全 文 ：第 22 卷 第 2 期
2007 年 6 月

Vol.22 No. 2
Jun 2007


收稿日期：2006-10-27；修回日期：2007-03-09
作者简介：张泽生(1956—)，男，天津人，教授，博士生导师.





苦瓜子蛋白的体外抗氧化活性研究

张泽生，张兰平，郭红莲
（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

摘 要：测定了苦瓜子蛋白提取过程中不同提取物的体外抗氧化活性，从而获得不同目标活性的蛋白组分.结果表明，
90%饱和度的硫酸铵沉淀蛋白的柱纯化组分抗氧化活性较强，30%的次之，60%的最弱，三种饱和度硫酸铵沉淀纯化得
到的苦瓜子蛋白在不同抗氧化体系中存在抗氧化活性差异.
关键词：苦瓜子蛋白；抗氧化；柱纯化；SDS-PAGE 电泳
中图分类号：TS20 文献标识码：A 文章编号：1672-6510（2007）02-0006-03

Study on Proteins from Momordica charantia Seeds for Vitro
Antioxidative Properties

ZHANG Ze-sheng，ZHANG Lan-ping，GUO Hong-lian
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）
Abstract：The test studied on the vitro antioxidative activities of proteins extracted from Momordica charantia.L seeds. The
results indicated that three proteins extracted by saturated ammonium sulphate had the different antioxidative activites in three
anti-oxidation systems. As a whole，protein precipitations by 90% saturated ammonium sulphate have the stronger activities，
while which by 60% saturated ammonium sulphate have the weakest activities.
Keywords：Momordica charantia seed protein；antioxidative；column chromatography；SDS-PAGE electrophoresis
;
苦瓜(Momordica charantia L.)是葫芦科(Cucurbi-
taceae)苦瓜属植物，又称癞葡萄和锦荔枝，属蔓性一年
生蔬菜.苦瓜不但营养价值高，一直以来受到人们喜
爱，近年来对苦瓜子活性成分的生理作用的研究也受
到国内外广大学者的关注. 研究发现，苦瓜子中多种
活性物质具有降血糖[1] 、降血脂[2] 、抗肿瘤[3] 以及抗
病毒[4]等功效，但是有关苦瓜子蛋白抗氧化研究的报
道相对较少，本文对苦瓜子蛋白在两种抗氧化体系中
的抗氧化作用进行了测定.
1 材料与方法
1.1 材料
青皮苦瓜子（河南新乡市华盛种业有限公司提
供）: 剥除外壳，磨粉，过 40 目筛，冷丙酮脱脂，风干
成干粉，密封保存于 4℃备用.
氯化亚铁、水杨酸、硫酸亚铁等；三吡啶三吖嗪
(tripyridyl-triazine，TPTZ)；丙烯酰胺；N，N-甲叉双丙
烯酰胺；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；巯基乙醇；中分
子质量标准蛋白(14.4~97.4 ku)；巯基乙醇；十二烷基
磺酸钠(SDS)；葡聚糖凝胶 Sephadex G-100.
1.2 仪器
SS230-A 多功能食物搅拌机；818 型台面式
pH/ISE 测试仪；高速组织切割机；MR 23i 冷冻离心
机；8~144 ku 透析袋；冷冻干燥机；Bio-Rad 层析系
统；岛津 1240 型紫外可见分光光度计.
1.3 实验方法
1.3.1 苦瓜子蛋白的提取纯化
脱脂苦瓜子粉加入 15 倍的提取缓冲液（缓冲液
为 pH 7.5，50 mmol/L 的 PBS），低温浸泡 12 h，植物组
织匀浆机匀浆 1 min，磁力搅拌器中速搅拌 4 h，4 ℃离
心，转速为 10 000 r/min，离心时间为 20 min，去沉淀，
DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.2007.02.002
2007 年 6 月 张泽生, 等：苦瓜子蛋白的体外抗氧化活性研究 ·7·


得粗提液. 低温条件下粗提液缓慢加入硫酸铵粉末
逐级沉淀并离心分别得到 30%、60%、90%饱和度的硫
酸铵沉淀物. 三种样品分别溶于尽量少的提取缓冲液
中，于 4℃置于透析袋中对蒸馏水透析 48 h，聚乙二醇
包埋透析袋进行浓缩，浓缩物冷冻干燥成干粉备用.
分别取三种样品溶于 pH 7.5，50 mmol/L 的磷酸
盐缓冲液(PBS)中制成 1 mg / mL 的粗蛋白溶液，离心
除去不溶物后，清液上 Sephadex G-100柱(10 mm×250
mm)，用 pH 7.5，50 mmol/L 的 PBS 缓冲液平衡洗脱，
分管收集，流速控制在 2 mL / 3 min，每管收集 2 mL，
检测波长为 280 nm.
1.3.2 蛋白质的分子质量测定[5]
收集经Sephadex G-100柱纯化后的苦瓜子蛋白
质样品峰，制成一定浓度，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电
泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子质量.
1.3.3 体外抗氧化实验
1.3.3.1 清除羟自由基的测定[6, 7]
（1）基本原理:参考 Fenton 反应体系模型，利
用 H2O2与 Fe2+ 混合产生·OH，但由于·OH 具有很高
的反应活性，存活时间短，若在体系中加入水杨酸，就
能有效地捕捉·OH，并产生有色产物.该产物在波长
510 nm 处有强吸收，若在反应体系中加入具有清
除·OH 功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，而使有
色产物生成量减少.
（2）测定步骤:采用固定反应时间法，在相同体
积的反应体系(6 mmol/L H2O2 2 mL、6 mmol/L Fe2+ 2
mL、6 mmol/L 水杨酸溶液 2 mL)中加入一系列不同
浓度的提取物，便会与水杨酸竞争·OH，而使有色产物
生成量减少. 在相同体积的反应体系，以蒸馏水为参
比，与试剂空白液比较，在 510 nm处测量各浓度下的
吸光度，便能测定被测物对·OH 的清除作用， 其清除
率计算公式为

1
1
100A A
A
Χ
×清除率=
－
%
式中: A1——空白对照液的吸光度；
AX——加入提取液后的吸光度.
1.3.3.2 总抗氧化能力的测定(TAC)的测定[8]
（1）基本原理:采用铁离子还原法（FRAP法），
原理为 Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)可被样品中还原物
质还原为 Fe2+而呈现出蓝色，并在 593 nm处具有最大
光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱.
（2）测定步骤: 取一定量的样品液，加入 3.6 mL
工作液（由 0.3 mol/L醋酸盐缓冲液 25 mL，10 mmol/L
TPTZ溶液 2.5 mL，20 mmol/L FeCl3溶液 25 mL 组成），
混匀后于 37 ℃反应 10 min，在 593 nm处测定吸光度，
以 1.0 mmol/L FeSO4 为标准，样品抗氧化活性(FRAP
Value)以达到同样吸光度所需的 FeSO4 的量表示，同
时以 L-抗坏血酸 (100 μg/mL) 作阳性对照.
以上实验均作３个平行实验，结果取其平均值.
2 结果与分析
2.1 苦瓜子蛋白的凝胶柱层析分离
经 Sephadex G-100柱纯化后，苦瓜子蛋白粗提物
得到 3 个峰，如图 1 所示；30%硫酸铵沉淀物得到两
个峰，如图 2 所示，记为 І3，П3；60%硫酸铵沉淀物得
到一个峰，如图 3所示，记为 І6；90%硫酸铵沉淀物得
到两个峰，如图 4所示，记为 І9、П9.

图 1 苦瓜子蛋白粗提物的 Sephadex G-100柱纯化
Fig.1 Column chromatography of bitter melon
protein extract crude

图 2 30%硫酸铵沉淀物的 Sephadex G-100柱纯化
Fig. 2 Column chromatography of 30% saturated
ammonium sulphate precipitate

图 3 60%硫酸铵沉淀物的 Sephadex G-100柱纯化
Fig. 3 Column chromatography of 60% saturated
ammonium sulphate precipitate
·8· 天津科技大学学报 第 22 卷 第 2 期




图 4 90%硫酸铵沉淀物的 Sephadex G-100柱纯化
Fig. 4 Column chromatography of 90% saturated
ammonium sulphate precipitate
收集峰 І3、І6、І9 的纯化物浓缩至一定浓度进行下
一步的分子质量检测和活性实验.
2.2 蛋白质分子质量鉴定
SDS-PAGE 电泳检测蛋白质分子质量的结果见
图 5. 由图５可以看出，苦瓜子粗提物中蛋白质比较
多、比较杂，而经过不同饱和度硫酸铵沉淀得到的蛋白
质组分较少. 组分 І3、 І6、 І9均含有分子质量小于 14.4
ku 的蛋白组分，而且组分 І9 组分单一，也为分子质量
小于 14.4 ku 的组分，另外，组分 І3 和 І6还含有分子质
量为 30 ku 的蛋白组分.

1. 粗提物；2. 组分 Ι3；3. 组分 Ι6；
4. 组分 Ι9；5. 标准蛋白
图 5 检测蛋白质的分子质量 SDS-PAGE 电泳
Fig. 5 Detection of molecular weight by SDS-PAGE
electrophoresis

2.3 样品的体外抗氧化活性比较与分析
2.3.1 样品清除羟自由基的能力
样品对羟自由基清除率的影响见图 6. 由图６可
以看出，三种组分的清除羟自由基的能力相差不大，
质量浓度小于 1 mg/mL 时，І3 的抗氧化作用最强，但是
随着质量浓度的增大，І9 的作用效果与 І3持平，І6 的羟
自由基清除能力最低. 三个样品的羟自由基清除能
力均随质量浓度的增大而增大，比相同浓度的抗坏血
酸稍差.


图 6 样品对羟自由基清除率的影响
Fig. 6 Influence on HO· scavenging by samples of
different concentration

2.3.2 样品总抗氧化能力
样品总抗氧化能力的测定结果见图 7. 由图7 可以
看出， 三个样品均具有一定的总抗氧化能力，质量浓
度小于 0.7 mg/mL 时，І9 的总抗氧化能力强于相同浓
度的抗坏血酸，但大于这个浓度时， 随质量浓度升高
而总抗氧化能力增强的趋势减弱，作用能力低于相同
浓度的抗坏血酸，与 І3 和 І6 相比，它的总抗氧化能力
最强，І6 的最弱. 总体上，各个样品的总抗氧化能力随
着浓度的增大而增大，作用能力与相同浓度的抗坏血
酸相比稍差.

图 7 样品对总抗氧化能力的影响
Fig. 7 Influence on total antioxidantive activity by
samples of different concentration
3 结 论
（1）通过 Sephadex G-100 凝胶柱层析后，苦瓜
子蛋白粗提物可得到 3个峰，30%、60%、90%三种饱和
度的硫酸铵沉淀苦瓜子蛋白分别得到 2、1、2个峰，分
别记为峰 І3、П3，І6、І9、П9，峰 І3、І6、І9经 SDS-PAGE电
泳实验表明均含有分子质量小于 14.4 ku 的蛋白组分，
峰 І3 和 І6还含有分子质量为 30 ku 的蛋白组分.
（下转第 15 页）
2007 年 6 月 王丽霞，等：山药胡萝卜复合饮料的研制 ·15·


3 结 论
（1）感官指标和理化指标
色泽：橙黄色.
滋味与气味：酸甜适口，清爽细腻，具有山药与胡
萝卜相协调的独特风味.无异味及其他不良气味.
组织状态：质地均匀，无沉淀，无分层.
饮料 pH：3.58.
可溶性固形物含量≥10%.
（2）CA、Vc、NaCl 对山药都有较好的护色作用，
以复合护色剂 CA 0.05% +Vc 0.05% + NaCl 0.15%对山
药的护色作用为最好.
（3）最佳稳定剂：羧甲基纤维素钠0.075%+黄原
胶0.075%，复合稳定剂用量0.15%.
（4）山药胡萝卜复合饮料的最佳配方：山药汁
55%，胡萝卜汁 10%，蔗糖 8%，柠檬酸 0.12%.
参 考 文 献：
［1］ Zuo Y F，Tang D C. Science of Chinese Materia Medica[M].
Shanghai: Shanghai University of Traditional Chinese
Medicine Press, 2003: 301—303.
［2］ 李时珍. 本草纲目(下册)[M]. 北京:人民卫生出版社,
1982: 1676—1679.
［3］ 舒 媛，刘安军，王丽霞. 山药多糖结合蛋白质对抗氧
化作用的影响[J]. 食品研究与开发, 2006（11）: 39—41
［4］ Zhao GH, Wang Y, Li ZX, et al.The regulation of immune-
function by polysaccharide from Chinese yam [J]. Acta Nutr
Sin, 2002, 24（2）: 187—188.
［5］ 杨金平. 调配型胡萝卜饮料的研制[J]. 食品科技, 2001
（1）: 53.
［6］ Rock C L. Carotenoids and cervical, breast, ovarian, and
colorec2tal cancer. Epidemiology and clinic trials[J]. Pure
App l Chem, 2002, 74: 1451—1459.
［7］ 丁筑红, 谭书明, 丁小燕. 山药菠萝复合饮料研制[J].
食品研究与开发, 2004, 25（5）: 80—82.
［8］ 李小华,阮美娟. 榛子蛋白饮料稳定性研究[J]. 广州食
品工业科技, 2003, 19（3）: 30—31.
［9］ 涂宗财，陈剑兵， 刘成梅，等. 带肉胡萝卜汁的流变特
性研究[J]. 食品科学, 2006, 27（3）: 52—55.
［10］ 李晓莉, 沈金玉,黄家音. 山药多酚氧化酶特性研究[J].
精细化工, 2005, 22（7）: 257—259.
［11］ 邱雁临, 樊黎生, 吴小刚. 山药中多酚氧化酶的特性及
防止褐变的原因[J]. 食品与机械, 1996（6）: 26—30.


（上接第 8 页）

（2）三种饱和度硫酸铵沉淀得到的苦瓜子蛋白
在不同抗氧化体系中的抗氧化能力不同. 组分 І3清除
羟自由基的能力较强；组分 І6 在两种抗氧化体系中的
活性均较强；组分 І9总抗氧化能力较弱，并且作用效
应与浓度成量效关系.
（3）Sephadex G-100凝胶栓层析不能完全将蛋
白分离开来. 如果要得到单一的蛋白组分，可以考虑
通过电泳或结合两种以上的柱层析材料进行不同方
式的纯化得以实现，从而得到更纯的活性蛋白， 并进
行体内活性验证.
（4）苦瓜子中存在着多种活性蛋白组分，以体外
抗氧化活性实验加以筛选， 可获得目标活性蛋白组
分，从而为开发功能食品、 蛋白药物及化妆品奠定
基础.
参 考 文 献：
［1］ 盛清凯，姚惠源．苦瓜中植物胰岛素的分离及其降糖作
用研究[J]. 食品科学， 2005，26（1）：223—225．
［2］ 王 佐，吕运成，唐朝克，等．苦瓜抗兔动脉粥样硬化
实验研究[J]. 中国病理生理杂志，2005，21（3）：514—
518．
［3］ 李 璟.苦瓜蛋白的纯化及其抗肿瘤活性的研究[D]．汕
头：汕头大学医学院，2002．
［4］ Lee Huang S，Huang P L. Inhibition of the integrase of
human immunodeficiency virus typeⅠby anti-HIV plant
proteins MAP30 and GAP30[J]. Proc Natl Acad Sci USA，
1995，92（19）：8818—8822．
［5］ 郭尧君. 蛋白质电泳实验技术[M]. 北京：科学出版社，
1999：2．
［6］ 王建华. 枸杞多糖的抗羟基自由基氧化作用[J]. 食品科
学，2001（1）：11—12．
［7］ 丁利君，周国栋．莲子水溶性糖的提取及其对自由基清
除能力的研究[J]. 食品科学，2002（23）：252—254．
［8］ Guo C，Yang J， Wei J，et al．Antioxidant activities of peel，
pulp and seed fractions of common fruits as determined by
FRAP assay[J]. Nutrition Research，2003（23）：1719—
5213．