全 文 ：· 2342· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.30 中国药房 2009年第 20卷第 30期
Δ广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻 0718002-3-13);
广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(Z2005154);广西医疗卫生
重点科研课题(重 200706)
*副主任药师 ,副教授 ,硕士 ,硕士研究生导师。研究方向:中药分
子生物学、医院药学。电话:0771-5318407。E-mail:hqc28705@ya-
hoo.com.cn
·中药工艺与制剂·
岩黄连总 DNA 不同提取方法的比较 Δ
黄其春 1 *,龙俊青 2 ,蒋满州 3 ,王 耿 3(1.广西医科大学附属肿瘤医院 ,南宁市 530021;2.广西壮族自治区妇
幼保健院 ,南宁市 530003;3.南宁市壮都生物科技有限公司 ,南宁市 530011)
中图分类号 R284.2;R283 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)30-2342-03
摘 要 目的:比较 4种提取岩黄连总 DNA 的方法 ,以获得高质量的 DNA 样品 。方法:分别以十六烷基三甲基溴化胺 、加酶洗衣
粉 、异硫氰酸胍 、惰性高分子吸附柱法提取岩黄连总 DNA , 测定其纯度(以 R A 260/ A 280计)和提取率 。结果:4种方法得到样品的
R A 260/A 280分别 1.832 9 、1.699 2 、1.812 2 、1.813 6;提取率分别为 140.20 、69.56 、132.50 、143.12μg ·g -1。结论:4种方法都能获得
质量较好的 DNA 样品 ,其中 ,加酶洗衣粉法的提取率相对较低 ,而异硫氰酸胍法和吸附柱法快速简便 ,可用于标本量少的试验 。
关键词 岩黄连;十六烷基三甲基溴化胺;异硫氰酸胍;加酶洗衣粉;吸附柱;脱氧核糖核酸;提取
Extraction of DNA from Corydal is saxicola:Comparison among Different Extraction Methods
HUANG Qi_chun(The Cancer Hospi tal of Guangxi M edical Univ ersity , Nanning 530021 ,China)
LONG Jun_qing(G uangx i M a ternal and Child Health Hospital , Nanning 530003 ,China)
JIANG M an_zhou ,WANG Geng (Nanning Zhuangdu Biotechnology Co.Ltd., Nanning 530011 ,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To draw a comparison among four ex t raction m ethods of tot al DNA f rom Corydalis sax icola in
o rder to ge t high quality DNA sam ple.METHODS:The total DNA w as ex tracted by palmity l trime thy l ammonium bromide
m ethod , enzyme -added dete rgent method , guanidinium isothiocyanate m ethod , ine rtm acromolecula r adsorptive co lum n
m ethod , respectively.The purity(defined as R A 260/ A 280)and the y ield of the tota l DNA w ere dete rmined.RESU LTS:The
R A 260/A 280 values of the DNA samples ex tracted by 4methods w ere 1.832 9 , 1.699 2 , 1.812 2 and 1.813 6 , respective ly ;and the
ex traction rates were 140.20 μg · g -1 , 69.56μg ·g -1 , 132.50μg · g -1 and 143.12μg ·g -1 , respec tively.CONCLUS ION :
DNA samples ex tracted in 4 methods w ere a ll of high quality.The y ield of DNA sam ple in enzyme -added ex trac tion method
w as lower , w hile the guanidinium iso thiocyanate method and t he adsorption co lum n method were rapid and sim ple and they are
suitable fo r the test of sam ples of small size.
KEY WORDS Coryaa lis sa xicola ;Palm ity l trime thy l ammonium bromide;Guanidinium isothiocyanate ;Enzyme -added
de te rgent;Adsorption colum n;DNA ;Extraction
3.6 尸检
在停药时与停药 2周后对处死的大鼠进行解剖 。结果 , 热
咳停颗粒高 、中 、低剂量组与对照组大鼠的心 、肝 、脑 、脾 、胃 、
肠 、肾 、肾上腺 、甲状腺 、前列腺 、睾丸 、卵巢 、子宫等主要器官的
大小 、形状 、颜色 、质地均正常 ,均未发现可见病变 。
3.7 脏器与体质量比
对上述尸检时的各脏器称定重量 ,求出各脏器与 100 g 体质
量的比值 ,并对热咳停颗粒高、中、低剂量组与对照组的脏器比系
数进行 t检验 。经病理组织学检查 , 与对照组比较 , 热咳停颗粒
中 、低剂量组各器官无显著病理学变化;热咳停颗粒高剂量组除
少数大鼠的肝、肾有轻度损害外 ,其它器官亦无显著病理学变化;
停药 2周后检测上述各项指标和尸检各脏器同样未见异常 。
4 讨论
研究中 ,大鼠体质量逐渐增长 ,生长发育良好 ,未发现可见
的毒性反应;除热咳停颗粒高剂量组大鼠肝、肾功能有所损害
外 , 其它各组大鼠外周血象 , 尿常规 , 肝 、肾功能及血液生化指
标的检测均在常值范围之内;尸检热咳停颗粒高 、中 、低剂量组
与对照组大鼠的各主要脏器未见肉眼可见的病变和异常;对热
咳停颗粒高剂量组与对照组大鼠的主要器官进行病理组织学
检查发现 , 热咳停颗粒高剂量组中少数动物的肝 、肾有轻度损
害 , 其它器官无显著的病理学变化;停药 2周后检测上述各项
指标和病检各脏器同样未见异常 。
本研究表明 , ig 热咳停颗粒剂量在 18 ～ 94 g ·kg -1时 , 对
大鼠无明显的毒性与损害;而 ig 本品在 188 g ·kg -1剂量时 ,
对大鼠肝 、肾有一定损害 ,但停药后可恢复 。
本研究结果可提供毒性反应的靶器官及其损害的可逆性 ,
确定了热咳停颗粒无毒反应剂量 , 可为拟定人用安全剂量提供
了参考 。
参考文献
[ 1] 张 庆 ,张长弓.热咳停颗粒的止咳与抗菌作用研究[ J].
医药导报 ,2005 , 24(5):383.
[ 2] 沈映君 ,李仪奎 ,张世玮 ,等.中药药理学[ M ] .上海:上海
科学技术出版社 , 1997:24.
(收稿日期:2009-04-12 修回日期:2009-07-24)
中国药房 2009年第 20卷第 30期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.30 · 2343·
罂粟科植物石生黄堇(Corydalis sa xicola Bunting)又名
岩黄连 , 野生品种分布于广西 、贵州 、云南 、四川等省区的石山
地区 ,广西已大面积栽培 [1 ] 。近年来 ,对岩黄连的研究多集中在
药材及其制剂中化学成分的检测 、作用机制和临床治疗方面 ,
对其基因组 DNA 的提取也有报道 [ 2 ～5 ] 。为深入研究岩黄连的
遗传多样性 、种植资源 、亲缘关系等 ,为该药材的质量控制提供
技术支持 , 需要获取高质量的 DNA 样品 , 故笔者考察了几种
提取岩黄连总 DNA 的方法 。
1 材料
1.1 仪器
DU 800型核酸蛋白分析仪(美国 Beckm an公司);Alpha
Im ager HP 型凝胶成像系统 (美国 Alpha Inno tech 公司);
TGL -Form a O rbit al型摇床 (美国 Thermo Electron 公司);
BS-224S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
1.2 试药
三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tr is-HCl)、十六烷基三甲
基溴化胺 (CTAB)、聚乙烯砒咯烷酮 (PVP)、乙二胺四乙酸
(EDTA)、巯基乙醇 、RNA 酶(RNaseA)、50×TAE 缓冲液 、琼
脂糖 、溴化乙锭 、柱式植物基因组 DNA 提取试剂盒(上海生工
生物工程技术服务有限公司);植物基因组 DNA 提取系统(北
京鼎国生物技术有限责任公司);DNA M arker (北京索莱宝科
技有限公司);岩黄连采自广西东兰县达文岩黄连种植基地 , 经
广西东兰县农业局技术中心韦忠福技师鉴定为真品 , 植株移种
后取其鲜叶或嫩叶;其余试剂均为分析纯 。
2 方法与结果
2.1 CTAB法
参考文献 [ 6 ]略加改进 。取岩黄连鲜叶 2 g , 75%乙醇漂洗 ,
沥干 ,液氮冷冻研磨至粉末状 。转入 10 mL离心管中 ,加 3 mL
预热至 95 ℃的 CTAB提取缓冲液 (100 mmol · L -1 T ris -
HCl(pH 8.0)、20mmol ·L -1EDTA 、1.4mol ·L -1 NaCl 、2%
CTAB 、2%PVP 、0.2%巯基乙醇)、500μL PB液(10%CTAB 、
10%PVP 、4%NaCl)、0.02 gV E ,混匀后 65 ℃水浴 1.5 h ,期间
颠倒翻转离心管 3 ～ 5次 。取出离心管 ,冷却至室温。加入 500
μL PB液 、等体积(3.5 mL)的氯仿-异戊醇(24∶1),混匀 ,置于摇床上来回震动 1 h 。取出离心管 , 4 000 r ·min -1离心 30
m in , 取上清液至另一离心管 , 加入 PB液 1 mL 、等体积(3.5
mL)的氯仿-异戊醇(24∶1),混匀后 4 000 r ·min -1离心 10
m in 。取上清液 ,加入 —20 ℃的等体积异丙醇 ,轻柔混匀后静置
30 min , 出现絮状沉淀 。10 000 r ·min -1离心 5 min , 弃上清
液 , 沉淀转移至干净的 1.5 mL 离心管中 , 加 70%乙醇洗涤 3
次 ,弃去乙醇 ,DNA 自然晾干 10 min 。加入 500μL TE 缓冲液
(10mmol ·L -1 Tris-HCl(pH 8.0)、1 mmol ·L -1 EDTA)溶
解 DNA ,加入10μL RNaseA ,37 ℃恒温水浴1 h 。加入0.1体积
的 3mol· L -1CH 2COONa 、2体积的无水乙醇 ,小心混匀 ,置于
—20℃冰箱 60min ,DNA再次呈絮状沉淀析出 。10 000 r·m in -1
离心 5 min , 弃去上清液 。加 70%乙醇洗涤 3次 , 自然晾干 10
m in ,加入 200μL TE液 , 4 ℃保存复溶 ,得样品 a 。
2.2 加酶洗衣粉法
参考文献 [7 ]略加改进。取岩黄连鲜叶 0.8 g , 75%乙醇漂
洗 , 沥干 , 液氮冷冻研磨至粉末状 , 转移至 1.5 mL 离心管中 ,
加入 0.5 mL洗洁精和 0.5mL 蒸馏水 ,混匀 , 37 ℃水浴过夜消
化 。加入苯酚-氯仿-异丙醇(25∶24∶1)0.5mL ,混匀 , 10 000
r ·min -1离心 6min , 取上层水相至另一新的离心管中。加入 10
μL RNaseA , 37 ℃水浴 1 h , 取出 , 加入 0.1体积 3 mol ·L -1的
CH2COONa 、2体积无水乙醇 , 置于冰箱过夜。取出 , 15 000 r ·
min -1离心 15 min , 弃上清液 , 加入 200 μL 70%乙醇洗涤 2
次 ,室温晾干 ,加入 T E液 100μL , 4 ℃存放过夜 ,得样品 b 。
2.3 异硫氰酸胍法
取岩黄连嫩叶 80 mg , 按植物基因组 DNA 提取系统说明
书操作 ,得样品 c 。
2.4 惰性高分子吸附柱法
取岩黄连嫩叶 80 mg , 按柱式植物基因组 DNA 抽提试剂盒
说明书操作 ,得样品d。
2.5 DNA纯度与提取率的检测
取样品 a 稀释 40倍 , 样品 b稀释 30倍 , 样品 c与样品 d
各稀释 10倍 , 采用核酸蛋白分析仪测定 A 260 nm 与 A 280 nm , 各
测 3次 ,取平均值 。根据 A 260值估测 DNA 浓度(1.0 A 260=50
μg ·mL -1 , 1 cm 光程)和提取率 [6 ] ;DNA 纯度用同一 DNA 样
品在波长 260 nm 与 280 nm 处的吸收度比值即 R A 260/ A 280表
示 。4种方法提取岩黄连总 DNA 的结果见表 1。
表 1 4种方法提取岩黄连总 DNA的结果(n=3)
Tab 1 Yield of total DNA extracted from Corydalis saxi-
cola by 4 dif ferent methods(n=3)
样品 A 2 6 0 nm A 28 0 nm R A 2 60/ A 2 8 0 提取率/μg · g -1
a 0.701 0.383 1.832 9 140.20
b 0.371 0.218 1.699 2 69.56
c 0.424 0.234 1.812 2 132.50
d 0.458 0.252 1.813 6 143.12
纯 DNA 样品的 RA 260/A 280应为 1.6 ～ 1.8。若>1.9 ,表明有
RNA 污染;若<1.6 ,表明存在蛋白质或酚污染 [8 ] 。由表 1可知 ,
4种方法提取的样品 RA 260/A 280都在此范围 ,说明纯度较好 。
2.6 琼脂糖凝胶电泳检测
取稀释后的各样品液 5 μL , 加 0.2%溴酚蓝溶液 1 μL混
匀 , 上样 , 进行琼脂糖
凝胶电泳(琼脂糖凝胶
1%, 1×TAE电泳缓
冲液 , 电压 80 V ,电流
80 mA , 50 min)检测 ,
凝胶成像系统检视拍
照 。电泳结果见图 1。
图 1中 ,电泳方向
从下到上 , 4种方法均
可看到明显的 DNA
条带 , 条带整齐集中 ,
说明基因组 DNA 较
完整 , 无断裂现象;样
品条带较 1500 bp标准
DNA 的条带明显拖
后 ,说明分子量较大 。
3 讨论
CTAB 法 、 十二
烷基硫酸钠(SDS)法等是传统的 DNA 提取与纯化方法 , 基本
原理是裂解细胞 ,释放出 DNA 及其它细胞内物质;苯酚 、氯仿
等有机溶剂多次抽提 , 使蛋白质变性沉淀于有机相 , 而核酸
(DNA 、RNA)保留在水相 ,达到分离的目的;水相加入RNA 酶
水解去除核酸中的 RNA ;加入异丙醇 、乙醇使 DNA 沉淀;70%
乙醇洗涤沉淀 , 除去分离过程中带入的有机溶剂和盐离子;
DNA 复溶保存 , 备用 [7 ]。在此基础上 ,相继出现了几十种提取
方法 [8 ] 。同时 ,市场上不断推出的各种 DNA 提取试剂盒 ,为研
究者提供了更加简便 、快速 、经济 、安全的手段 。
· 2344· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.30 中国药房 2009年第 20卷第 30期
冠心 Ⅱ号煎剂煎煮方法研究 Δ
甘洪全 1 * ,屈 扬 1 ,梅其炳 1# ,胡玉珍 2 ,黄 熙 3(1.第四军医大学药学系药理学教研室 ,西安市 710032;2.
第四军医大学基础部生理学教研室 ,西安市 710032;3.四川大学华西医院中西医结合科 ,成都市 610041)
中图分类号 R283.5;R285.5;R289 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)30-2344-04
摘 要 目的:研究冠心Ⅱ号煎剂煎煮方法 。方法:采用梯度洗脱方法 ,建立同时测定冠心Ⅱ号煎剂中丹参素 、原儿茶醛 、芍药苷和
阿魏酸的反相高效液相色谱法 ,考察加水量和煎煮时间对活性成分溶出量的影响。结果:4种活性成分的含量均随加水量增多而增
高 ,丹参素 、原儿茶醛的含量随煎煮时间延长而增高 ,芍药苷和阿魏酸的含量分别在 30 、60 min时达到高峰 。结论:适合冠心Ⅱ号煎
剂的最佳煎煮方法为加 12倍水煎煮 60 min 。
关键词 丹参素;原儿茶醛;芍药苷;阿魏酸;煎煮工艺;冠心Ⅱ号;中药复方
Decocting Processes of Guanxin Ⅱ Decoction
GAN Hong_quan , QU Yang , MEI Qi_bing(Dept.of Pharmacology , School of Pharmacy , The Fourth M ili-
tary Medical Universi ty , Xi an 710032 ,China)
HU Yu_zhen(Dept.of Phy siolog y , Schoo l of Basic M edicine , T he Fourth M ili tary Medical University , Xi an
710032 ,China)
HUANG Xi(Dept.of Combined Traditional Chinese and Weste rn M edicine , West China Hospital , Sichuan
Universi ty ,Chengdu 610041 , China)
ABSTRACT OBJECTIVE:T o study the decocting process of Guanx in Ⅱ decoction.M ETHODS:The RP -HPLC method
w ith linear g radient elution w as established fo r simultaneous dete rmination of danshensu , pro toca techuic aldehyde , paeoniflo rin
and ferulic acid in Guanx in Ⅱ decoc tion.T he effec ts o f w ate r amount added and the decocting time on the dissolution o f the
active components in Guanx in Ⅱ decoction w ere observed.RESULTS :T he disso lution o f fou r active components increased as
the amount of w ate r added increased , w hile the contents of Danshensu and p rotocatechuic aldehyde increased as the decocting
time increased.The contents of paeoniflo rin and ferulic acid peaked a t 30 minutes and 60 minutes , respectively.CONCLU-
S ION :The optimal decocting m ethod o f Guanx in Ⅱ is as fo llow s:add 12-f old am ount o f w ater and decoct fo r 60 minutes.
KEY WORDS Danshensu;Pro tocatechuic aldehyde;Paeoniflorin;Ferulic acid;Decocting process;Guanxin Ⅱ;Com pound
traditional Chinese medicine
Δ陕西省自然科学基金资助项目(2006C 222)
*讲师 , 博士。研究方向:中药复方药动学和药效学结合、天然药
物的癌症预防及新药的安全性评价。电话:029-84774555。E-mail:
g anhongquan@21cn.com
#通讯作者:教授 , 博士 , 博士研究生导师。研究方向:中药药理
学、分子药理学、新药评价。电话:029-84774552。E-mail:qbmei@
fmmu.edu.cn
从 R A 260/A 280及凝胶电泳结果可知 , 本文 4种提取方法都
能获得质量较好的岩黄连基因组 DNA , 但试验效率 、标本量 、
提取率等有明显差别 。加酶洗衣粉法 3 d完成 ,其提取率约 70
μg ·g -1 ,其他 3种方法半天可完成 ,提取率超过 130μg ·g -1;
CTAB法、加酶洗衣粉法需要 0.8 ～ 2 g 标本量 , 而异硫氰酸胍
法 、惰性高分子吸附柱法需要 50 ～ 80 mg 即可 。因此 ,根据标本
量大小及下游试验对 DNA 样品的数量 、纯度要求 , 可相应采
用不同的提取方法 。
参考文献
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(收稿日期:2009-06-01 修回日期:2009-08-15)