治疗中常被用作 “药引”，有
“宁可三日无肉，不可一日无枣”、“每日吃三枣，
七十不显老”之说。现代医学与药物化学研究表
明，红枣除果肉中含有多酚、多糖、五环三萜类
化合物、环磷酸腺苷等多种生物活性物质［12］外，
在枣核中也含有大量的多酚和黄酮物质，具有较
大的开发应用价值［13 － 15］。为实现对枣核多酚的
高效利用，我们采用超临界二氧化碳萃取技术提
取枣核中的多酚物质，并通过体外实验证实枣核
多酚提取物对影响饮食中淀粉、糖类等主要碳水
化合物消化、吸收的关键酶———α － 淀粉酶和 α
－葡萄糖苷酶活性均具有一定的抑制作用，从而
可能延缓葡萄糖等单糖的释放和吸收，抑制 II 型
糖尿病人的餐后高血糖［16］。本文在此基础上采用
牛血清白蛋白 －葡萄糖非酶糖化反应体系，进一
步研究枣核多酚提取物对蛋白质非酶糖化反应进
程的影响，以期为预防和治疗 AGEs 积累引起的
糖尿病慢性并发症、拓宽枣核多酚提取物的应用
范围提供理论参考和科学依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
枣核取自成熟的干燥的河南新郑灰枣，去除
枣肉后以水洗净，自然晾干。
牛血 清 白 蛋 白 (Bovine serum albumin，
BSA) ，Sigma公司;氯化硝基四氮唑蓝 (Nitrotet-
razolium Blue chloride，NBT) ，上海恒星应用化学
研究所;其它试剂均为国产分析纯。
1. 2 仪器与设备
SFE － 2 超临界萃取仪:美国 Applied Separa-
tions公司;Specord 50 紫外 － 可见分光光度计:
德国 Analytic Jena AG公司;F － 7000 荧光分光光
度计:日本 HITACHI公司;Milli － Q Academic 超
纯水机:美国 Millipore 公司;BS214D 电子分析
天平:德国赛多利斯公司;PHS － 3C 型酸度计:
上海精密科学仪器有限公司;HG － 303 电热恒温
培养箱:南京电器三厂;DZKW 型电子恒温水浴
锅:北京市光明医疗仪器厂。
1. 3 方法
1. 3. 1 枣核多酚的超临界二氧化碳提取
参见文献［16］。
1. 3. 2 枣核多酚提取物中总酚含量的测定
枣核多酚提取物稀释至合适质量浓度后采用
FD法［17］测定，以没食子酸为标准品。
1. 3. 3 蛋白质非酶糖化反应体系的建立
根据文献［18］的方法，以牛血清白蛋白和葡
萄糖组成蛋白质非酶糖化反应体系。将牛血清白
蛋白和葡萄糖分别用 0. 1 mol·L －1 pH = 7. 4 的磷
酸盐缓冲液溶解，同时加入 0. 02%的叠氮化钠和
不同浓度的枣核多酚提取物，使体系中葡萄糖和
牛血清白蛋白的最终浓度分别为 500mmol·L －1和
40g·L －1，置于 37℃培养箱中避光孵育。同时设
对照组:A为不加枣核多酚提取物、只有牛血清
白蛋白和葡萄糖的完整的蛋白质非酶糖化反应体
系;B为牛血清白蛋白对照;C 为加有枣核多酚
提取物和葡萄糖的对照;D 为加有枣核多酚提取
物和牛血清白蛋白的对照。
每组试验重复三次，实验结果用 SPSS 软件
统计分析。
1. 3. 4 枣核多酚提取物对 Amadori 产物形成的抑
73
制效果的测定
根据文献［18］的方法，1. 3. 3 中蛋白质非酶
糖化反应体系在 37℃培养箱中避光孵育 1 周或 2
周后，取各组反应液 50μL 于具塞试管中，加入
2mL 0. 1g·L －1 NBT 溶液 (用 0. 1 mol·L －1，pH
=10. 8 的碳酸钠 －碳酸氢钠缓冲液配制) ，混匀
后置于 37℃恒温水浴中反应 15min，然后加入
0. 1mL 15%乙酸并用冷水浴终止反应，冷却后用
紫外 /可见分光光度计测定其在 530nm 处的吸收
值 A，并按以下公式计算枣核多酚提取物对 Ama-
dori 产物形成的抑制率 (IＲ1) :
IＲ1 = 1 －
A枣核多酚 － A对照C － A对照D
A对照A － A对照
[ ]
B
× 100%
1. 3. 5 枣核多酚提取物对高级糖化终末产物
(AGEs)生成的抑制效果的测定
根据文献 ［18］的方法，通过测定反应体系
中 AGEs的特征性荧光吸收来测定枣核多酚提取
物对高 AGEs生成的抑制效果。1. 3. 3 中蛋白质非
酶糖化反应体系在 37℃培养箱中避光孵育 30d 或
60d 后，用荧光分光光度计在激发波长 370nm、
发射波长 440nm、狭缝 1nm 条件下测定各组反应
液的荧光值 F，并按以下公式计算枣核多酚提取
物对高级糖化终末产物 (AGEs)生成的抑制率
(IＲ2) :
IＲ2 = 1 －
F枣核多酚 － F对照C － F对照D
F对照A － F对照
[ ]
B
× 100%
2 结果与分析
2. 1 枣核多酚提取物的制备条件与总酚含量
根据前文方法，通过正交试验设计获得 9 个
不同提取条件下的枣核多酚提取物样品，各样品
的制备条件与总酚含量如表 1 所示。
2. 2 高级糖化终末产物 (AGEs)的鉴别
在由牛血清白蛋白 (BSA)和葡萄糖 (Glu)
组成的非酶糖化反应体系中，二者经过复杂的化
学反应，最终可形成不被酶降解的交联体———高
级糖化终末产物 (AGEs)。由牛血清白蛋白和葡
萄糖形成的高级糖化终末产物 (AGEs)为褐色
物质，可由特征性的荧光吸收 (Ex 370nm /Em
440nm)和紫外吸收光谱来鉴定。
表 1 枣核多酚提取物的制备条件与总酚含量
Table. 1 Preparation conditions and total
phenolic content of jujbe seed extract
样品编号 制备条件 总酚含量 /(mg /L)
1 30MPa、40℃、2h，提取 1 次 13. 25
2 35MPa、50℃、2h，提取 2 次 59. 12
3 40MPa、60℃、2h，提取 3 次 44. 56
4 30MPa、50℃、2. 5h，提取 3 次 52. 11
5 35MPa、60℃、2. 5h，提取 1 次 33. 92
6 40MPa、40℃、2. 5h，提取 2 次 61. 56
7 30MPa、60℃、3h，提取 2 次 52. 97
8 35MPa、40℃、3h，提取 3 次 38. 64
9 40MPa、50℃、3h，提取 1 次 25. 28
图 1 为牛血清白蛋白 (BSA)单一体系和牛
血清白蛋白 (BSA)与葡萄糖 (Glu)混合体系
在 37℃条件下温育 30d后反应体系的紫外吸收图
谱。由图 1 可见，BSA 的最大吸收在 280nm，但
在 UVA 区域基本没有吸收，而与葡萄糖在 37℃
温育 30d后除了在 280nm 具有最大吸收外，其在
UVA区域也有广泛的吸收，说明反应体系中有褐
色的高级糖化终末产物 (AGEs)形成。同时由
图 2 也可以看出，反应体系中 AGEs 的特征性荧
光吸收 (Ex 370nm /Em 440nm)值在温育前期增
加缓慢，后期大幅增加，说明在 BSA － Glu 非酶
糖化反应体系中，AGEs 的形成较为缓慢，需要
温育较长时间才可大量形成。
图 1 BSA和 AGEs的紫外吸收光谱
Fig. 1 UV spectra of BSA and AGEs
74
图 2 温育时间对 AGEs特征荧光吸收
(Ex 370nm/Em 440nm)的影响
Fig. 2 Influence of incubation time on characteristic
fluorescence absorbance of AGEs
2. 3 枣核多酚提取物对 Amadori产物形成的影响
在牛血清白蛋白 －葡萄糖非酶糖化反应体系
中，蛋白质糖基化反应主要包括两个阶段。在反
应初期，首先是开链型葡萄糖分子的游离醛基与
蛋白质分子中氨基酸上的一个氨基发生亲核缩合
反应，迅速形成醛亚胺 (又称 Shiff 碱)。Shiff 碱
不稳定，可缓慢发生分子重排，从而形成较稳定
但可逆的酮胺化合物，即 Amadori 产物，也称早
期糖化产物。反应后期，Amadori 产物进一步降
解为化学性质活泼的 α －酮醛化合物，高度活性
的 α －酮醛化合物进一步与蛋白质分子中其它游
离氨基反应交联形成共价的非酶糖化终产物———
AGEs，AGEs一经形成便不可逆转。因此，Ama-
dori产物的形成是蛋白质非酶糖化反应进程的重
要中间环节，抑制 Amadori 产物的形成即可阻断
早期的蛋白质糖基化反应，从而抑制高级糖化终
末产物 (AGEs)的形成。不同提取条件萃取得
到枣核多酚提取物对反应体系中 Amadori 产物形
成的抑制效果如图 3 所示。由图 3 可见，不同提
取条件萃取得到的枣核多酚提取物对反应体系中
Amadori产物形成均具有一定的抑制作用，说明
超临界 CO2萃取得到的枣核多酚提取物阻断早期
的蛋白质糖基化反应，从而抑制高级糖化终末产
物 (AGEs)的形成。相关性分析表明，不同提
取条件萃取得到的枣核提取物对 Amadori 产物形
成的抑制效果与其中的总酚含量呈极显著正相关
关系 (温育 1 周和 2 周相关系数分别为 0. 9284 和
0. 9129) ，说明枣核提取物中的多酚成分可能在
其对 Amadori 产物形成的抑制活性中发挥重要
作用。
图 3 不同枣核多酚提取物对
Amadori产物形成的抑制效果
Fig. 3 Inhibitory effects of different polyphenol extract
from jujube on the formation of Amadori products
对比表 1 和图 3 还可以看出不同工艺条件得
到的枣核多酚提取物对 Amadori 产物形成的抑制
效果与其中的总酚含量并不能完全一一对应，各
样品对 Amadori产物形成的抑制率由高到低依次
为 6 ＞ 2 ＞ 4 ＞ 3 ＞ 7 ＞ 8 ＞ 5 ＞ 9 ＞ 1，而总酚含量由
高到低依次为 6 ＞ 2 ＞ 7 ＞ 4 ＞ 3 ＞ 5 ＞ 8 ＞ 9 ＞ 1，说
明萃取条件除影响多酚提取率外，也可对其 Ama-
dori产物抑制活性产生重要影响，获得高提取率
所需工艺条件与获得高 Amadori 产物抑制活性枣
核多酚提取物所需工艺条件可能不同。
为了进一步考察枣核多酚提取物对 Amadori
产物形成的抑制效果，以样品 6 所为材料，考察
不同质量浓度枣核多酚提取物对反应体系中 Ama-
dori产物形成的抑制效果，结果见图 4。
由图 4 可以看出，随着枣核多酚质量浓度的
提高，枣核多酚提取物对反应体系中 Amadori 产
物形成也得到显著提高，呈明显的量效关系。在
实验浓度范围 (折合成枣核浓度为 2. 65 ～
31. 80g /L)内，枣核多酚提取物对牛血清白蛋白
－葡萄糖非酶糖化体系温育 1 周和 2 周时 Amadori
产物形成的最高抑制率分别可达到 83. 85% 和
81. 38%，IC50分别为 18. 79 g /L (折合成枣核浓
度)和 21. 72 g /L (折合成枣核浓度)。
2. 4 枣核多酚提取物对高级糖化终末产物
(AGEs)形成的影响
图 5 为不同提取条件萃取得到枣核多酚提取
75
图 4 枣核多酚提取物对 Amadori
产物形成的抑制效果的量效关系
Fig. 4 Dose dependence of inhibitory effects of
polyphenol extract from jujube seed on the
formation of Amadori products
物对反应体系中 AGEs 形成的抑制效果，不同浓
度枣核多酚提取物对 AGEs形成的抑制效果如图 6
所示。
图 5 不同枣核多酚提取物对 AGEs形成的抑制效果
Fig. 5 Inhibitory effects of different polyphenol
extract from jujube on the formation of AGEs
由图 5、图 6 可见，不同提取条件萃取得到
的枣核多酚提取物对反应体系中 AGEs 产物形成
均具有一定的抑制作用，而且抑制率随枣核多酚
提取物浓度的增加而增大，呈明显的量效关系。
低浓度 (折合成枣核浓度为 10. 6 g /L以下)条件
下，枣核多酚提取物对 AGEs 形成的抑制作用较
弱，当枣核多酚提取物浓度增大到 10. 6g /L (折
合成枣核浓度)以上时，其对 AGEs 形成的抑制
图 6 枣核多酚提取物对 AGEs
形成的抑制效果的量效关系
Fig. 6 Dose dependence of inhibitory effects of polyphenol
extract from jujube seed on the formation of AGEs
作用急剧增强，31. 80 g /L (折合成枣核浓度)的
枣核多酚提取物几乎可以完全抑制体系中 AGEs
的形成。在实验浓度范围 (折合成枣核浓度为
2. 65 ～ 31. 80 g /L)内，枣核多酚提取物对 BSA －
Glu非酶糖化系统温育 30d和 60d时 AGEs 形成的
最高抑制率分别可达到 97. 69%和 92. 72%，IC50
分别为 14. 73 g /L (折合成枣核浓度)和 16. 98
g /L (折合成枣核浓度)。相关性分析表明，不同
提取条件萃取得到的枣核多酚提取物对反应体系
中 AGEs形成的抑制效果与其中的总酚含量呈极
显著正相关关系 (温育 30d 和 60d 相关系数分别
为 0. 9198 和 0. 9231)。各样品对 AGEs 形成的抑
制率由高到低依次为 6 ＞ 2 ＞ 4 ＞ 7 ＞ 3 ＞ 8 ＞ 5 ＞ 9 ＞
1，不仅与总酚含量不能完全对应，而且与其对
Amadori产物形成的抑制效果排序也存在微小差
异，说明枣核多酚提取物对非酶糖化反应的抑制
机理比较复杂，不同枣核多酚提取物中活性成分
的微小差异可导致其对非酶糖化反应过程不同阶
段的抑制效果存在较大变化。
3 讨论与结论
蛋白质、DNA与还原糖之间的非酶糖化反应
在生物体内广泛存在，其中尤以蛋白质的非酶糖
化最受关注。大量研究表明，蛋白质的非酶糖化
反应进程与糖浓度密切相关，因此糖尿病人由于
长期处于高血糖状态，体内组织的非酶糖化反应
76
尤为严重，造成高级糖化终末产物的大量积累，
从而造成多种慢性并发症的发生和发展，给患者
带来极大的痛苦和威胁。本文采用牛血清白蛋白
－葡萄糖非酶糖化反应体系通过体外试验证实枣
核多酚提取物对蛋白质非酶糖化反应早期糖化产
物 (Amadori 产 物)和 高 级 糖 化 终 末 产 物
(AGEs)的形成均具有较强的抑制作用，说明枣
核多酚提取物可能对由蛋白质非酶糖化反应引起
的糖尿病慢性并发症具有一定的防治和改善作
用。此外，枣核多酚提取物可有效抑制 α －淀粉
酶和 α －葡萄糖苷酶等影响碳水化合物消化和吸
收的关键酶的活性［16］，因此可延缓人体对葡萄糖
等单糖的释放和吸收，抑制 II 型糖尿病人的餐后
血糖的快速升高。枣核多酚提取物同时还是一种
优良的自由基清除剂［16］，因此还可清除体内活性
氧自由基、调节体内自由基代谢平衡，从而减少
糖尿病人因体内自由基代谢失衡而造成的各种慢
性并发症的发生［19 － 21］。因此，枣核多酚提取物
可作为一种多功能的糖尿病治疗和保健药物，通
过多种作用途径和位点对糖尿病及其并发症进行
积极有效的预防和治疗，从而对糖尿病人起到很
好的保健作用。
非酶糖化反应除可造成糖尿病慢性并发症的发
生和发展外，还可加快细胞老化进程，造成人体衰
老和动脉硬化等老年性疾病的发生。因此，枣核多
酚提取物不仅可以通过清除体内活性氧自由基来延
缓人体衰老，而且还可通过抑制非酶糖化反应来阻
止细胞老化，预防老年性疾病的发生。
本文通过体外试验初步证实枣核多酚提取物
对蛋白质非酶糖化反应具有较强的抑制作用，而
要最终实现枣核多酚提取物在糖尿病慢性并发症
和人体衰老防治中的应用，还需要深入研究其作
用机理并进行体内试验来验证。
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