全 文 ：分 析 检 测
2015年第18期
Vol . 36 , No . 18 , 2015
HPLC法同时测定枣叶中5种黄酮的含量
李喜悦，高 哲，王荣芳，崔 璨，安小楠，崔 同*
（河北农业大学食品科技学院，河北保定 071000）
摘 要：建立了一种枣叶中黄酮类成分定量分析的HPLC方法，并对14个品种的大枣及酸枣叶中这5种黄酮的含量进
行了分析。结果得到采用Hypersil BDS C18色谱柱，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，流速1 mL/min，柱温
30 ℃，检测波长360 nm，实现了槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、
槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷5种黄酮苷的同时检测，最低检出限为1.44~2.59 μg/mL，加标回
收率在93.8%~105.9%之间。5种黄酮苷的含量测定结果表明不同品种的枣叶中黄酮类成分的组成和含量差异较大，
其中芦丁和槲皮素-3-O-洋槐糖苷的含量较高，平均为7.83 mg/g D.W和4.61 mg/g D.W；8个品种枣叶中检测到槲皮
素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷，平均5.32 mg/g D.W；而槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-
芸香糖苷的含量较低，分别为0.14 mg/g D.W和0.41 mg/g D.W。
关键词：HPLC，枣叶，黄酮，芦丁，槲皮素-3-O-洋槐糖苷
Determination of five flavonoids in jujube leaves by HPLC
LI Xi-yue，GAO Zhe，WANG Rong-fang，CUI Can ，AN Xiao-nan，CUI Tong*
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China）
Abstract：The purpose was to establish a method for determining flavonoids in jujube leaves using HPLC，and
analyze flavonoids contents in jujube leaves from 14 different cultivars by this method. The samples were
separated on a Hypersil BDS C18 column，the mobile phase consisted acetonitrile and water with 0.1% formic
acid ，separations were achieved by a gradient elution program ， the flow rate was 1 mL/min ， the column
temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was at 360 nm. Under these conditions，five flavonoids
including quercetin-3-O-robinobioside，rutin，quercetin-3-O-β-D-glucoside，kaempferol-3-O-rutinoside
and quercetin-3-O-α-L-arabinosyl-（1→2）-α-L-rhamnoside were detected by one injection. The minimum
detection limit was 1.44~2.59 μg/mL. The average recovery rate was 93.8%~105.8%. The results revealed that
in terms of flavonoids，the difference of the composition and contents among the different cultivars was
siginificant. The average contents of rutin and quercetin-3-O-robinobioside were 7.83 and 4.61 mg/g D.W，
respectively，which were higher compared with other flavonoids. Only 8 cultivars detected the existence of
quercetin-3-O-α-L-arabinosyl-（1→2）-α-L-rhamnoside，whose average contents was 5.32 mg/g D.W.
However，the contents of quercetin-3-O-β-D-glucoside and kaempferol-3-O-rutinoside were lower，they
were 0.14 and 0.41 mg/g D.W，respectively.
Key words：HPLC；jujube leaves；flavonoids；rutin；quercetin-3-O-robinobioside
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2015）18-0049-05
doi：10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.001
收稿日期：2015－01－16
作者简介：李喜悦（1990-），女，在读硕士研究生，研究方向：功能食品化学，E-mail：lixiyue123456@163.com。
* 通讯作者：崔同（1956-），男，教授，研究方向：天然产物活性成分分析，E-mail：cuitong98@aliyun.com。
基金项目：国家林业公益性行业科研专项（201304708）。
枣叶是鼠李科（Rhamnaceae）枣属植物枣（Ziziphus
Jujuba Mill.）和酸枣[Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa
（Bunge）Hu ex H. F. Chow]的叶子。据《日华子本草》
记载，枣叶性味“温，无毒”。而据《本草纲目》记载，酸
枣叶可“敛疮解毒，治胫臁疮”。
据报道，黄酮类成分是枣叶中含量较高的活性
成分[1-3]，然而目前对枣叶中黄酮类成分定量分析方
面的研究并不多见。李兰芳等[4]采用薄层扫描法测定
了不同采收期酸枣叶中芦丁的含量。裴香萍等[5]利用
HPLC法测定了不同产地、不同采收期酸枣叶中芦丁
的含量，但其采用的色谱条件没有将芦丁与其前面
的色谱峰有效分离。张倩倩等[6]经DAD检测发现芦丁
与其色谱峰前面的组分不是同一种化学成分，但并
没有进一步确证其化学结构。Guo Sheng等[1]建立了
同时测定3种黄酮（芦丁、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯
糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-木
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糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷）以及2种皂苷和9种三萜
的HPLC-ELSD分析方法，但是需要使用特殊的检测
器。最近本实验室研究结果表明，大枣和酸枣的叶中
有多种黄酮苷类成分，对其中5种含量较高的黄酮苷
进行了分离纯化和结构鉴定[7]。本研究拟在前期研究
基础上，建立一种同时测定枣叶中这5种黄酮含量的
HPLC方法，并对不同品种的大枣及酸枣叶中的这5种
黄酮的含量进行测定，为枣叶资源开发利用及相关
产品质量控制提供新的检测手段。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
枣叶样品 共计14个品种（大酸枣、冬枣、赞皇
大枣、敦煌大枣、大木枣、金丝小枣、串铃、茶壶枣、无
核枣、梨枣、晋枣、宣城圆枣、板枣、连县木枣），均采
自河北省沧县国家枣树良种繁育基地，采样时间为
2013年10月7日，采回后经真空冷冻干燥，放置在真
空干燥器中备用；对照品：槲皮素-3-O-洋槐糖苷、
芦丁（槲皮素-3-O-芸香糖苷）、槲皮素-3-O-β-D-
葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-α-
L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷 均由本实验
室从枣叶中分离提纯，经HPLC-ESI-MS、1H-NMR和
13C-NMR法鉴定[7]并与相关文献 [8-11]对比得到确证，
通过HPLC峰面积归一化法测得其纯度≥95%；乙
腈 Honeywell Burdick & Jackson公司，色谱纯，高效
液相色谱（HPLC）流动相用；纯净水 杭州娃哈哈集
团有限公司；其余试剂 为分析纯。
Agilent 1200型HPLC 由在线脱气机，四元输液
泵，光电二极管阵列检测器以及Agilent Chemstation
色谱工作站组成，Agilent公司；配用CO-3010柱恒温
控制箱 天津美瑞泰克科技有限公司；Hypersil BDS
C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo Hypersil BDS C18
（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Lab Alliance Kromasil C18
（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱 大连依利特公司；
TB-215D型微量分析天平 德国赛多利斯股份有限
公司；SK5200H型超声振动仪 上海波龙电子设备
有限公司；FD-1B-50型冷冻干燥机 北京博医康实
验仪器有限公司；Anke TDL-5型离心机 上海安亭
科学仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理 考察不同的提取溶剂：80%甲
醇、50%甲醇、70%乙醇、95%乙醇的提取效果。准确
称取冻干的枣叶样品1.000 g，放入研钵中，加入20 mL
上述四种提取溶剂，研磨均匀后转移至25 mL容量瓶
中，超声波（80 W）提取30 min，用提取溶剂定容，静
置3 min，取部分上清液于离心机上4000 r/min离心
5 min，经0.45 μm滤膜过滤，用于HPLC测定。
1.2.2 HPLC分析条件的选择 比较Hypersil BDS C18
（4.6 mm×250 mm，5 μm），Thermo Hypersil BDS C18
（4.6 mm×250 mm，5 μm），Lab Alliance Kromasil C18
（4.6 mm×250 mm，5 μm）三种不同色谱柱的分离效
果；比较甲醇-0.05%甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-
0.05%甲酸、乙腈-0.1%甲酸等不同流动相及不同的
梯度洗脱程序；分析5种黄酮的检测波长（扫描范围
210~400 nm），确定最合适的检测波长。
1.2.3 HPLC分析条件 色谱柱Hypersil BDS C18
（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A：1 mL/L甲酸水溶
液；B：乙腈含1 mL/L的甲酸；梯度洗脱程序：0~16 min，
15% B；16~20 min，15%~17% B；20~28 min，17% B；
28~30 min，17%~22% B；30~35 min，22%~100% B；
35~40 min，100% B；40~42 min，100%~15% B；42~
52 min，15% B；流速为1 mL/min；柱温30 ℃；DAD检
测器，检测波长360 nm；进样量：10 μL。
1.2.4 标准溶液的配制与曲线的绘制 精确称取槲
皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄
糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿
拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷对照品溶于甲醇中，
配制成1000 μg/mL的混合对照品贮备液。精密吸取
贮备液，分别稀释成500、250、100、50、10 μg/mL的混
标溶液，置于样品瓶中，4 ℃保存待用。按照1.2.3的色
谱条件进行HPLC测定，以进样浓度（X，μg/mL）为横
坐标，峰面积（Y，mv·s）为纵坐标，求出直线回归方
程，绘制标准曲线。
1.3 数据处理
数据统计及处理软件为Origin 6.0。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
结果表明，采用70%乙醇作为提取溶剂时，5种
黄酮类成分的峰面积均达到最大值，因此，确定70%
乙醇水溶液为枣叶黄酮的提取溶剂。
2.2 色谱柱及填料的比较
结果表明，尽管3种色谱柱的装填尺寸相同，但
使用Lab Alliance Kromasil C18色谱柱时槲皮素-3-
O-洋槐糖苷与芦丁会重合为一个峰，而使用Thermo
Hypersil BDS C18色谱柱时，山奈酚-3-O-芸香糖苷与
槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖
苷不能实现基线分离，而Hypersil BDS C18（4.6 mm×
250 mm，5 μm）色谱柱对5种黄酮均能实现很好的
分离。
2.3 检测波长的选择
鉴于实验中5种黄酮苷成分母核骨架为槲皮素
或山奈酚，在此仅列出槲皮素-3-O-洋槐糖苷和山
奈酚-3-O-芸香糖苷的紫外吸收光谱图，见图1，由
图1可以看出，紫外吸收光谱接近一致，分别在255~
265 nm和355~360 nm有2个强吸收带，且360 nm吸收
带更强，为提高方法的灵敏度，减少干扰，本实验选
择波长更长的360 nm为检测波长，使各组分均能得
到较高的响应值。
2.4 流动相的选择
结果显示，当用甲醇-水作为流动相梯度洗脱时，
槲皮素-3-O-洋槐糖苷与芦丁会重合为一个峰，不
能实现分离。样品用乙腈和水并按照上述1.2.3的梯
度程序洗脱时，目标峰之间分离效果以及灵敏度均
较好，所得色谱图基线平稳。由于黄酮苷属于多酚类
成分，流动相中加入适量的酸可抑制拖尾，改善峰
形，从而提高组分的分离度，因此实验采用含0.1%甲
酸的乙腈水溶液为流动相，采用15%乙腈的洗脱强
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成分 回归方程 相关系数 线性范围（μg/mL） 最低检出限（μg/mL）
槲皮素-3-O-洋槐糖苷 Y=8.2890X+72.564 0.9996 10~1000 1.73
芦丁 Y=9.2639X+37.698 0.9999 10~1000 1.81
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 Y=12.1730X+10.442 0.9999 10~500 1.44
山奈酚-3-O-芸香糖苷 Y=7.2426X+12.615 0.9999 10~500 2.59
槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷 Y=8.9805X+75.926 0.9996 10~1000 2.50
表2 回归方程、相关系数、线性范围和最低检出限
Table 2 The regression equation，correlation coefficient，linear range and minimum detection limit
图1 槲皮素-3-O-洋槐糖苷（A）和山奈酚-3-O-芸香糖苷
（B）的紫外吸收光谱图
Fig.1 UV absorption spectra of quercetin 3-O-robinobioside（A）
and kaempferol-3-O-rutinoside（B）
波长（nm）
220 260 300 340 380
300
200
100
0
响
应
值
（
m
AU
）
A
波长（nm）
220 260 300 340 380
300
200
100
0
响
应
值
（
m
AU
）
B
图2 5种黄酮混合对照品（A）和晋枣枣叶样品（B）的HPLC图
Fig.2 HPLC profile of flavonoid references（A）and jujube
leaves sample（B）
注：1.槲皮素-3-O-洋槐糖苷；2.芦丁；3.槲皮素-3-O-β-D-葡
萄糖苷；4.山奈酚-3-O-芸香糖苷；5.槲皮素-3-O-α-L-阿拉
伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷。
时间（min）
0 10 20 30 40 50
100
80
60
40
20
0
响
应
值
（
m
AU
）
A
B
12
3
4
5
时间（min）
0 10 20 30 40 50
100
80
60
40
20
0
响
应
值
（
m
AU
）
1
2
3 4
5
度，16 min的等度洗脱，使难分离组分槲皮素-3-O-洋
槐糖苷和芦丁实现了分离，而在随后的梯度洗脱条件
下，样品中的其他3种黄酮也都实现了基线分离。5种
对照品和晋枣枣叶样品的色谱图见图2。由图2可以
看到，在选定的分析条件下，样品中的5种黄酮的色
谱峰与其他杂峰在30 min内实现了良好分离，峰形
对称不拖尾。
2.5 HPLC分析方法的评价
2.5.1 精密度实验 取混合对照品溶液（槲皮素-3-
O-洋槐糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山
奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-
（1→2）-α-L-鼠李糖苷的质量浓度均为0.25 μg/mL），
按1.2.3中的色谱条件重复进样分析，平行进样5次，
统计色谱峰的面积，计算相对标准偏差以评价方法
的精密度，结果见表1，相对标准偏差（RSD）在0.59%
~1.14%之间，表明仪器精密度良好。
2.5.2 方法的回归方程、线性范围和最低检出限 按
1.2.4步骤配制混合对照品系列标准溶液，按1.2.3色
谱条件在10~1000 μg/mL浓度范围进样分析，评价方
法的线性回归方程、相关系数和线性范围，并以3倍
信噪比所对应的进样浓度求得最低检出限，结果列
于表2。结果表明，响应值与进样量之间具有良好线
性相关性，相关系数介于0.9996~0.9999之间，最低检
出限较低（1.44~2.59 μg/mL），可以满足常规样品的
定量分析。
2.5.3 方法的加标回收率实验 分别准确称取已知
质量的对照品，按其在枣叶中常规含量确定相应的
加标水平，并以枣叶（冬枣）为样品按1.2.1所述方法
进行处理，平行做5份加标实验，并按1.2.3中的色谱
条件分别测定未加标样品和加标样品，进行分析。统
计计算各成分的加标回收率，结果见表3。结果表明，
成分 RSD（%）
槲皮素-3-O-洋槐糖苷 0.59
芦丁 0.82
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 0.76
山奈酚-3-O-芸香糖苷 1.14
槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷 0.88
表1 方法精密度的评价结果
Table 1 Evaluation of the precision
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成分 加标量（mg/g） 回收率（%） RSD（%）
槲皮素-3-O-洋槐糖苷 3.82 105.9 2.42
芦丁 3.83 98.5 1.14
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 0.08 93.8 1.41
山奈酚-3-O-芸香糖苷 0.66 101.5 0.84
槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷 3.60 104.4 1.74
表3 5种黄酮的加标回收率
Table 3 Recoveries of 5 flavonoids
表4 不同品种枣叶中5种黄酮的含量测定结果（x±SD，mg/g D.W）
Table 4 Determination results of 5 flavonoids content in jujube leaves among different cultivars（x±SD，mg/g D.W）
品种
槲皮素-3-O-
洋槐糖苷
芦丁
槲皮素-3-O-β
-D-葡萄糖苷
山奈酚-3-O-
芸香糖苷
槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖
-（1→2）-α-L-鼠李糖苷
大酸枣 5.39±0.10 8.89±0.12 0.17±0.01 0.41±0.01 6.96±0.14
冬枣 3.82±0.10 3.84±0.08 0.07±0.01 0.66±0.03 3.59±0.03
赞皇大枣 1.26±0.03 1.68±0.03 0.07±0.01 0.07±0.01 3.27±0.08
敦煌大枣 2.68±0.09 4.80±0.17 0.08±0.01 0.08±0.01 -
大木枣 3.06±0.14 5.23±0.06 0.11±0.01 0.40±0.01 5.23±0.16
金丝小枣 4.33±0.11 6.35±0.16 0.18±0.01 0.41±0.01 6.86±0.11
串铃 8.21±0.22 16.07±0.48 0.18±0.02 0.50±0.02 -
茶壶枣 8.24±0.20 12.12±0.23 0.18±0.01 0.35±0.01 -
无核枣 2.82±0.13 3.00±0.18 0.15±0.02 0.28±0.03 4.49±0.35
梨枣 9.16±0.28 15.13±0.38 0.34±0.02 0.17±0.02 -
晋枣 2.64±0.12 3.67±0.16 0.10±0.01 0.43±0.03 4.12±0.12
宣城圆枣 1.98±0.15 4.86±0.13 0.13±0.01 0.26±0.02 -
板枣 5.74±0.07 15.81±0.08 0.10±0.01 1.08±0.03 -
连县木枣 5.17±0.10 8.16±0.20 0.10±0.01 0.65±0.04 8.05±0.10
平均值 4.61±0.13 7.83±0.18 0.14±0.01 0.41±0.02 5.32±0.14
注：-表示未检出。
5种黄酮的回收率介于93.8%~105.9%之间，RSD为
0.84%~2.42%，回收率均较高，可满足常规定量分析
需要。
2.6 不同品种枣叶中5种黄酮的含量测定
按照1.2所述的方法，对秋季采集的14个品种枣
叶中5种黄酮的含量进行分析，结果见表4。
由表4可以看出，在14个不同品种的枣叶中均检
测出槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-
D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷4种黄酮，但其
含量存在较大差异。14个品种枣叶中芦丁的含量最
高，平均7.83 mg/g，其中串铃、梨枣和板枣中的含量
高达15~16mg/g；在本研究中由于实现了槲皮素-3-
O-洋槐糖苷与芦丁的分离，使得前者的含量可以单
独进行统计，其在14个品种中的含量仅次于芦丁，平
均4.61 mg/g，在串铃、茶壶枣和梨枣中其含量均超过
8 mg/g，是枣叶中的重要黄酮成分。槲皮素-3-O-α-
L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷是一种特殊的黄
酮成分，仅在8个品种中检出，平均含量为5.32 mg/g。
其余2种黄酮，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈
酚-3-O-芸香糖苷，在14个品种枣叶中含量较低，平
均值分别为0.14和0.41 mg/g。
3 结论
本文建立了一种同时测定枣叶中5种黄酮的反
相高效液相色谱法，通过对色谱条件的优化，在选定
的分析条件下，5种黄酮在30 min内实现了良好的分
离，且该方法最低检出限较低（1.44~2.59 μg/mL），加
标回收率均在93%以上。该方法简单准确、灵敏、重
复性好，可用于枣叶中黄酮成分的定量分析。采用建
立的方法对14个不同品种枣叶5种黄酮的含量进行
了分析，结果表明，不同品种枣叶中这些黄酮类成分
的组成和含量有较大差异，芦丁和槲皮素-3-O-洋
槐糖苷是枣叶中含量最高的两种黄酮。
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3 结论
针对四环素类抗生素在复杂样品中吸附特异性
偏低和检测时间较长等问题，利用表面分子印迹技
术，合成磁性分子印迹复合物，结合固相萃取-高效
液相色谱技术，可实现15 min之内同时检测样品中
多种抗生素残留。Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物
的最大吸附量Qmax为56.28 mg/g，对样品中土霉素、四
环素、金霉素药物的平均加标回收率分别达到了
100.08%、93.71%、100.88%，变异系数在1.54%~7.44%
之间，精密性实验的相对标准偏差在2.60%以内，实
验方法准确可靠、重现性良好。大量实验也表明，使
用分子印迹技术提高了对目标分子的吸附选择性，
为食品中四环素类抗生素污染的监控和治理提供了
更完善的快速富集手段。该方法也可推广到其他复
杂样品中农兽药的残留分析。
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（上接第52页）
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