全 文 ：书2014 年 7 月
第 37 卷 第 4 期
四川师范大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan Normal University(Natural Science)
July，2014
Vol． 37，No． 4
收稿日期:2013 － 04 － 08
基金项目:四川省教育厅自然科学基金(13ZA0004)资助项目
* 通信作者简介:兰子平(1964—) ，男，副教授，主要从事天然产物分离分析研究，E － mail:pzlan@ aliyun． com
超声波协同酶法提取荔枝壳中总黄酮及抗氧化性
阮尚全1，2， 宋秋菊1， 何慧蓉1， 张 裕1， 罗大英1， 兰子平1，2*
(1． 内江师范学院 化学化工学院，四川 内江 641112;
2． 内江师范学院 四川省高等学校果类废弃物资源化重点实验室，四川 内江 641112)
摘要:以荔枝壳为原料，试验了超声波协同酶法提取荔枝壳中的总黄酮．考察了单因素乙醇体积分数、
料液比、超声波功率、pH值、酶用量、提取温度和提取时间对黄酮提取率的影响．采用正交试验确立了最优
提取条件，即乙醇体积分数为 50%、料液比为 1∶ 70、提取时间为 100 min、酶用量为 0． 12%，总黄酮的提取
率达5． 10% ．提取物具有较强的清除·OH自由基及 O －2·自由基的能力．
关键词:荔枝壳;超声波;纤维素酶;黄酮;抗氧化性
中图分类号:O629． 9;O652． 62 文献标志码:A 文章编号:1001 － 8395(2014)04 － 0574 － 05
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 －8395． 2014． 04． 025
荔枝(Litchi chinensis Sonn．)为无患子科荔枝
属常绿乔木，是热带和亚热带的特色水果，主要分
布于我国广东、广西、福建、台湾以及四川的合江县
等地区． 合江荔枝产量占四川全省的 90% 以上，
2012 年产量已达 1 100 多万 kg．荔枝壳为荔枝的外
果皮，含有如花青素、红色素、黄酮类、酚酸和多糖
类等多种活性成分，具有很高的药用价值［1］． 黄酮
是广泛存在于植物细胞内的细胞次生代谢、具有酚
羟基的化合物，由于其自身被氧化而具有抗氧化作
用，在体内和体外都具有较强的抗氧化性，对人的
毒副作用小，因而受到了国内外学者的高度重
视［2 － 3］．纤维素酶能催化破坏细胞壁，改变细胞壁
的通透作用，利于细胞内含物渗出，同时其具有专
一性，不破坏其他物质，保持其他物质的原生结构，
因此与传统提取方法相比，具有无毒、反应条件温
和及催化活力可调控制等优势，在植物成分的提取
中得到了广泛应用［4］;超声波在介质中传播时产生
的空化作用、机械效应、热效应、化学效应，可提高
目标物从固相转移到液相的传质速率，提高提取产
率，同时不影响大多数有效成分的生理活性［5 － 6］．
本文将纤维素酶和超声波的优点相结合，以四川合
江县产的荔枝壳为原料，建立荔枝壳中黄酮提取的
新方法，并对提取物清除羟基自由基和超氧阴离子
自由基的能力进行了初步实验，对提高荔枝壳的综
合利用价值具有重要意义．
1 材料与方法
1． 1 主要仪器与试剂
1． 1． 1 主要仪器 T6 新世纪紫外可见分光光度计
(北京普析)、KQ － 400KDB 超声波清洗器(江苏昆
山)、TD － 5 台式低速离心机(四川蜀科)、DFT －
100 型中药粉碎机(温岭)、电热鼓风干燥箱(重庆
银河)、AE240 电子分析天平(梅特勒 － 托利多)、
HH － S2恒温水浴锅．
1． 1． 2 试剂 纤维素酶(11 kU /G) ，芦丁(BＲ) ，三
羟甲基氨基甲烷(BＲ) ，亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙
醇、氢氧化钠等均为分析纯．
1． 2 实验方法
1． 2． 1 提取工艺流程 荔枝壳清洗→烘干粉碎→
溶剂浸泡酶解→超声提取→分离显色→测定．
1． 2． 2 黄酮的提取与测定 试验用荔枝壳采自于
四川合江县，材料洗净低温烘干、粉碎．准确称取一
定量荔枝壳粉于提取瓶中，按照一定固液比加入乙
醇和纤维素酶酶解，在一定的温度下超声提取，离
心分离上层清液定容，按照文献［7］方法测定吸光
度值，根据标准曲线回归方程得到提取液浓度，计
算总黄酮提取率．
1． 2． 3 芦丁标准曲线的绘制 准确称取 0． 020 0 g
芦丁标准品溶解于体积分数 30%的乙醇中，定容于
100 mL容量瓶中，得到 0． 20 mg /mL 标准液． 准确
移取标准液 0． 00、1． 00、2． 00、3． 00、4． 00、5． 00、
6． 00、7． 00 mL于 25 mL比色管，按文献［7］方法加
入质量分数 5%的 NaNO2 溶液 1． 0 mL，6 min 后加
入质量分数 10% 的硝酸铝溶液 1． 0 mL，放置 6
min，加质量分数 4%NaOH溶液 10． 0 mL，用蒸馏水
定容，在 511 nm处测定吸光度，绘制标准曲线．
1． 2． 4 单因素实验 准确称取荔枝壳粉 1． 000 g
于 100 mL提取瓶中，做以下因素试验:固定料液比
为 1 ∶ 30、pH5、0． 06% 的纤维素酶、50℃酶解 80
min、280 W超声波提取 20 min条件，乙醇体积分数
分别为 10% ～ 80%;固定乙醇体积分数为 40%、
0． 06%的纤维素酶、pH5、50 ℃酶解 80 min、280 W
超声波提取 20 min 条件，料液比分别为 1 ∶ 20 ～
1∶ 80;固定乙醇体积分数为 40%、料液比 1 ∶ 30、
pH5、50 ℃浸泡 80 min、280 W 超声波提取 20 min
条件，纤维素酶用量分别为 0． 00% ～ 0． 30%;固定
乙醇体积分数为 40%、料液比 1 ∶ 30、0． 06%的纤
维素酶、pH5、酶解 80 min、280 W 超声波提取 20
min条件，酶解温度为 30 ～ 70 ℃;固定乙醇体积分
数为 40%、料液比 1 ∶ 30、0． 06%的酶用量、pH5、
280 W超声波提取 20 min 条件，50 ℃酶解 20 ～ 80
min;固定乙醇体积分数为 40%、料液比 1 ∶ 30、
0． 06%的纤维素酶、50 ℃酶解 80 min、280 W 超声
波提取 20 min 条件，pH 值分别为 3 ～ 7;固定乙醇
体积分数为 40%、料液比 1 ∶ 30、0． 06%的纤维素
酶、pH5、50 ℃恒温酶解 80 min、超声波提取 20 min
条件，超声波功率分别为 160 ～ 400 W．
1． 2． 5 抗氧化性实验 对·OH清除能力采用水杨
酸法，参照文献［8］方法，在反应体系中加入荔枝壳
提取物，利用 H2O2 与 Fe
2 +混合产生·OH，在反应
体系中加入水杨酸有效地捕捉·OH 产生有色产
物，产物在 510 nm波长处测定其吸光度． O －2·清除
的实验采用邻苯三酚自氧化法，参照文献［9］利用
邻苯三酚在弱碱性条件下自身氧化产生 O －2 ． 和有
色中间产物，在反应体系中加入荔枝壳提取物，
O －2·的生成受到抑制，邻苯三酚自氧化受阻，在 420
nm波长处测定其吸光度．
2 结果与讨论
2． 1 标准曲线实验结果 实验测得标准曲线回归
方程为:吸光度 A = 0． 0114 c － 0． 0019，c /(μg /mL)
为芦丁质量浓度，复相关系数 Ｒ2 = 0． 9993，芦丁质
量浓度在 8． 0 ～ 56． 0 μg /mL范围内线性关系良好，
如图 1 所示．
2． 2 单因素试验结果
2． 2． 1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响 总黄
酮提取率随着乙醇体积分数的升高而增加，乙醇体
积分数为 50%时达到最高，随后逐渐降低．这是由
于黄酮溶解于乙醇，乙醇体积分数增大利于黄酮的
溶出，致提取率增大． 但过高的乙醇体积分数使体
系介质发生的改变可能降低了超声波功能作用，致
使黄酮的提取率降低，如图 2 所示．
2． 2． 2 料液比对黄酮提取率的影响 总黄酮提取
率随着乙醇体积分数的升高而增加，料液比为
1∶ 60时达到最高，随后变化不大，如图 3 所示．
2． 2． 3 酶用量对黄酮提取率的影响 总黄酮提取
率随着酶用量的升高而增加，在酶用量为 0． 12%时
达到最高，随后逐渐降低． 原因是纤维素酶破坏原
料的细胞壁，让黄酮更易扩散到溶剂中，以提高提
575第 4 期 阮尚全，等:超声波协同酶法提取荔枝壳中总黄酮及抗氧化性
6050
0.1
0.2
0.3
0.7
0
0.5
0.6
0.4
10 20 4030
吸
光
度
A
芦丁质量浓度/(μg/mL)
图 1 芦丁标准曲线
Fig. 1 The standard curve of rutin




3.0
3.5
4.5
4.0
5.0
5.5
30 40 706020 8050 9010
总
黄
酮
提
取
率
/%
乙醇体积分数/%
图 2 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响
Fig. 2 The influence of the different concentration of
ethanol on the yield of the total flavonoids
取率;过高的酶量会使总黄酮的提取率减小，这是
由于底物配比对酶解作用有较大的影响，同时纤维素
酶的加入也会加大大分子物质(如:果胶等)的溶出，
对黄酮产生吸附，致总黄酮得率降低，如图 4所示．
2． 2． 4 酶解温度对黄酮提取率的影响 总黄酮提
取率随温度的升高而增加，温度为 60 ℃时最高，随
后逐渐降低． 这是由于温度越高，对原料作用越充
分，提取率提高;而酶有一个最适作用温度，当温度
过高时，酶的活性会降低，黄酮也会分解，故提取率
降低，如图 5 所示．
2． 2． 5 酶解时间对酮提取率的影响 总黄酮提取
率随着酶解时间的增加而增加，酶解时间为 80 min
时提取率最高，然后逐渐降低． 原因是提取时间增
长，有利于黄酮的溶出，提取率增大;但过长的时间
也会导致黄酮氧化分解，且乙醇也会挥发，导致黄
酮提取率会降低，如图 6 所示．
2． 2． 6 酶解 pH 值对黄酮提取率的影响 总黄酮
提取率随着 pH升高而增加，pH =5 时最大，随后逐
渐降低．是由于纤维素酶的活性受 pH影响，在黄酮
提取过程中 pH 值为 5 时是纤维素酶的最适酸度，
pH值过低和过高时，酶的活性会逐渐降低，故黄酮
提取率会也会随之受到影响，如图 7 所示．
2． 2． 7 超声波功率对黄酮提取率的影响 总黄酮
675 四川师范大学学报(自然科学版) 第 37 卷
4.4
4.5
4.6




3.8
3.9
4.0
4.2
4.3
4.1
图 3 料液比对黄酮提取率的影响
Fig. 3 The influence of the liquid-solid ratio
on the yield of the total flavonoids
1:20 1:30 1:40 1:60 1:801:701:50
总
黄
酮
提
取
率
/%
料液比


5.0
4.9
4.7
5.1
4.6
4.5
4.8
4.4
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
总
黄
酮
提
取
率
/%
酶用量/%
图 4 酶用量对黄酮提取率的影响
Fig 4. The influence of the dosage of enzyme on
the yield of the total flavonoids




4.25
4.20
4.15
4.10
4.05
4.00
3.95
30 40 50 60 70
总
黄
酮
提
取
率
/%
温度/℃
图 5 酶解温度对黄酮提取率的影响
Fig. 5 The influence of the hydrolysis temperature on
the yield of the total flavonoids
20 40 60 80 100 120
3.6
3.8
4.0
4.4




4.2
4.6
酶解时间/min
总
黄
酮
提
取
率
/%
图 6 酶解时间对黄酮提取率的影响
Fig. 6 The influence of hydrolysis time on the yield of
the total flavonoids




3.75
3.80
3.85
3.90
3.95
4.00
4.05
4.10
4.15
4.20
3 4 5 6 7
总
黄
酮
提
取
率
/%
pH 值
图 7 酶解 pH值对黄酮提取率的影响
Fig. 7 The influence of the pH of the hydrolysis on
the yield of the total flavonoids
提取率随着超声波功率的升高而增加，超声波功率
为 240 W处达到最高，随后逐渐降低． 超声波功率
的增大，有利于黄酮的溶出，但能量过高，也会导致
黄酮分解，如图 8 所示．
2． 3 正交试验及结果 在单因素实验结果的基础
上，其他因素为最佳的条件下，主要考查乙醇体积
分数、料液比、酶用量、酶解时间对提取率影响进行
正交试验设计． 取 3 个水平按 L9(3
4)进行正交实
验，以黄酮提取率为评价标准，确定最佳工艺．实验
结果见表 1，方差分析见表 2．
表 1 L9(3
4)正交实验设计及结果
Table 1 L9(34)orthogonal experimental design and results
序号
A乙醇体
积分数 /%
B料液比
C酶解
时间 /min
D酶用
量 /%
总黄酮提
取率 /%
1 1(40) 1(1∶ 50) 1(60) 1(0． 06) 3． 80
2 1 2(1∶ 60) 2(80) ) 2(0． 12) 4． 01
3 1 3(1∶ 70) 3(100) ) 3(0． 18) 4． 12
4 2(50) 1 2 3 4． 42
5 2 2 3 1 4． 40
6 2 3 1 2 4． 29
7 3(60) 1 3 2 4． 24
8 3 2 1 3 3． 99
9 3 3 2 1 4． 24
K1 3． 977 4． 153 4． 027 4． 147
K2 4． 370 4． 133 4． 223 4． 180
K3 4． 157 4． 217 4． 253 4． 177
Ｒ 0． 393 0． 084 0． 226 0． 033
注:K1、K2、K3 为各因素水平黄酮提取率平均值，Ｒ为极差．
由表 1 和表 2 可知:乙醇体积分数、料液比、酶
解时间、酶用量等因素均对荔枝壳中总黄酮的提取
有影响;由极差 Ｒ 可知，各因素对黄酮提取率的影
响主次顺序为:A ＞ C ＞ B ＞ D;从荔枝壳中提取黄酮
的工艺条件最优组合为 A2B3C3D2，即乙醇体积分
数 50%，料液比 1 ∶ 70，提取时间为 100 min，酶用
量为0． 12%为最佳提取条件． 方差分析知:乙醇体
积分数及酶解时间对黄酮提取率有影响具有显著
性，料液比及酶用量对黄酮提取率有影响但不具显
著性．为进一步验证正交试验的结果及重现性，在
最优条件下进行 4 次平行实验，荔枝壳的黄酮提取
率分别为:5． 145%、5． 177%、5． 016%、5． 048%，平
均提取率为 5． 10% ．
表 2 正交试验的方差分析
Table 2 The variance analysis of the orthogonal experiment
因素 偏差方和 自由度 F 显著性
乙醇体积分数 /% 0． 233 2 116． 500 α = 0． 05
料液比 0． 011 2 5． 500
酶解时间 /min 0． 091 2 45． 500 α = 0． 05
酶用量 /% 0． 002 2 1． 000
误差 0． 000 2
775第 4 期 阮尚全，等:超声波协同酶法提取荔枝壳中总黄酮及抗氧化性


3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
150 200 250 300 350 400
总
黄
酮
提
取
率
/%
超声波功率/W
图 8 超声波功率对黄酮得率的影响
Fig. 8 The influence of the ultrasonic power on the
extraction ratio yield of the total flavonoids




黄酮质量浓度/(μg/mL)
20
30
40
50
60
70
0 5 10 15 20 25 30
·
OH
清
除
率
/%
图 9 提取物质量浓度与清除·OH活性的关系
Fig. 9 the relationship between the concentration of the
extract and its clearance on the activity of the·OH




10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
20 40 60 80 100 120
O 2
- ·
清
除
率
/%
黄酮质量浓度/(μg/mL)
图 10 提取物质量浓度与清除 O2-·活性的关系
Fig. 10 the relationship between the concentration of the
extract and its clearance on the activity of the O2-·
2． 4 抗氧化性试验结果
2． 4． 1 清除·OH活性 实验结果为:提取物在2． 9
～ 29 μg /mL范围内，对·OH 清除率为 19． 89% ～
66． 67%，如图 9 所示．
2． 4． 2 清除 O －2·活性 实验结果为:提取物在 29
～ 116 μg /mL范围内，对 O －2·清除率为 13． 41% ～
50． 227%，如图 10 所示．
3 结论
本文采用单因素联合正交试验设计，建立以超
声波协同酶法提取了荔枝壳中的总黄酮方法，并对
提取产物实验了清除·OH 和 O －2·活性测定，得出
提取荔枝壳中黄酮的最佳工艺条件为:乙醇体积分
数 50%，料液比 1 ∶ 70，提取时间为 100 min，酶用
量为 0． 12%，荔枝壳中黄酮类物质的提取率为
5． 10% ．提取产物对 O －2·和·OH 自由基具有较强
的清除能力．
本法作为一种天然产物活性成分分离提取的
新技术，具有条件温和、快速的特点．将超声波和纤
维素酶的特点综合利用，对提取荔枝壳中的黄酮具
有一定的适用价值．荔枝壳中黄酮物质的分离纯化
等问题有待进一步探究．
致谢 内江师范学院自然科学基金( 12NJZ02)
对本文给予了资助，谨致谢意．
参考文献
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Study on Extraction of Total Flavonoids and Antioxidant Activity of
Litchi Shell by Ultrasonic and Enzymatic Method
ＲUAN Shangquan1，2， SONG Qiuju1， HE Huirong1，
ZHANG Yu1， LUO Daying1， LAN Ziping1，2
(1． College of chemistry and chemical engineering，Neijiang Normal College，Neijiang 641112，Sichuan;
2． Key Laboratory of Fuuit Waste Treatment and Ｒesource Ｒecycling of the Sichuan Provincial College，
Neijiang Normal College，Neijiang 641112，Sichuan)
Abstract:Ultrasonic and enzymatic methods were used to extract total flavonoids from litchi shell． Based on single factor experi-
ment，ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction power，pH，the amount of enzyme，the temperature and the time of extrac-
tion on extraction rate were investigated． By orthogonal experiment，the optimum extracting conditions were as follows:the ethanol con-
centration was 50%，the ratio of solid to liquid was 1∶ 70，the time of extraction was 100 min，the amount of enzyme is 0． 12%，the
highest extraction rate of the average extraction rate was reached to 5． 10% ． The flavonoids was able to scavenge O －2· and ·OH strongly．
Key words:litchi shell;ultrasonic;cellulose;flavonoids;antioxidant activity
( 编辑 陶志宁)
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