全 文 ：48 2015, Vol.36, No.13 食品科学 ※基础研究
柘树果实的抗乳腺癌活性部分的提取、
分离及结构鉴定
曹春廷1,2，孙丛龙2，白卫滨2,*，孙建霞3，李国强2，欧仕益2，杨 勇1,*
（1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；
3.广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510006）
摘  要：为了得到柘树果实中具有抗乳腺癌活性的化合物，以人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人乳腺癌细胞MCF-7
为细胞模型，通过噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法评价柘树果实石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、
以及正丁醇浸膏粗提取物部位的功能，实验发现乙酸乙酯部位具有明显的抑制乳腺癌细胞的活性，其对乳腺癌细胞
MDA-MB-231和MCF-7的IC50分别为：75.4 μg/mL和66.8 μg/mL。采用Sephadex LH-20柱层析和硅胶柱层析对乙酸乙
酯部位进行分离，采用单晶X衍射对得到的化合物进行结构鉴定,得到2 种晶体主成分，分别为4’-O-甲基-吡喃异黄
酮、吡喃异黄酮。采用MTT方法对获得的2 种单体进行抗乳腺癌活性研究，发现吡喃异黄酮对乳腺癌细胞MCF-7的
生长抑制率达到56.7%。结果表明，柘树果实乙酸乙酯部位含有抗乳腺癌成分，且分离得到2 种类异黄酮化合物，
其中吡喃异黄酮体现出一定的抗乳腺癌活性。
关键词：柘树果实；分离提取；抗乳腺癌；结构鉴定
Extraction, Separation and Structure Identification of Anti-breast Cancer Compounds from Cudrania tricuspidata Fruits
CAO Chunting1,2, SUN Conglong2, BAI Weibin2,*, SUN Jianxia3, LI Guoqiang2, OU Shiyi2, YANG Yong1,*
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China;
2. Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China;
3. Faculty of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China)
Abstract: The purpose of the present work was to obtain anti-breast cancer compounds from Cudrania tricuspidata fruits. The
methanol extract of Cudrania tricuspidata fruits was sequentially extracted with petroleum ether (PE), ethyl acetate (AE) and n-butyl
alcohol (n-BuOH) to obtain PE, AE and n-BuOH fractions. MTT assay was used to evaluate the anti-breast cancer activity
of the methanol extract and its three fractions against breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7. The results showed
that the AE fraction had significant inhibitory activity on MDA-MB-231 and MCF-7 cells with half maximal inhibitory
concentrations (IC50) of 75.4 and 66.8 μg/mL, respectively. Then, the AE fraction was further separated by silica gel
column chromatography and Sephadex LH-20 column chromatography assay. The structures of crystals obtained from this
separation process were identified using single-crystal X diffraction. Two major crystal components were identified including
4’-O-methylalpinumisoflavone and alpinumisoflavone. As evaluated by MTT assay, the inhibitory rate of alpinumisoflavone
against MCF-7 cell growth was 56.7%. Therefore, the AE fraction from Cudrania tricuspidata fruits containing isoflavones
and alpinumisoflavones has potent anti-breast cancer activity depending on the presence of alpinumisoflavone.
Key words: Cudrania tricuspidata (Carr.) Bur. fruits; separation and extraction; anti-breast cancer; structural identification
中图分类号：R151 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）13-048-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201513010
收稿日期：2014-12-27
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD36B04）
作者简介：曹春廷（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品营养。E-mail：caochunting1@163.com
*通信作者：白卫滨（1978—），男，副研究员，博士，研究方向为食品营养与毒理安全性评价。E-mail：baiweibin@163.com
杨勇（1969—），男，教授，博士，研究方向为肉品科学与技术。E-mail：yangyong676@163.com
柘树（Cudrania tricuspidata）为桑科（Moraceae）
柘属（Cudrania）植物，又名柘木、柘桑、刺桑、奴柘
等，全世界存在约有6 种柘属植物，主要分布在亚洲和
大洋洲。在我国，柘属植物资源非常丰富，存在5 个品
※基础研究 食品科学 2015, Vol.36, No.13 49
种和2 个变种[1]，主要分布在我国华南、西南、华北（除
内蒙古外）各省。柘树具有很大的药用价值，前人已经
从柘树中分离纯化出多种化合物，如黄酮、异黄酮、氧
杂蒽酮、生物碱、糖类等[1-4]，对其活性进行研究发现具
有抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、保护肝脏[7]、抗炎镇痛[8-9]、保护
肝脏[10]和抗结核[11]等作用，而这些生物活性主要是柘树
中黄酮类化合物的作用[12-14]。Choi等[15]研究证明了柘树中
含有抗乳腺癌的化学成分，从柘树根部分离得到的吉利
柘树素A对MCF-7乳腺癌细胞的增殖有抑制作用，IC50为
20.0 μg/mL。但上述研究主要集中在柘树的干燥根、根
皮树皮以及柘木，而对柘树果实的研究相对较少。研究
表明，柘果也具有很多活性物质[16-19]，如山柰、芦丁、
槲皮素等，但由于柘树树龄超过50 年属于国家一级保护
树种，禁止砍伐，而柘果由于一年一结果，并且同柘树
根、柘树茎皮以及柘树茎研究利用相比，对其功效成分
分析及营养作用知之甚少，对其开发远远不够，因此急
需开展对柘果的研究。
截止目前，尚未发现柘树果实中抗乳腺癌的化学成
分研究报道。因此，本实验对柘树果实的抗乳腺癌化学
成分开展研究，以期为其在抗乳腺癌方面的开发利用提
供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验所用原料柘树新鲜果实，采于山东省烟台市。
人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞 暨南
大学医药中心；MCF-7细胞CCTCC、MDA-MB-231细
胞CCTCC、1640培养基、马血清、胎牛血清、胰蛋白
酶、青霉素、链霉素 美国Gibco公司；噻唑蓝（methyl
thiazolyl tetrazolium，MTT） 美国Amresco公司；水溶
性VE（Trolox） 美国Sigma公司；其他常用试剂均为
国产分析纯。
1.2 仪器与设备
柱层析用硅胶（100～200、200～300 目）、GF254
硅胶薄层预制板 青岛海洋化工厂；Sephadex LH-20丙
基葡聚糖凝胶 GE Healthcare（中国）有限公司；薄
层制备板（10 cm×10 cm） 烟台化学工业研究所；
RE-52旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司；酶标仪
美国Thermo Fisher Scientific公司；超净工作台 苏州净
化设备公司；二氧化碳培养箱 美国Thermo Forma有限
责任公司；倒置显微镜 日本Olympus公司；三用紫外
分析仪 上海骥辉科学分析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 柘树果实粗提物获得
称取新鲜柘树果实270 g，匀浆机打碎后，置于提取
罐中，快速加入1 000 mL甲醇溶剂，常温下静置浸提，
24 h后收集浸提液，按上述操作，重复多次，合并浸提
液。将获得的全部浸提液，1 500 r/min离心4 h，去掉浸
提液中的悬浮物，取上清，在60 ℃条件下进行旋转蒸发，
得浸膏（约200 g）。将得到的总浸膏用适量水混悬于烧
杯中，依次在浸提罐中用纯石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃
取，将石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液，在80 ℃条件
下进行旋转蒸发，得石油醚（petroleum ether，PE）浸膏
31 g，乙酸乙酯（ethyl acetate，AE）浸膏120 g，以及正丁
醇（n-butyl alcohol，n-BuOH）浸膏26 g。
1.3.2 柘树果实抗乳腺癌有效部位确定
称取相同量获得的PE、AE，以及n-BuOH溶于二甲
基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）配制为母液，进
行MTT实验[20]，评价三者的抑癌活性。其具体实验步骤
为：收集生长对数期的细胞，通过计数来调整细胞悬液
浓度，然后在96 孔板上铺板，每孔加入100 μL，使待测
细胞调密度4 000/孔，且96 孔板的边缘孔用无菌磷酸缓
冲盐溶液填充；含体积分数5%的CO2，37 ℃孵育，至
细胞开始在孔底贴壁生长（96 孔平底板），加入质量
浓度梯度（0、10、20、40、80 μg/mL）的粗提物，原
则上细胞贴壁后即可加药；用移液枪吸掉培养基，再加
入含药培养基。每个质量浓度设置5 个复孔，同时设置
空白组（加入培养基、MTT、DMSO）和对照组（加入
细胞、培养液、MTT、DMSO，不加药物）。含体积分
数5%的CO2，37 ℃孵育24 h；每孔加入10 μL MTT溶液
（5 mg/mL），继续培养4 h后，小心吸去孔内混合溶
液，终止培养；然后，每孔加入100 μL DMSO溶液，在
酶联免疫检测仪上振摇5 min，使生成的甲瓒充分溶解，
然后在波长490 nm处测量每个孔的光密度（OD）值。按
下式计算生长抑制率。⭏䮯ᣁࡦ⦷/%=˄1ˉ ˅h100ODˉOD0OD1ˉOD0
式中：OD0为空白组的光密度值；OD1为对照组的光
密度值；OD为实验组的光密度值。
1.3.3 柘树果实有效成分分离、结构鉴定
活性部位经硅胶柱层析。称量200～300 目硅胶，
30 倍于上样量，采用干法上样法，选用石油醚-乙酸乙酯
容积系统，按照比例（100∶3～0∶100）进行梯度洗脱，
每50 mL收集一个馏分。在浓硫酸香草醛作为显色剂条件
下，用薄层层析分析合并馏分，再用Sephadex LH-20柱
色谱进行分离纯化，用的凝胶柱为25 mm×1 200 mm大
小，流动相为氯仿和甲醇，其体积比为1∶1，其余步骤与
硅胶柱层析方法一致。分离得到晶体化合物采用单晶衍
射进行结构鉴定。
1.3.4 类异黄酮物质对乳腺癌细胞的抑制作用
两种类异黄酮化合物用DMSO溶解，母液浓度为
50 mmol/L。MTT实验步骤及结果处理同1.3.2节。
50 2015, Vol.36, No.13 食品科学 ※基础研究
2 结果与分析
2.1 柘树果实对乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制效果
10 20
20
40
60
80
0
40 80
生
长
抑
制
率
/%
质量浓度/˄µg/mL˅PEAEn-BuOH
图 1 3 种粗提物对MDA-MB-231细胞生长抑制率比较
Fig.1 Inhibitory rates of three fractions against the growth of
MDA-MB-231 cells
如图1所示，与PE和n-BuOH部位相比较，AE部位抑
制效果更明显，IC50为75.4 μg/mL，与空白组比较，有显
著性差异（P＜0.05），表明柘树果实AE部分是含有抗乳
腺癌成分主要活性部位。
2.2 柘树果实对乳腺癌细胞MCF-7抑制效果
10 20
20
40
60
80
0
40 80
生
长
抑
制
率
/%
质量浓度/˄µg/mL˅PEAEn-BuOH
图 2 3 种粗提物对MCF-7细胞增殖抑制率比较
Fig.2 Inhibitory rates of three fractions against the growth of MCF-7 cells
如图2所示，与PE和n-BuOH部位相比较，AE部位
表现出了明显的抑癌活性，IC50为66.8 μg/mL，与空白
组比较，有显著性差异（P＜0.05），表明柘树果实AE
部分是含有抗乳腺癌成分主要活性部位。与乳腺癌细胞
MDA-MB-231相比，柘树果实对乳腺癌细胞MCF-7作用
更强。
2.3 柘树果实分离纯化化合物晶体结构
硅胶柱层析结束，选择浓硫酸香草醛作为显色剂，
经薄层层析分析合并，得到多个总馏分。再将总馏分经
过Sephadex LH-20柱层析纯化，运用单晶衍射的方法，
对得到量大的2 个晶体化合物：4’-O-甲基-吡喃异黄酮
（45 mg）、吡喃异黄酮（35 mg）并进行结构鉴定。
化合物4’-O-甲基-吡喃异黄酮：淡黄色针晶，化合物
吡喃异黄酮：黄色方晶。2 个晶体的化学结构见图3，数
据见表1。
OO
O
OH Oa
OO
OH
b OH O
图 3 4’-O-甲基-吡喃异黄酮（a）和吡喃异黄酮（b）的化学结构
Fig.3 Chemical structures of 4’-O-methylalpinumfisoflavone (a) and
alpinumisoflavone (b)
表 1 4’-O-甲基-吡喃异黄酮和吡喃异黄酮晶体数据
Table 1 Crystal structural data of 4’-O-methylalpinumfisoflavone and
alpinumisoflavone
晶体数据 4’-O-甲基-吡喃异黄酮 吡喃异黄酮
分子式 C21H18O5 C20H16O5
相对分子质量 350.371 336.344
温度/K 293（2） 293（2）
晶体系 单斜 单斜
空间群 P21/c P21/c
a/Å
b/Å
16.635 0（6）
7.148 33（14）
13.721 5（7）
5.975 9（2）
c/Å 30.014 1（8） 20.346 7（12）
α/（°） 90.00 90.00
β/（°） 102.334（3） 99.477（5）
γ/（°） 90.00 90.00
体积/Å3 3 486.68（17） 1 645.64（14）
单位晶胞中所含分子个数Z 14 7
单胞密度 1.255 1.329
衍射线波长 0.713 0.756
单胞中电子的数目 1 386.0 693.0
2θ数据收集范围/（°） 6.02～121.52 10.08～121.62
衍射指标（h,k,l）范围 －18≤h≤16，－7≤k≤5，－32≤l ≤33
－15≤h≤15，－6≤k≤5，
－23≤l≤23
衍射点收集 13 804 6 369
独立衍射点 5 238[R（int）= 0.027 5] 2 484[R（int）= 0.024 0]
数据限制性参数 5 238/0/477 2 484/0/105
基于F2的GOOF值 1.051 3.054
对于可观测衍射点的残差因子
R值[I≥2σ（I）] R1 = 0.044 1，wR2 = 0.106 1 R1 = 0.129 8，wR2 = 0.380 8
对于全部衍射点的
残差因子R值 R1 = 0.053 2，wR2 = 0.115 5 R1 = 0.143 6，wR2 = 0.399 9
精修后残余电子密度的峰、谷
值及e Å－3 0.24/－0.27 0.72/－0.82
2.4 类异黄酮物质对乳腺癌细胞的抑制作用
图1、2表明，柘树果实对乳腺癌细胞MCF-7抑制作
用更明显，因此选择MCF-7细胞作为研究对象，进一步
研究获得的两种类异黄酮晶体4’-O-甲基-吡喃异黄酮和吡
喃异黄酮对乳腺癌细胞的生长起抑制作用。MTT实验所
用的类异黄酮物质的剂量为0、10、20、40、80 μmol/L，
结果如表2。在80 μmol/L浓度作用下，4’-O-甲基-吡喃异
黄酮和吡喃异黄酮两种类异黄酮物质对MCF-7细胞生长
※基础研究 食品科学 2015, Vol.36, No.13 51
抑制率分别为12.9%和56.7%，吡喃异黄酮表现出一定的
抗乳腺癌活性。
表 2 4’-O-甲基-吡喃异黄酮对MCF-7细胞生长抑制率
Table 2 Inhibitory rates of 4’-O-methylalpinumisoflavone against the
growth of MCF-7 cells
组别 次数
OD490 nm 生长抑制率/%
4’-O-甲基-吡喃
异黄酮 吡喃异黄酮
4’-O-甲基-吡喃异
黄酮
吡喃异
黄酮
对照组（0 μmol/L） 5 0.504±0.017 0.504±0.017
10 μmol/L 5 0.503±0.012* 0.495±0.015* 0.2 1.8
20 μmol/L 5 0.497±0.049* 0.493±0.015* 1.4 2.2
40 μmol/L 5 0.469±0.033# 0.318±0.026# 6.9 36.8
80 μmol/L 5 0.439±0.059# 0.238±0.057# 12.9 56.7
注：*. 与对照组（0 μmol/L）相比，差异不显著（P ＞ 0.05）；#. 与对照组
（0 μmol/L）相比，差异显著（P ＜ 0.05）。
3 讨 论
本实验对柘果在乳腺癌方面作用进行探讨，发现柘
树果实具有抗乳腺癌作用，对不同株系的乳腺癌细胞作
用效果不同，其MDA-MB-231和MCF-7的IC50分别为：
75.4 μg/mL和66.8 μg/mL，且乙酸乙酯部位是最有效部
位。并进一步分离纯化得到2 种类异黄酮类晶体化合物
吡喃异黄酮和4’-O-甲基-吡喃异黄酮。研究吡喃异黄酮和
4’-O-甲基-吡喃异黄酮对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用，
发现吡喃异黄酮对乳腺癌细胞MCF-7具有一定的抗乳腺
癌活性。有研究发现吡喃异黄酮和4’-O-甲基-吡喃异黄酮
具有氧化酶抑制活性，Han Xianghua等[16]研究发现柘果
中的4’-O-甲基-吡喃异黄酮、吡喃异黄酮对鼠大脑单胺氧
化酶（monoamine oxidase，MAO）抑制作用，对MAO的
IC50值分别为23.9 μmol/L和25.8 μmol/L。证明本实验分离
出的两种类异黄酮物质具有一定的生物活性。
异黄酮类物质具有预防乳腺癌、前列腺癌、心血管疾
病和骨质疏松等疾病[21]，有很强的生物效应。已有的很多
科学研究表明异黄酮类化合物具有抗肿瘤的作用[22-24]。目
前学术界公认的异黄酮抗肿瘤作用机制有：1）通过直接
清除自由基或提高抗氧化物酶的活性来清除自由基，进
而诱导肿瘤细胞凋亡；2）通过影响致癌物质的代谢酶的
活性等来抑制肿瘤的发生；3）异黄酮类化合物能够显著
地提高肿瘤细胞对某些化疗药物的敏感性[25]。
吡喃异黄酮和4’-O-甲基-吡喃异黄酮比传统异黄酮母
核结构多一个联环，并且二者结构上只存在一个取代基
的差异，但在抗乳腺癌活性研究中表现出不同的抑制效
果，证明结构对功能的影响。下一步拟研究吡喃异黄酮
和4’-O-甲基-吡喃异黄酮结构、生物活性及其作用机制，
进一步为柘树果实营养功能的开发提供科学依据。
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